La régulation à la hausse du microARN-410 ou la régulation à la baisse du Wnt-11 augmente les ostéoblastes et réduit les ostéoclastes pour soulager l'ostéonécrose de la tête fémorale

Introduction

L'ostéonécrose de la tête fémorale (ONFH), l'une des maladies les plus courantes affectant les articulations de la hanche, entraîne des douleurs sévères ou une invalidité articulaire et survient principalement chez les personnes d'âge moyen [1]. La thérapie de l'ONFH adulte, qui compte 8,12 millions de patients en Chine, reste un défi pour les chirurgiens [2]. De nombreux facteurs de risque sont associés à la survenue de l'ONFH, tels que l'hyperlipidémie, les maladies auto-immunes, les troubles de la coagulation, l'alcoolisme et l'hypercorticisme [3]. Le traitement chirurgical comprend une décompression centrale avec ou sans adjuvant, par exemple, la moelle osseuse autologue, tandis que la prothèse totale de hanche (PTH) retient pour le patient sénile ou une ostéonécrose avancée qui n'est pas traitée par rétention articulaire [4]. Cependant, l'ONFH a un pronostic insatisfaisant chez les patients nécessitant fréquemment une PTH [5]. Par conséquent, il est urgent d'explorer une cible thérapeutique précise pour le traitement de l'ONFH.

Les microARN (miARN) sont des régulateurs majeurs de la fonction cellulaire et de l'expression des gènes, qui exercent une fonction énorme sur l'homéostasie endothéliale et pourraient constituer un nouveau traitement [6]. Une étude a rapporté que miR-410 s'est révélé anormalement exprimé dans plusieurs types de cancer pernicieux humains et peut être utilisé comme inhibiteur de tumeur dans le cancer de l'endomètre, du poumon, le myélome et le cancer du sein [7,8,9,10]. Une autre étude a révélé qu'il existe un effet neuroprotecteur de miR-410 sur le modèle cellulaire de la maladie de Parkinson induit par la 6-hydroxydopamine en supprimant la voie de signalisation PTEN/AKT/mTOR [11]. De plus, il a été révélé que miR-410 module les comportements biologiques malins des enfants atteints de leucémie lymphoblastique aiguë en ciblant les voies de signalisation FKBP5 et AKT [12]. Un article a également démontré l'effet inhibiteur de miR-410 ciblant l'angiotensine II de type 1 dans le cancer du pancréas [13]. La protéine Wnt est une sorte de lipoglycoprotéines sécrétées riches en cystéine, qui exerce une fonction énorme sur le développement et la maladie [14]. Wnt-11 appartient à la voie de signalisation Wnt et est un régulateur positif qui joue un rôle central dans la cancérogenèse [15]. Une étude a rapporté la signification clinique de l'expression de l'antigène du carcinome épidermoïde et de Wnt11 dans le carcinome cervical [16]. De plus, il a été présenté que les signaux synergiques TGF-β1 et Wnt11 pilotent l'expression de la sm-α-actine dans le muscle lisse par la signalisation Rho kinase-actine-MRTF-A [17]. Sur la base de la littérature ci-dessus, le but de la présente étude était d'étudier le rôle de miR-410 régulant Wnt-11 sur la prévention de l'ONFH, et une hypothèse est proposée que miR-410 ciblant Wnt-11 pourrait moduler l'ostéogène et l'ostéoclastique mécanisme de prévention de l'ONFH.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

L'étude a été menée avec l'approbation du comité d'examen institutionnel de l'hôpital Shijitan de Pékin, de l'université médicale de la capitale, et a suivi les principes de la Déclaration d'Helsinki. Les participants ont donné leur consentement éclairé écrit pour participer à cette étude. Toutes les expérimentations animales étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été autorisé par le Comité d'éthique des expérimentations animales de l'hôpital Shijitan de Pékin, Université de médecine de la capitale.

Sujets à étudier

Au total, 30 patients traités dans le service d'orthopédie de l'hôpital Shijitan de Pékin, Université de médecine de la capitale, de janvier 2017 à septembre 2018 ont été sélectionnés. Parmi ces patients, 15 patients atteints d'ONFH ont été traités en chirurgie PTH, l'âge médian des patients était de 50,6 ± 4,3 ans, et la masse corporelle était de 57,0 ± 5,6 kg avec 7 hommes et 8 femmes (groupe ONFH). 15 autres patients présentant une fracture du col du fémur ont été traités par chirurgie PTH, l'âge médian était de 59,6 ± 3,3 ans et la masse corporelle était de 50,0 ± 5,6 kg avec 9 hommes et 6 femmes (groupe témoin). Il n'y avait pas de différence marquée en termes de sexe, d'âge et de poids entre les deux groupes (P> 0,05), ce qui était comparable. Les tissus de la zone nécrotique sous-chondrale ont été prélevés par ciselage le long de la ligne longitudinale de la tête fémorale et conservés à - 80°C. Chaque groupe a été examiné par pathologie et biologie moléculaire, respectivement.

Coloration à l'hématoxyline-éosine (HE)

Les échantillons ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % et décalcifiés par de l'acide éthylène diamine tétraacétique à 10 %, et la solution de décalcification a été remplacée une fois par semaine. La couleur de l'échantillon d'os a été observée et le degré de décalcification a été mesuré. Après décalcification complète, l'échantillon a été enrobé de paraffine et tranché sur une épaisseur de 4µm. Les sections cuites ont été immergées dans le xylène I et le xylène II pendant 10 min à tour de rôle, et les sections déparaffinées ont été immergées dans l'alcool absolu I, l'alcool absolu II, l'alcool à 95 %, l'alcool à 80 % et l'alcool à 70 % pendant 2 min, respectivement. Ensuite, les coupes ont été colorées à l'hématoxyline pendant 3 min et différenciées par de l'alcool chlorhydrique à 1 % pendant 2 min. Ensuite, les coupes ont été trempées dans 50 %, 70 % et 80 % d'alcool pendant 2 min à tour de rôle et immergées dans l'éosine pendant 5 min. Ensuite, les coupes ont été immergées dans de l'alcool à 95 %, de l'alcool absolu I et de l'alcool absolu II pendant 3 min, puis immergées dans du xylène I et du xylène II pendant 5 min à tour de rôle. Enfin, les coupes ont été scellées avec de la gomme neutre et examinées au microscope.

Coloration à la phosphatase alcaline (ALP)

Une section a été sélectionnée dans chaque échantillon et cuite à 60 °C pendant 60 min. Les sections de paraffine ont été déparaffinées par du xylène I et du xylène II pendant 15 min, respectivement, et plongées dans l'alcool absolu I, l'alcool absolu II, l'éthanol à 95 %, l'éthanol à 90 %, l'éthanol à 80 % et l'éthanol à 75 % pendant 5 min à tour de rôle, et nettoyé avec de l'eau distillée trois fois 2 min pendant trois fois. Les coupes ont été déposées avec du liquide de substrat préparé dans un kit de teinture ALP (Institut de bioingénierie NanJing JianCheng, Nanjing, Chine), en recouvrant complètement le liquide de substrat sur l'échantillon, puis éclos à 37 °C en évitant la lumière pendant 15 min. La solution de colorant redondante a été jetée et les coupes ont été immédiatement déposées avec l'agent chromogène A pendant 5 min et nettoyées avec de l'eau distillée trois fois pendant 30 s. Ensuite, les sections ont été colorées avec l'agent chromogène B pendant 30 s et contre-colorées avec le réactif pendant 30 s. La photographie a été obtenue sous un microscope optique 200 ×, et le nombre d'ostéoblastes a été calculé via un système d'analyse d'image pour microscope (Image-Proplus 6.0).

Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)

Une section a été sélectionnée pour chaque échantillon et torréfiée à 60 °C pendant 60 min. Les sections de paraffine ont été déparaffinées par du xylène I et du xylène II pendant 15 min et plongées dans l'alcool absolu I, l'alcool absolu II, l'éthanol à 95 %, l'éthanol à 90 %, l'éthanol à 80 % et l'éthanol à 75 % pendant 5 min à tour de rôle. Les sections ont été fixées avec une solution de fixation préparée pendant 30 s. Les sections ont été insérées dans le support de teinture et placées dans une boîte noire contenant une solution de coloration TRAP fraîchement préparée (Sigma, St. Louis, MO, USA), la solution de coloration doit être complètement recouverte des sections, puis les sections ont été hachurées dans Pot de bain-marie à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, les coupes ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline pendant 2 min et séchées. Parce que la coloration TRAP se dégraderait avec le temps, les sections seraient directement examinées par le microscope sans scellement. L'image a été obtenue sous un microscope optique 200 ×, et le nombre d'ostéoclastes a été compté par un système d'analyse d'image pour microscope (Image-Proplus 6.0).

Coloration immunohistochimique

Après décalcification, les coupes ont été noyées dans de la paraffine et tranchées à une épaisseur de 4µm. Les coupes ont été déparaffinées par du xylène conventionnel, déshydratées avec de l'alcool à gradient, hachurées avec 3% de H₂ O₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA) à 7°C pendant 30 min, puis bouilli avec du tampon acide citrique 0,01 M à 95 °C pendant 20 min. Les coupes ont été bloquées avec du fluide de travail de sérum de mouton normal pendant 10 min, mélangé avec l'anticorps primaire Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) à 4°C pendant la nuit, un anticorps secondaire (anticorps secondaire prêt à l'emploi (PV-6000), ZSGB-Bio, Pékin, Chine) pendant 20 min, et le fluide de travail streptomyces ovalbumine marqué à la peroxydase de raifort (SA/HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Pékin, Chine) pendant 2 min. Les coupes ont été développées par de la diaminobenzidine (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA), contre-colorées à l'hématoxyline (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine), puis scellées. Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) a remplacé l'anticorps primaire en tant que contrôle négatif (NC). Au microscope optique, les cellules positives étaient localisées avec des réactifs bruns dans le cytoplasme, la forte expression positive était jaune brunâtre foncé, la faible expression positive était jaune brun clair et l'expression négative n'avait pas de coloration. La coloration des cellules a été observée au microscope optique, cinq champs de forte puissance (400 ×) ont été observés pour chaque section et 100 cellules ont été comptées par champ. La valeur moyenne était le résultat de l'observation de chaque section. En fonction de la proportion et de la répartition des cellules positives, il a été déterminé comme suit :négatif (-), coloration unicellulaire, les cellules positives à moins de 5 %; coloration faiblement positive (+), dispersée ou de petite masse cellulaire, le nombre de cellules positives était de 5 à 24 % ; coloration positive (++), en flocons ou en grappes, le nombre de cellules positives était de 25 à 50 % ; et fortement positive (+++), coloration cellulaire diffuse, le nombre de cellules positives était supérieur à 50 %. Les résultats de l'immunohistochimie ont été évalués avec un score en double aveugle par deux personnes indépendamment.

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

L'ARN total a été extrait des échantillons de tissus par le kit d'extraction Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Californie, États-Unis). La concentration et la pureté de l'ARN ont été déterminées. Les amorces ont été conçues et composées par Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japon) (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S1). Ensuite, l'ARN a été rétro-transcrit en ADNc en utilisant le kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, Chine). La solution réactionnelle a été utilisée pour la PCR quantitative de fluorescence, en se référant aux instructions de SYBR® Premix Ex Taq ^TM Kit II (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, Chine). La PCR quantitative de fluorescence a été mise en œuvre dans le système ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Massachusetts, USA). U6 était le contrôle de charge de miR-410, et la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) était les paramètres internes de Wnt-11, ALP, protéine gamma-carboxyglutamate osseuse (BGLAP), Collα1, phosphatase acide tartrate-résistante 5 (ACP5), cathepsine K (CTSK), métallopeptidase matricielle (MMP)9, Bcl-2 et Bax. Les niveaux transcriptionnels relatifs des gènes cibles ont été calculés par 2 ^−△△Ct méthode [18].

Analyse Western Blot

La protéine totale a été extraite des tissus de la tête fémorale. La concentration en protéines de chaque échantillon a été mesurée et le chargement de l'échantillon a été ajusté par l'eau déminéralisée pour garantir que la taille était cohérente. Un gel de séparation de dodécyl sulfate de sodium et un gel espaceur (10 %) ont été préparés. Après bain de glace et centrifugation, l'échantillon a été séparé par électrophorèse avec la même quantité de microéchantillonneur, puis la protéine sur le gel a été transférée sur la membrane de nitrocellulose. La membrane de nitrocellulose a été scellée avec 5% de lait écrémé en poudre à 4°C pendant la nuit et mélangée avec l'anticorps primaire Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ALP (1:100, Sigma, St Louis, MO, USA), BGLAP, Collα1 et MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA), et Bcl-2 et Bax (1:500, Proteintech, Chicago, USA) et éclos pendant la nuit. Et l'échantillon a été déposé avec un anticorps secondaire IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, Chine) marqué par HRP et incubé pendant 1 h. La membrane a été immergée dans une solution de réaction de chimiluminescence améliorée (Pierce, Rockford, IL, USA) pendant 1 min. Après avoir retiré le liquide, l'échantillon a été recouvert par le film de conservation des aliments. Après avoir développé et fixé, le résultat a été observé. GAPDH était le paramètre interne, et l'image d'empreinte de protéine a été analysée par le logiciel ImageJ2x.

Mise en place des modèles de rats de l'ONFH

Quatre-vingt-dix rats mâles Sprague-Dawley (SD) (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, Chine), pesant entre 300 g et 350 g, ont été sélectionnés. L'environnement était réglé à 18-25 °C et l'humidité était de 45-70%. Les rats ont été élevés dans des cages séparées en évitant le bruit. Après 1 semaine d'alimentation adaptative, des expériences de suivi ont été réalisées.

Le modèle a été établi par l'ONFH traumatique. Les méthodes de modélisation étaient les suivantes :des rats SD ont été anesthésiés avec une cavité abdominale, suivis d'une épilation et d'une préparation de la peau. La peau du rat a été coupée, les tissus ont été séparés et le ligament rond a été coupé après exposition de la tête fémorale. Le périoste du col fémoral des rats a été gratté et l'approvisionnement en sang autour de la tête fémorale a été détruit. La capsule articulaire, le muscle et la peau ont été suturés couche par couche et stérilisés à nouveau.

Regroupement d'animaux

Soixante-dix rats SD modélisés avec succès ont été répartis en sept groupes, avec 10 rats dans chaque groupe :groupe ONFH; groupe agomir-NC (0,5 µmL d'agoniste miR-410 NC (200 µnM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, Chine) a été injecté autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après l'établissement réussi de l'ONFH), groupe agomir-miR-410 (0,5 mL d'agoniste miR-410 (200  nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, Chine) a été injecté autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après l'établissement réussi de l'ONFH), groupe siRNA-NC (NC de 0,4 mL silencieux Wnt -11 vecteur (contenant 1 × 10 ⁹ une unité de formation de plaque (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Chine) a été injectée autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après l'établissement réussi de l'ONFH), groupe Wnt-11-siRNA (0,4  mL de vecteur Wnt-11 silencieux (contenant 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Chine) a été injecté autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après la mise en place réussie de l'ONFH), agomir-miR-410 + groupe surexprimé (OE)-NC (0,5 mL d'agoniste miR-410 et NC de 0,4 mL de vecteur Wnt-11 régulé à la hausse (contenant 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Chine) a été injecté autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après l'établissement réussi de l'ONFH), et le groupe agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5  mL d'agoniste miR-410 et 0,4 mL de vecteur Wnt-11 régulé à la hausse (contenant 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Chine) a été injecté autour de l'articulation de la hanche 1 semaine après l'établissement réussi de l'ONFH). Pendant ce temps, le groupe normal (seule une solution saline a été injectée dans la cavité abdominale, 10 rats) a été défini comme contrôle. Après 4 semaines d'ONFH, une micro-CT, une analyse ostéonométrique, une observation aux rayons X, une densitométrie osseuse et une détermination du taux de calcium et de phosphore sériques ont été effectuées.

Test Micro-CT et analyse ostéonométrique

La tête fémorale droite des rats a été placée sur la machine de micro-CT (General Electric (GE) Company, Massachusetts, USA), et le fantôme standard équipé de manière aléatoire a également été scanné. Les paramètres de balayage sont les suivants :résolution 27 μm × 27 μm × 27 μm, courant de balayage 450 mA, tension de balayage 80 kV et temps de balayage unique 88 min. La microstructure de la tête fémorale du rat a été observée en détail. Après étalonnage à la lumière de la spécification, trois régions cuboïdes d'intérêt (ROI) ont été sélectionnées au hasard parmi différents groupes de rats pour la reconstruction (0,5 × 0,5 × 0,5 cm ³ ). Le traitement des images a été réalisé avec le logiciel machine GE Microview, et le ROI a été reconstruit et analysé par métrologie osseuse. Les paramètres de densité minérale osseuse (DMO) et de fraction volumique osseuse (BV/TV) ont été sélectionnés.

Observation aux rayons X, détermination de la DMO et détermination des niveaux de calcium et de phosphore dans le sérum

Quatre semaines après l'opération, les rats de chaque groupe ont reçu une injection par l'abdomen d'hydrate de chloral à 10 %. Après anesthésie, les rats ont été placés en décubitus dorsal, et les membres ont été fixés puis examinés par radiographie. Le changement de la forme et de la densité de la tête fémorale a été observé. La densité osseuse de la colonne vertébrale fémorale gauche, de la tête fémorale et de la colonne vertébrale a été testée par un instrument de mesure de la densité osseuse à rayons X à double énergie. A 4 semaines après l'opération, les rats de chaque groupe ont été à jeun pendant 12h avant le prélèvement sanguin. Les échantillons de sang (5 mL) ont été prélevés par le cœur le matin et placés dans un tube de coagulation sous vide. Le sérum a été séparé par centrifugation à 3000 r/min pendant 15 min. Les taux sériques de calcium et de phosphore ont été mesurés par un analyseur biochimique automatique.

Observation au microscope électronique

La masse de tissu osseux de rat a été fixée avec 3,5% de glutaraldéhyde, décalcifiée avec une solution d'acide chlorhydrique à 5% et 1% d'acide osmique, puis déshydratée avec un gradient d'acétone, doublement teintée avec de l'acétate d'uranium et de l'acide citrique, et enfin, enrobée d'Epon-61. Après la préparation de la section semi-mince, la section ultra-mince a été observée au microscope électronique à transmission.

Test de dUTP-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) à médiation TdT

Les sections incluses en paraffine ont été prétraitées avec un déparaffinage et une déshydratation conventionnels. Les sections ont été hachurées avec de la pepsine (solution d'acide chlorhydrique à 0,25 ~ 0,5%) pendant 25 min, puis égouttées avec 50 L de solution mélangée de réaction TUNEL et écloses dans une boîte humide pendant 60 min, et abandonnées avec 50  μL d'agent-peroxydase et éclos dans un boîte humide pendant 30 min. Les coupes ont été développées avec le réactif DAB, si les coupes étaient colorées et ont été observées au microscope. Les coupes ont été additionnées d'eau pour arrêter le développement et colorées à l'hématoxyline pendant 2 min. Ensuite, les coupes ont été plongées dans de l'éthanol à 95 % I–II, de l'éthanol absolu I–II pendant 3–5 min, respectivement, du xylène I–II pendant 3–5 min et scellées avec de la gomme neutre. Les résultats ont été analysés au microscope optique.

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Après anesthésie des rats, le sang de l'artère de la cuisse a été prélevé et les échantillons de sérum ont été recueillis par centrifugation après 1 h de repos. Sur la base de la spécification du kit ELISA (Shanghai enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine), sept puits standard ont été ajoutés avec divers standards de concentration (100 μL) à tour de rôle, les puits blancs ont été ajoutés avec 100 μL solution de dilution standard, et les puits restants ont été ajoutés avec 100 μL d'échantillon à tester. La plaque d'enzyme a été recouverte d'un film et placée pendant 1 h, puis le liquide a été jeté. Une solution (100 μL) a été ajoutée à tous les puits, et la plaque d'enzyme a été recouverte du film pendant 1 h. Après lavage, 100 L de solution B ont été ajoutés dans tous les puits et la plaque d'enzyme a été recouverte du film pendant 30 min. Ensuite, une solution de substrat de tétraméthylbenzidine (90 L) a été ajoutée, la plaque d'enzyme a été recouverte du film pendant 10 à 20 min et 50 L de solution de terminaison ont été ajoutés à tous les puits. La valeur de la densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée par un lecteur de microplaque et la concentration réelle de l'échantillon a été énumérée.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Les sites de liaison et la relation cible de miR-410 et de la région non traduite (UTR) de Wnt-11 3' ont été prévus à l'aide d'un logiciel de bioinformatique http://www.targetscan.org. La séquence de la région du promoteur Wnt-11 3'UTR contenant le site de liaison miR-410 a été composée et insérée dans pMIR-REPORT ^TM Plasmide vecteur luciférase (Ambion, Company, Austin, TX, USA) pour la formulation du plasmide de type sauvage Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-WT). Et le plasmide mutant Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-MUT) a été construit sur la base du plasmide et du site de liaison de la mutation. Suivez les étapes du kit d'extraction de plasmide acheté (Promega, Madison, Wisconsin, États-Unis) et les cellules logarithmiques ont été ensemencées dans les plaques à 96 puits. Lorsque la confluence cellulaire était d'environ 70 %, la Lipofectamine 2000 a été adoptée pour la transfection. Wnt-11-WT et Wnt-11-MUT ont été mélangés avec des imitateurs NC et miR-410 (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, Chine), respectivement, puis co-transfectés dans des cellules 293 T. Les cellules ont été rassemblées et lysées après 48h de transfection, et l'activité luciférase a été testée par un kit de détection de luciférase (BioVision, San Francisco, CA, USA) et un luminomètre Glomax 20/20 (Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Analyse statistique

Toutes les données ont été traitées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure ont été transmises par moyenne ± écart type. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été réalisée pour des comparaisons multigroupes et le t test pour les comparaisons à deux groupes et la différence la moins significative de Fisher t test (LSD-t) a été utilisé après ANOVA. P une valeur <0,05 était indicative d'une différence statistiquement significative.

Résultats

Modifications pathologiques des tissus ONFH des échantillons cliniques

La coloration HE a été adoptée pour observer les modifications pathologiques de la tête fémorale dans le groupe fracture du col du fémur (groupe témoin) et le groupe ONFH ; les résultats ont rapporté que dans le groupe témoin, la densité trabéculaire osseuse était bien répartie et la structure était l'intégrité. Dans le groupe ONFH, il y avait de nombreuses lacunes osseuses vides dans le cervelet osseux, avec une diminution des cellules osseuses et des trabécules osseuses continuellement modifiées. De plus, il y avait de nombreuses autres hyperplasies tissulaires autour du cervelet osseux (Fig. 1a).

Modifications pathologiques des tissus ONFH des échantillons cliniques. un Résultats de la coloration HE dans chaque groupe (200 ×). b Résultats de la coloration TRAP et du nombre de cellules TRAP-positives dans chaque groupe (200 ×). c Résultats de la coloration ALP et du nombre de cellules positives ALP dans chaque groupe (400 ×). *P <0,05 vs le groupe témoin

La coloration TRAP a révélé que TRAP était principalement trouvé dans les ostéoclastes et souvent utilisé pour identifier les ostéoclastes matures dans l'amarante. Par rapport au groupe témoin, le nombre d'ostéoclastes TRAP-positifs dans le groupe ONFH a augmenté, la morphologie des ostéoclastes était diversifiée et les cellules étaient grandes avec un aspect multinucléaire. Des défauts osseux évidents ont été observés dans le cervelet osseux adjacent aux ostéoclastes, qui ont montré une résorption osseuse (Fig. 1b).

Le résultat de la coloration ALP a montré que l'ALP était une enzyme marqueur de la différenciation et de la maturation des ostéoblastes, qui participait à la régulation de la calcification de la maturation de la matrice osseuse. Par conséquent, l'expression de l'ALP était couramment utilisée pour identifier les ostéoblastes. Des particules brunes ou de café pourraient être observées dans le cytoplasme des ostéoblastes matures. Par rapport au groupe témoin, le nombre d'ostéoblastes ALP positifs a diminué dans le groupe ONFH (Fig. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP et Collα1 dégradés et Wnt-11, ACP5, CTSK et MMP9 améliorés dans les tissus ONFH des échantillons cliniques

L'analyse par transfert Western et la RT-qPCR ont démontré que l'expression de miR-410 dans le groupe ONFH diminuait par rapport à celle du groupe témoin, tandis que l'expression Wnt-11 augmentait; l'expression des facteurs liés aux ostéoblastes ALP, BGLAP et Collα1 dégradée ; et l'expression des facteurs liés aux ostéoclastes ACP5, CTSK et MMP9 a augmenté (tous P <0,05) (Fig. 2a–c).

MiR-410, ALP, BGLAP et Collα1 ont diminué et Wnt-11, ACP5, CTSK et MMP9 ont augmenté dans les tissus ONFH des échantillons cliniques. un Détection de miR-410, Wnt-11 et des gènes liés aux ostéoblastes et aux ostéoclastes par RT-qPCR. b Wnt-11 et les protéines liées aux ostéoblastes et aux ostéoclastes détectées par analyse par transfert Western. c Bandes protéiques de Wnt-11 et protéines liées aux ostéoblastes et aux ostéoclastes. d Expression de Wnt11 (400 ×) et comparaison du taux de protéine positive Wnt11 détectée par coloration immunohistochimique. *P <0,05 vs le groupe témoin

L'expression de Wnt-11 a été testée par immunohistochimie et les résultats ont montré que la protéine Wnt-11 était principalement exprimée dans le cytoplasme et que l'expression positive était essentiellement jaune brunâtre ou brune. Contrairement au groupe témoin, le taux positif d'expression de la protéine Wnt-11 dans le groupe ONFH était accru (P <0,05) (Fig. 2d).

Le miR-410 régulé à la hausse et le Wnt-11 régulé à la baisse élèvent la DMO et la BV/TV des rats

La micro-CT a suggéré que dans le groupe normal, l'apparence de la tête fémorale était ronde, l'épaisseur du col était uniforme et la structure des travées osseuses était continue et uniformément répartie. La tête fémorale des rats du groupe ONFH, groupe agomir-NC, groupe siRNA-NC et groupe agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 s'est progressivement affaissée, la zone de résorption osseuse est apparue progressivement, le col des fémurs s'est aminci , et les travées osseuses ont été brisées et la continuité détruite. Dans le groupe agomir-miR-410, le groupe Wnt-11-siRNA et le groupe agomir-miR-410 + OE-NC, l'apparence des rats est restée intacte, aucun collapsus ne s'est produit, aucune zone de résorption osseuse évidente n'est apparue, les travées osseuses étaient disposés normalement, et la structure était complète (Fig. 3a).

Le miR-410 fortement exprimé et le Wnt-11 faiblement exprimé augmentent la DMO et la BV/TV des rats. un Résultats micro-CT de rats dans chaque groupe. b Résultats de l'analyse BMD. c Résultats de l'analyse BV/TV. *P <0,05 vs le groupe normal. ⁺ P <0,05 vs le groupe agomir-NC. ^# P <0,05 vs le groupe siRNA-NC. ^& P <0,05 vs le groupe agomir-miR-410 + OE-NC

Les résultats de la métrologie osseuse ont rapporté que contrairement au groupe normal, la DMO et la BV/TV dans le groupe ONFH étaient déprimées (les deux P <0,05). En ce qui concerne le groupe agomir-NC et le groupe siRNA-NC, la DMO et le BV/TV ont augmenté dans le groupe agomir-miR-410 et le groupe Wnt-11-siRNA (tous P <0,05). Par comparaison avec le groupe agomir-miR-410 + OE-NC, les BMD et BV/TV du groupe agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 ont été abandonnés (tous deux P <0,05) (Fig. 3b, c).

La surexpression de miR-410 et la mauvaise expression de Wnt-11 augmentent les niveaux de DMO de la tige fémorale, de la tête fémorale et de la colonne vertébrale, ainsi que l'augmentation du calcium sérique et niveaux de phosphore des rats

La radiographie a observé que l'apparence de la tête fémorale dans le groupe normal était ronde, la densité de la tête fémorale était uniforme et la structure était complète. Dans le groupe ONFH, le groupe agomir-NC, le groupe siRNA-NC et le groupe agomir-miR-410 + OE-Wnt11, l'apparence de la tête fémorale des rats s'est amincie et la zone de résorption osseuse est apparue. L'aspect était uniforme et l'épaisseur de la tête fémorale des rats était complète dans le groupe agomir-miR-410, le groupe Wnt11-siRNA et le groupe agomir-miR-410 + groupe OE-NC (Fig. 4a).

Le miR-410 régulé à la hausse et le Wnt-11 régulé à la baisse augmentent le niveau de densité minérale osseuse de la tige fémorale, de la tête fémorale et de la colonne vertébrale, et augmentent également les niveaux de calcium et de phosphore sériques des rats. un Animal X-ray observation results. b Comparison of the bone mineral density of the femoral shaft, femoral head, and spine in each group. c Comparison of the serum calcium and phosphorus levels in each group. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

BMD and serum calcium and phosphorus level determination reported that compared to the normal group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels, fell in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and siRNA-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as serum calcium and phosphorus levels, ascended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, was abated (all P <0.05) (Fig. 4b, c).

Silencing Wnt-11 and Upregulating miR-410 Alleviate the Pathological Changes of Rat Tissues and Restrain Apoptosis of Osteocytes

The results of HE staining showed that the bone trabeculae were neat and clear and arranged regularly and tightly. Bone cells filled the bone lacunae, and the calcified zone was well connected to the subcartilage bone trabeculae in the normal group. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the bone trabecula was sparse; thinned, and even broken; the structure was disordered; and some fragments appeared. Some osteocytes in the bone lacuna were necrotic and a large number of bone lacuna was in emptiness that no bone cells filled in, and obvious proliferation of granulation tissue was observed in the necrosis bone trabecular space, which was wrapped around the necrotic bone trabeculae. In the agomir-miR-410 group, the Wnt-11-siRNA group, and the agomir-miR-410 + OE-NC group, the appearance of the rats remained intact, no obvious bone resorption area appeared and the bone trabeculae were arranged normally and the structure was complete (Fig. 5a).

Poor expression of Wnt-11 and overexpression of miR-410 alleviate pathological changes of rats tissues and restrain apoptosis of osteocytes. un Morphological observation of the femoral head of rats in each group (200 ×). b Ultrastructural observation of bone cells in rats of each group (8000 ×). c The results of TUNEL staining (200 ×). d Detection of apoptosis rate by TUNEL assay. e Detection of the Bax and Bcl-2 mRNA expression by RT-qPCR. f , g Detection of the Bax and Bcl-2 protein expression by western blot analysis. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

Electron microscopic observation observed that the shape of the bone cells in the normal group was consistent with the lacunae, and there was a small gap between the cell and the lacunae wall. The organelles were abundant, the cells in the lacunae were normal, the nucleus was egg-shaped, the nuclear membrane was intact, the chromatin did not agglutinate, and the cytoplasmic pseudo-foot stretched to the peripheral bone small tube and was connected with the adjacent bone cells. Osteoblasts were located on the surface of the bone trabecula, the sample was long, and there were many organelles. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, a large number of lipid deposits were found in the cytoplasm of osteoblasts, the gap between capsule and lacunae well was further widened, edema bright bands appeared between the nuclear membrane and cytoplasm, nuclear margination showed with compression, nuclear membrane was intact, mitochondria in cytoplasm was swollen, and the endoplasmic reticulum and Gore apparatus disappeared. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the morphology of rat osteoblasts was normal, chromatin aggregation was found in the nucleus of a small number of cells, no obvious lipid droplets were found in the cytoplasm, and the nuclear membrane was intact (Fig. 5b).

The results of TUNEL staining demonstrated that compared to the normal group, the apoptosis rate of osteocytes in the ONFH group was raised (P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the apoptosis rate of osteocytes abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the apoptosis rate of osteocytes enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 5c, d).

Western blot analysis and RT-qPCR reported that the Bcl-2 expression reduced and Bax expression raised in the ONFH group compared to the normal group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, Bcl-2 expression ascended and Bax expression descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the Bcl-2 expression declined and Bax expression appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 5e–g).

Overexpression of miR-410 and Low Expression of Wnt-11 Increase the Number of Osteoblasts and Decrease the Number of Osteoclasts

TRAP staining revealed that in the normal group, the morphology of osteoclasts with positive TRAP staining was different, most of them were shuttle or fusiform, few large osteoclasts were polygons, and most of them were distributed around the bone cerebellum. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, TRAP-positive cells were ascended, the morphology of cells was diverse in large polygons and polykaryotes, bone resorption was found in the bone trabeculae adjacent to osteoclasts, and typical resorption lacunae were formed. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of cells positive for TRAP staining was reduced, the cells were in a long strip shape and the morphology was more regular, the polygonous polynuclear osteoclasts were rare, and the bone structure of adjacent bone trabeculae was relatively complete (Fig. 6a).

Overexpression of miR-410 and low expression of Wnt-11 increase the number of osteoblasts and decrease the number of osteoclasts. un Results of TRAP staining in osteoclasts of rats (200 ×). b Count of positive cells in TRAP staining. c Results of ALP staining in osteoblasts of rats in each group (200 ×). d Count of positive cells determined by ALP staining. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

ALP staining presented that in the normal group, in osteoblasts, which were positive for ALP staining, the morphology was small and round. The cells were distributed in aggregation, most of which were located in the bone trabecular space of bone marrow cavity and on the surface of some bone trabeculae. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the number of osteoblasts positive for ALP staining was dispersedly distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblast-positive cells enhanced, and they were distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity and the surface of the part of the bone trabecular (Fig. 6c).

By comparison with the normal group, the number of osteoblasts per unit area was suppressed and the number of osteoclasts was heightened in the ONFH group (both P <0,05). In relation to the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the number of osteoblasts per unit area was heightened and the number of osteoclasts was declined in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblasts per unit area was declined and the number of osteoclasts was raised in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 6b, d).

Highly Expressed miR-410 and Lowly Expressed Wnt-11 Elevate the Expression of Osteocalcin (OCN), ALP, BGLAP, and Collα1, as well as Abate C- and N-terminal Telopeptides of Type I collagen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH Rats

The results of ELISA revealed that in relation to the normal group, the level of osteogenic function index ALP and OCN degraded while the levels of osteoclast function index NTX-1 and CTX-1 heightened in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, ALP and OCN ascended and NTX-1 and CTX-1 descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, ALP and OCN dropped and NTX-1 and CTX-1 appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7a).

Highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 elevate the expression of OCN, ALP, BGLAP, and Collα1 as well as abate NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH rats. un Detection of osteogenesis and osteoclast function indices in the serum of rats in each group by ELISA. b Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes by RT-qPCR. c , d Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes protein expression by western blot analysis. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, the expression of osteoblast-related factors ALP, BGLAP, and Collα1 degraded, and osteoclast-related factors ACP5, CTSK, and MMP9 expression ascended (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 elevated, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 depressed, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression heightened in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7b–d).

Elevated Wnt-11 and Decreased miR-410 are Found in ONFH Tissues of Rats as well as Wnt-11 is the Target Gene of miR-410

The targeting relationship between miR-410 and Wnt-11 gene was analyzed by an online analysis software. It was displayed that a specific binding region existed between Wnt-11 gene sequence and miR-410 sequence, implying that Wnt-11 was the target gene of miR-410 (Fig. 8a). Luciferase activity assay was utilized to verify this relationship (Fig. 8b). The results presented that compared to the NC group, the luciferase activity depressed in the miR-410 mimics group (P <0.05), but there was no significant difference in the luciferase activity of MUT 3′UTR (P> 0.05), indicating that miR-410 could specifically bind to Wnt-11.

Increased Wnt-11 and decreased miR-410 are found in ONFH tissues as well as Wnt-11 is the target gene of miR-410. un Prediction of binding sites of miR-410 on Wnt-11 3′UTR. b Luciferase activity detection for verifying the relationship between miR-410 and Wnt-11. c Detection of miR-410 and Wnt-11 expression by RT-qPCR. d , e Wnt-11 protein expression determined by western blot analysis. f Expression of Wnt-11 in femoral head of rats in each group detected by immunohistochemistry (200 ×). g Comparison of the positive rate of Wnt-11 protein expression in each group. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, miR-410 expression declined and Wnt-11 expression raised in the ONFH group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group, miR-410 raised and Wnt-11 reduced in the agomir-miR-410 group (both P <0,05). In contrast with the siRNA-NC group, Wnt-11 declined in the Wnt-11-siRNA group (P <0,05). Wnt-11 enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group relative to that in the agomir-miR-410 + OE-NC group (P <0.05) (Fig. 8c–e).

>Wnt-11 expression was verified by immunohistochemistry. Wnt-11 protein was mainly expressed in the cytoplasm, and the positive expression was mainly brownish yellow or brown. Compared to the normal group, the positive rate of Wnt-11 protein expression in the ONFH group was raised (P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the positive rate of the Wnt-11 protein expression descended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the positive rate of Wnt-11 protein expression enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 8f, g).

Discussion

ONFH, a kind of bone destruction disease, is caused by blood supply failure and coagulation and fibrinolysis system disorder and finally causes the femoral head to collapse [19]. A previous study has discussed miRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by hormone in mice with ONFH [20]. Also, a recent study has provided a proof that the expression profile of miRNA of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in osteogenesis related to steroid-induced ONFH [21]. Furthermore, it was revealed the Li-nHA/GM/rhEPO stents can elevate both Wnt and HIF-1/VEGF pathways and promote osteogenesis and angiogenesis, which is beneficial to the repair of ONFH induced by glucocorticoids [22]. Based on these facts, the study aimed to explore the effects of miR-410 in the prevention of ONFH by targeting Wnt-11.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-410, ALP, BGLAP, and Collα1 degraded and Wnt-11, ACP5, CTSK, and MMP9 enhanced in ONFH tissues. A recent study has promoted that the expression of miR-410 in osteosarcoma is declined, and the anti-tumor effect is shown [23]. Another study has presented miR-410 expression was reduced in human estrogen receptor-positive tissues of breast cancer [24]. It is reported that secreted factor Wnt-11 expression is ascended in several types of cancer, containing colorectal cancer, where it advances the migration and invasion of cancer cells [25]. Similarly, a previous study has proved that Wnt-11 expression is heightened in hormone-independent prostate cancer [26]. ALP is a useful index for the state diagnosis and clinical prognosis of the disease [27]. OCN (bone gamma-carboxyglutamate protein; BGLAP) is a widely conserved molecule related to mineralization of bone matrix [28]. ACP5 is necessary for osteoclast differentiation and bone resorption, and it promotes cell movement by regulating adhesion kinase phosphorylation [29]. CTSK is a critical protease in charge of osteopontin, degrading type I collagen and other bone matrix proteins [30]. MMPs can degrade and modify most of the components of extracellular matrix and basement membrane and push forward an immense influence on cancer invasion and metastasis [31]. Also, our study revealed that Wnt-11 is the target gene of miR-410. Similarly, Zhang et al. found that miR-410 targeted the inferred binding site in the Wnt3a 3′-UTR to modulate the Wnt signaling pathway [32].

In addition, it was revealed that upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increased BMD and BV/TV of ONFH rats. It has been suggested previously that a decrease of spinal BMD and an increase of urinary DPD/Cr ratio in non-traumatic ONFH patients [33]. Another study has verified that BMD of the femoral head and lumbar vertebrae in the ONFH group were degraded relative to that in the control group [34]. Additionally, imaging analysis revealed muscone can restore BMD and BV/TV ratio of the necrotic femoral head, while histologic examination further confirmed the protective effect of muscone on alcohol-induced ONFH [35]. A result emerged from our data that highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 restrained apoptosis of osteocytes. A study has demonstrated that silencing miR-410 can induce cell proliferation and reduce the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein [36]. It is reported that the descended miR-410 expression and ascended SOCS3 expression could reduce the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and promoted the apoptosis of cells [37]. In addition, in androgen deficient LNCaP cells, the downregulation of Wnt-11 can prevent neuroendocrine-like differentiation and lead to apoptosis of prostate cancer cells [26]. The study also showed that the downregulation of Wnt-11 and upregulation of miR-410 enhanced ALP, BGLAP, and Collα1 expression and reduced ACP5, CTSK, and MMP9 expression. A study has indicated that Wnt-11 expression heightened in cervical cancer cells may result in activation and phosphorylation of JNK-1 by activating Wnt/Jnk pathway and boosts the proliferation and migration/invasion of tumor cells [15]. It has been suggested that Wnt-11 gene silencing in colorectal cancer cell lines reduced the invasive ability of cells [25]. Furthermore, the overexpression of miR-410 can restrain the invasion, migration, proliferation, and epithelial mesenchymal transformation of osteosarcoma cells via directly targeting TRIM44 [23]. Furthermore, a previous study stated that upregulated miR-410 inhibited the growth of cholangiocarcinoma in a xenograft mouse model by inducing apoptosis [38].

Conclusion

In summary, our investigation revealed that miR-410 was lowly expressed and Wnt-11 was highly expressed in ONFH, and upregulating miR-410 or downregulating Wnt-11 increased osteoblasts and reduced osteoclasts to alleviate ONFH. However, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy of miR-410 and Wnt-11 for the treatment of ONFH.

Disponibilité des données et des matériaux

Not applicable

Change history

Abréviations

ALP:

Alkaline phosphatase

ANOVA:

Analysis of variance

BMD:

Bone mineral density

EDTA :

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

GE:

General Electric

LUI :

Hematoxylin-eosin

LSD-t:

Least significant difference t test

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC :

Negative control

OD :

Densité optique

ONFH:

Osteonecrosis of femoral head

PBS :

Phosphate-buffered saline

ROI:

Regions of interest

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

SD :

Sprague-Dawley

SDS:

Sodium dodecyl sulfate

THR:

Total hip replacement

TRAP:

Tartrate resistant acid phosphatase

TUNEL:

TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling