Préparation in situ et activité antibactérienne in vitro faciles de micelles de copolymères argentifères à base de PDMAEMA

Introduction

Au cours des dernières décennies, une gamme d'agents antimicrobiens traditionnels a été largement utilisée pour traiter les maladies infectieuses. Selon l'Organisation mondiale de la santé, l'émergence rapide de micro-organismes multirésistants est devenue un problème mondial de plus en plus grave, qui se classe parmi les trois premiers sur la liste des principales menaces pour la santé humaine [1,2,3,4,5]. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux agents antimicrobiens avec une bonne sécurité, une capacité antibactérienne efficace sans produire de résistance bactérienne. Les nanoparticules d'argent (AgNPs) comme l'un des meilleurs agents antimicrobiens depuis l'Antiquité, ont été largement utilisées dans les biens de consommation en raison de leurs performances supérieures contre divers agents pathogènes bactériens et fongiques, une toxicité relativement faible pour les cellules de mammifères et une résistance bactérienne limitée [6,7, 8,9,10]. Les AgNPs sont capables d'améliorer la perméabilité membranaire des bactéries, de pénétrer dans le cytoplasme, de dénaturaliser les protéines bactériennes et de perturber la réplication des bactéries, entraînant la mort des bactéries [11,12,13]. Un grand nombre de formulations d'argent ont été utilisées pour élucider l'activité antibactérienne des AgNPs [14,15,16,17], par exemple, un pansement à travers un hydrogel de polycarboxybétaïne zwitterionique avec des AgNPs antibactériens comme composant central proposé par Zhang et al. [18], les surfaces multifonctionnelles obtenues par revêtement multi-composants pour la co-immobilisation des AgNPs proposées par Moreno-Couranjou et al., etc. [19].

Cependant, une grande surface spécifique et une énergie de surface élevée ont conduit à l'agrégation d'AgNPs, ce qui est devenu un gros goulot d'étranglement pour leur application. Ainsi, une matrice polymère ou un stabilisant externe est nécessaire pour stabiliser les AgNPs. Comme on le sait, la matrice polymère est la méthode la plus courante pour résoudre le problème d'agrégation. À l'heure actuelle, plusieurs méthodes ont été utilisées pour stabiliser les AgNPs avec une matrice polymère, telles que la méthode de réduction chimique, la méthode électrochimique, la méthode photochimique et la méthode des micro-ondes. Parmi eux, la réduction chimique est une méthode courante et efficace. Le nitrate d'argent est réduit en AgNPs en ajoutant des réducteurs tels que l'hydrate d'hydrazine (N₂ H₄ ), borohydrure de sodium (NaBH₄ ), le citrate de sodium et l'acide ascorbique en solution [20,21,22,23]. Par exemple, Hoda et al. polystyrène-bloc-acide polyacrylique fabriqué (PS-b -PAA) reverse micelles chargées des AgNPs 20 nm sous l'influence de l'agent réducteur N₂ H₄ , et les blocs PS ont joué la couche externe dans le toluène [24]. Le groupe de Liu a signalé que des nanomodèles de micelles auto-assemblés ont été préparés à partir de poly(ε-caprolactone)-bloc-poly (acide aspartique) (PCL-b -PAsp). Des AgNPs bien dispersés ont été préparés avec AgNO₃ comme précurseur et NaBH₄ comme réducteur [25]. Cependant, les méthodes ci-dessus n'étaient pas respectueuses de l'environnement, et l'ajout excessif de réducteurs produit des sous-produits, ce qui rend difficile la purification des AgNP et restreint leur application d'antimicrobiens ciblant les maladies infectieuses.

En attendant, il a été rapporté que les polymères contenant un groupe amine pouvaient être utilisés à la fois comme réducteur et stabilisant pour préparer des AgNPs in situ. Par exemple, Lang et al. synthétisé des polymères étoiles à six bras constitués de PCL, de méthacrylate de 2-(diméthylamino) éthyle (DMAEMA) et de poly(éthylène glycol) méthyl éther méthacrylate (PEGMA). Le système a directement réduit le nitrate d'argent en AgNPs sans ajouter d'autre réducteur en phase aqueuse [26]. Bien que les AgNP mentionnés ci-dessus présentent une modification de surface facile sans réducteur supplémentaire, par rapport aux nanoparticules d'or [27, 28], l'effet des topologies polymères sur la réduction et la stabilité des nanoparticules d'argent ainsi que leur application dans l'activité antibactérienne à base de micelles est moindre. étudié.

Dans ce travail, une approche douce, facile et verte a été conçue pour lutter contre les infections bactériennes, en tirant parti des micelles polymères auto-assemblées à partir de copolymères triblocs en étoile linéaires ou à quatre bras avec un poids moléculaire et un degré de polymérisation similaires à ceux de la nanoplate-forme. pour décorer les AgNPs (Schéma 1). Dans cette approche, les copolymères triblocs, composés de DMAEMA, de méthacrylate de 2-hydroxyéthyle (HEMA) et de PEGMA, pourraient générer des micelles auto-assemblées dans des conditions aqueuses, ce qui constitue un bon modèle pour la préparation et la stabilisation des AgNPs. Les blocs PDMAEMA à groupements amine tertiaire pourraient facilement absorber l'Ag ⁺ par interaction de coordination puis in situ génèrent des AgNPs sans aucun agent réducteur. Les blocs HEMA et PEGMA à haute hydrophilie pourraient être utilisés comme stabilisants en phase aqueuse pour améliorer encore la stabilité des AgNPs. Par conséquent, le nitrate d'argent pourrait spontanément se coordonner et se désoxyder sur le noyau des micelles de copolymères auto-assemblées pour former des AgNPs. Ils étaient incrustés dans le noyau micellaire et pourraient entraîner la destruction de la membrane bactérienne. Ici, comment les topologies de copolymères étoiles linéaires ou à quatre bras affectent la longueur d'onde d'absorption maximale, la morphologie, la taille des particules, le potentiel zêta, la stabilité, ainsi que l'efficacité antibactérienne des AgNPs ont été entièrement étudiées. Par conséquent, l'étude sur la relation entre la structure et les propriétés peut comprendre une explication approfondie des nanoparticules hybrides d'argent pour le traitement des infections bactériennes. En outre, cela fournirait des idées de conception et une base technique pour la préparation d'AgNPs avec une structure plus stable et une taille de particule contrôlable.

Illustration schématique de la formation de micelles de copolymères linéaires/étoiles stabilisées AgNPs pour une excellente activité antibactérienne

Matériel et méthodes

Matériaux

Pentaérythritol (J&K Scientific Ltd.) a été séché par pression réduite pendant 24 h avant utilisation. Méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle (DMAEMA,> 98%), méthacrylate de 2-hydroxyéthyle (HEMA, 99%), et méthacrylate d'éther méthylique de poly (éthylèneglycol) (PEGMA, M _n =300 Da, 99 %), tous provenant d'Aldrich, ont été purifiés par passage à travers une colonne contenant de l'alumine neutre pour éliminer l'inhibiteur. Par l'utilisation d'hydrure de calcium (CaH₂ ), le tétrahydrofurane (THF) et le toluène d'Aldrich ont été séchés puis distillés sous pression réduite avant utilisation. 2-bromoisobutyrate d'éthyle (EBiB, 98%, Alfa Aesar), bromure de 2-bromoisobutyryle (BIBB, 98%, Alfa Aesar), 1,1,4,7,10,10-hexaméthyltriéthylènetétramine (HMTETA, 99%), nitrate d'argent (AgNO₃ , 99,9%), bromure cuivrique (CuBr₂ ), méthanol, triéthylamine (TEA), dichlorométhane (DCM), acétone, n -hexane, diméthylsulfoxyde (DMSO), octoate stanneux (Sn(Oct)₂ ), carbonate de sodium (Na₂ CO₃ ), bicarbonate de sodium (NaHCO₃ ), chlorure de sodium (NaCl), sulfate de sodium (Na₂ SO₄ ), et tous les autres réactifs obtenus auprès de J&K Chemical Company ont été utilisés tels que reçus.

Caractérisation générale et instrumentation

Résonance magnétique nucléaire du proton ( ¹ Les spectres RMN H) des copolymères triblocs linéaires ou à quatre bras ont été détectés dans CDCl₃ , et D₂ O à 25 °C à travers un spectromètre Bruker ADVANCE 400 MHz (Madison, WI, USA). Les mesures de spectres par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) de copolymères linéaires, de copolymères en étoile et de leurs AgNPs stabilisés par les micelles ont été réalisées à l'aide d'un spectrophotomètre FT IR (Nicolet Nexus pour Euro, USA) équipé d'un mode de transmission à 25 °C. Des échantillons granulaires ont été préparés après broyage au bromure de potassium (KBr) puis compression. Afin d'obtenir un spectre, les conditions spectrales ont été fixées au préalable avec une longueur d'onde de 4000 à 400 cm ⁻¹ (32 scans) et une résolution de 8 cm ⁻¹ . Les potentiels zêta des micelles de copolymères linéaires et étoilés stabilisés AgNPs à différents rapports molaires ont été mesurés en utilisant une mesure électrophorétique avec l'instrument Malvern Zetasizer Nano S (Malvern, WR, UK) dans lequel chaque échantillon a été testé trois fois à 25 ° C. La microscopie électronique à transmission (MET, FEI Tecnai-G20) fonctionnant à 200 kV a été réalisée pour observer les morphologies des micelles de copolymères linéaires et étoilés stabilisés AgNPs à différents rapports molaires. Le processus de préparation du produit pour la MET était le suivant :10 L de solution d'échantillon ont d'abord été déposés sur une grille de cuivre recouverte de carbone, puis séchés à l'air. Les spectres UV-Vis des micelles de copolymères linéaires et étoilés stabilisés AgNPs à différents rapports molaires ont été déterminés à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis (UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japon). L'analyse thermogravimétrique (TGA) a été réalisée sur un équipement NETZSCH (STA409PC, Allemagne). Tous les échantillons de poudre séchée (copolymères linéaires, copolymères en étoile et leurs AgNPs stabilisés par les micelles) ont été chauffés de 25 à 600 °C à une vitesse de 10 °C/min dans des conditions d'azote.

Synthèse de PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA

Les activateurs continus régénérés par polymérisation radicalaire par transfert d'atomes par transfert d'électrons (AGERT ATRP) de DMAEMA, HEMA et PEGMA ont été effectués en suivant la procédure modifiée de Zhang et al. [29, 30]. Bref, après l'ajout de CuBr₂ (10 mg, 0,045 mmol), le tricol sec de 100 mL a été mis sous vide et rincé à l'argon trois fois. Avec l'auxiliaire de la seringue dégazée, du toluène anhydre (25 ml), EBiB (88 L, 0,24 mmol), DMAEMA (5,15 ml, 30,5 mmol) et le ligand HMTETA (62 L, 0,24 mmol) ont été injectés de manière ordonnée dans le conteneur, après Agitation de 10 minutes. Après avoir injecté Sn(Oct)₂ (78 L, 0,24 mmol) avec du toluène (2 ml) comme solution, la réaction a eu lieu à 70°C dans un bain d'huile pendant 8 h. Le bloc successif HEMA (2,32 ml, 18,4 mmol) a été injecté pour la réaction suivante de 8 heures après que la solution est devenue beaucoup plus épaisse. Enfin, avec la participation du troisième monomère PEGMA (8,89 g, 55,6 mmol), nous avons assisté à une réaction continue de 72 h avant de refroidir le ballon presque à température ambiante. Du THF (30 ml) a été injecté dans le conteneur et le mélange réactionnel a ensuite été passé à travers une colonne d'alumine neutre pour éliminer le catalyseur. Le produit PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA a été précipité dans un excès décuplé de n froid -hexane, filtré, et enfin séché sous vide pendant 48 h à 35 °C.

Synthèse de (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄

Initiateur à terminaison bromo de type étoile (Br)₄ a été synthétisé par l'estérification des groupes hydroxyle terminaux présents sur le pentaérythritol avec du bromure de 2-bromoisobutyryle en utilisant le THF comme solvant et la TEA comme agent liant les acides. Typiquement, après chargement avec du pentaérythritol (2,72 g, 2 mmol), le ballon tricol de 100 mL a été évacué et rincé à l'argon trois fois, après injection séquentielle goutte à goutte de THF anhydre (120 mL) et de TEA (12,51 mL, 90 mmol) . Dans des circonstances de glace/eau, du bromure de 2-bromoisobutyryle (11,12 ml, 90 mmol) a été injecté goutte à goutte dans la solution vigoureusement agitée, après une réaction de 4 h à 0 °C puis 20 h à 25 °C. Afin de purifier le produit, le mélange a d'abord été passé sur une colonne d'alumine neutre. Le produit brut a été lavé successivement avec de l'eau, 10% Na₂ CO₃ , NaHCO saturé₃ , et NaCl saturé, puis successivement séchés sur Na₂ SO₄ toute une nuit, filtré et concentré avant de verser dans un excès décuplé de n froid -hexane pour précipiter le produit, et enfin séché sous vide pendant 24 h pour recevoir le produit.

Les voies de synthèse et les quantités d'alimentation de (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ a été réalisée selon la même procédure que PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA.

Préparation d'AgNPs à l'aide de micelles de copolymères linéaires ou en forme d'étoile

Le PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA ou (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ solution aqueuse (pH 7,0) ont été obtenues en premier, à laquelle l'AgNO₃ solution a été ajoutée tout en déclenchant la réaction de réduction du DMAEMA avec Ag ⁺ pour former des AgNPs in situ dans le noyau micellaire. Prendre le rapport molaire de DMAEMA et AgNO₃ est égal à 9 à titre d'exemple, tout d'abord, PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA ou (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ avec la même quantité de [DMAEMA] =4,8 mM agité dans de l'acétone (5 ml) pendant 4 h suivi par l'ajout d'eau distillée (20 ml) sous agitation pendant une nuit pour former des micelles stables. Puis AgNO₃ La solution (220 L, 48 mM) a été injectée goutte à goutte dans la solution ci-dessus et agitée à 25 °C dans l'obscurité pendant 48 h. Enfin, les AgNPs stabilisées par des micelles polymères linéaires ou en étoile ont été préparées par collecte et lyophilisation avant stockage à − 20 °C pour les expériences suivantes.

Dosage antibactérien

Les investigations antibactériennes sur les micelles polymères stabilisées AgNPs ont été menées contre Escherichia coli DH5alpha (E . coli DH5α) utilisant le milieu Luria-Bertani (LB) comme support pour préparer différentes concentrations des solutions d'AgNPs stabilisées par les micelles polymères par ultrasons. Le E monoclonal . coli Les DH5α ont été cultivés pendant la nuit dans du milieu LB (5 mL) à 37 °C sur un Shaker à 200 tr/min avant que la suspension bactérienne ne soit diluée à 1 × 10 ⁵ UFC/mL par milieu LB. Après mélange d'un volume égal de bactéries diluées avec différentes concentrations de micelles de copolymères ou de micelles stabilisées AgNPs et incubation à 37 °C pendant 16 h, l'évolution de la densité optique à la longueur d'onde de 600 nm a été caractérisée par un lecteur de microplaques (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, Vantaa, Finlande). Chaque essai a été répété six fois.

Évaluation de la viabilité des cellules

Afin d'évaluer la viabilité cellulaire, le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) avec des cellules de carcinome hépatocellulaire du foie (HepG2) a été réalisé. Avant l'ensemencement des cellules, les cellules HepG2 ont d'abord été incubées dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO₂ à 37 ° C dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de pénicilline (100 L/mL) et de streptomycine (0,1 mg/mL). Ensuite, les cellules HepG2 ont été ensemencées dans un milieu DMEM frais sur plaque 96 puits à une densité de 1 × 10 ⁴ par puits et cultivé pendant 1 jour. Après avoir substitué le milieu DMEM dans des micelles de copolymères préparées ou des solutions d'AgNPs stabilisées par micelles (100 L) à diverses concentrations, les cellules ont continué à être cultivées pendant les 24 h suivantes. Après avoir été lavés trois fois avec du tampon PBS, les 20 L de réactif MTT (5 mg/mL) et 180 L de DMEM frais ont ensuite été ajoutés et incubés pendant 4 h supplémentaires. Enfin, la solution a été changée dans 200 L de DMSO et la plaque a été secouée doucement pendant 10 min. L'absorbance à 570 nm a été mesurée avec le lecteur de microplaque mentionné ci-dessus. Les données de six expériences parallèles ont été moyennées.

Simulation de la dynamique des particules dissipatives

Afin d'analyser le processus de croissance des AgNPs, une simulation de la dynamique des particules dissipatives (DPD), basée sur les modèles à gros grains, a été réalisée en utilisant le module mésocite de Materials Studio 8.0 (Accelrys Inc., San Diego, CA, ETATS-UNIS). Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S1, six types de billes constituaient les copolymères PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA ou (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ :support orange pour le centre, vert clair pour MAA1 (méthacrylate à côté de la chaîne latérale éthylamine), vert pour DMA (chaîne latérale amino éthyle), rose pour HEMA, bleu clair pour MAA2 (méthacrylate à côté de la chaîne latérale PEG) et bleu pour CHEVILLE. Un petit amas avec un cristal à mailles unitaires (longueur du réseau :3,87 ) se composait de quatre atomes d'argent, marqués comme une perle d'argent (couleur or). Dans le même temps, chaque perle d'eau (W) de couleur noire contenait cinq molécules d'eau. D'après nos travaux précédents, le fichier supplémentaire 1 :le tableau S1 a montré le résultat des paramètres d'interaction de calcul [31, 32]. A 30 × 30 × 30 r _c ³ Une boîte de simulation cubique avec des conditions aux limites périodiques a été utilisée dans toutes les directions avec 100 000 pas de simulation au total et un pas de temps d'intégration de 0,05 ns.

Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'un t de Student à deux échantillons test à variance inégale. p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation de copolymères linéaires/étoiles

Copolymères linéaires PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA et copolymères étoiles (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ ont été synthétisés par polymérisation ARGET ATRP de DMAEMA, HEMA et PEGMA avec CuBr₂ /HMTETA comme catalyseur, Sn(Oct)₂ comme agent réducteur, et EBiB ou pentaérythritol qui a été préalablement acylé avec BIBB comme initiateur dans le toluène (Schéma 2). La structure et la composition des polymères cibles ont été vérifiées par ¹ RMN H. Les micelles polymères ont été auto-assemblées à partir de PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA ou (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ avec le DMAEMA comme bloc fonctionnel, où l'Ag ⁺ les ions ont été attirés et réduits en AgNPs sans la participation d'agent réducteur supplémentaire. Les effets des structures topologiques des copolymères sur les AgNPs ont été discutés et évalués à partir des propriétés physico-chimiques, des activités antibactériennes et anticancéreuses.

Routes synthétiques de a PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA et b (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄

Les structures chimiques des copolymères linéaires/étoiles ont été confirmées par ¹ RMN H. Premièrement, les groupes hydroxyles terminaux du pentaérythritol ont été entièrement transférés au groupe brome terminal (Br)₄ , comme indiqué dans ¹ Spectre RMN H (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Le pic à 4,33 ppm a été attribué au -CH ₂ O- dans le pentaérythritol, tandis que le nouveau -(CH ₃ )₂ - un signal à 1,94 ppm est apparu. Et les valeurs du rapport d'intégration des pics à 1,94 ppm à 4,33 ppm étaient d'environ 3. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S3 et S4, le pic de -C(CH ₃ )₂ - est apparu à 1,94 ppm. Les signaux à 1,83 ppm, 1,00 ppm ont été attribués à -CH ₂ - et -CCH ₃ - dans les chaînes principales du méthacrylate de méthyle, respectivement. Les pics à 2,58 ppm et 4,08 ppm appartenaient aux résonances caractéristiques des deux protons de méthylène coïncidents -CH ₂ CH ₂ - dans le bloc DMAEMA, et le pic à 2,29 ppm a été attribué aux protons de méthyle -CH ₃ -, qui était attaché à un groupe amine tertiaire. La présence de -CH ₂ CH ₂ - les protons de méthylène connectés au groupe hydroxyle terminal dans l'unité HEMA sont apparus à 4,08 ppm et 3,57 ppm, respectivement. Les pics PEG caractéristiques de -OCH ₂ CH ₂ - et borne -CH ₃ les protons sont apparus à 3,67 et 3,39 ppm, respectivement. Les pics de double liaison à 5,5–6,1 ppm ont disparu dans le ¹ Spectres RMN H. Calculé à partir des valeurs du rapport d'intégration du signal (f) à (a) (I _f /Je _un ), signal (g) à (a) (I _g /Je _un ), et le signal (h) à (a) (I _h /Je _un ), respectivement, PDMAEMA_19.3 -b -PHEMA_12.5 -b -PPEGMA_24.6 et (PDMAEMA_5.0 -b -PHEMA_5.6 -b -PPEGMA_5.0 )₄ ont été obtenus.

Préparation et caractérisation des micelles de copolymères linéaires/étoiles stabilisées AgNPs

Le processus de formation des AgNPs a été montré dans le schéma 1. Une seule paire d'électrons sur l'atome N qui appartiennent au groupe amine tertiaire dans la chaîne moléculaire PDMAEMA, possédant une capacité de coordination et de réduction, il pourrait donc être utilisé à la fois comme agent de piégeage et un agent réducteur. Premièrement, les ions argent ont été piégés par PDMAEMA en raison de la complexation entre Ag ⁺ et N atome, formant (Ag ⁺ )-complexe PDMAEMA. Par la suite, Ag ⁺ ont été réduits in situ pour former des atomes d'argent au stade de la nucléation. Par la suite, la nucléation de l'Ag s'est poursuivie avec la croissance du cristal d'Ag, entraînant la formation d'AgNPs [26]. Le bloc hydrophile PPEGMA a agi comme une coque micellaire, qui a fourni une couche protectrice stable et a encore amélioré la stabilité des AgNPs. L'effet de stabilisation stérique des micelles auto-assemblées au sein du système a été déterminé par l'équilibre thermodynamique des micelles sur la stabilisation des AgNPs et l'agglomération entre les AgNPs. Dans le cas d'une petite quantité d'AgNPs, la stabilisation stérique du copolymère pourrait empêcher une agrégation supplémentaire des AgNPs. Avec l'augmentation du nombre d'Ag, la stabilité des micelles vis-à-vis des AgNPs serait affaiblie et la possibilité de collision entre les particules augmenterait, entraînant une croissance de la taille des AgNPs. Tirant parti de la stabilisation spatiale des micelles, les AgNPs que nous avons préparés ont une taille de particules contrôlée, ce qui présente un grand potentiel pour les applications antibactériennes.

Une simulation DPD a été réalisée pour étudier le processus de croissance et la distribution des AgNPs, avec les mêmes concentrations que l'expérience réelle (PDMAEMA/AgNO₃ rapport molaire =1/1, les fractions volumiques de copolymères linéaires, Ag et billes d'eau étant de 10 %, 0,23 % et 89,77 %, respectivement). La figure 1 a révélé que les billes de PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA et AgNPs ont initialement montré un état irrégulièrement distribué en solution aqueuse. Au fil du temps, huit micelles de copolymère auto-assemblées se sont finalement formées et dispersées uniformément, tandis que toutes les billes d'Ag ont été chargées dans les micelles. On a pu voir que les AgNPs en équilibre pouvaient être stabilisés dans les micelles de copolymère sans agrégation supplémentaire, indiquant que les micelles auto-assemblées étaient capables d'empêcher la poursuite de l'agrégation des AgNPs et ont ensuite atteint l'objectif de contrôler la taille et la distribution de leurs particules.

Simulation DPD du processus de croissance et de la distribution des AgNPs avec PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA à PDMAEMA/AgNO₃ rapport molaire =1/1 dans différents temps de simulation. un Les molécules d'eau étaient cachées pour plus de clarté. b Seuls les AgNP ont été affichés

La caractérisation FT IR des copolymères linéaires/étoiles et de leurs AgNPs stabilisés par les micelles ont été présentées dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S5. Évidemment, par rapport aux copolymères linéaires/étoiles simples, la vibration d'étirement -COOR à 1730 cm ⁻¹ et la vibration de flexion de la liaison C-N dans le PDMAEMA à 1457 cm ⁻¹ diminué après la formation des AgNPs, indiquant que les AgNPs ont été chargés avec succès sur les micelles de copolymères. La nature cristalline des micelles de copolymères linéaires/étoiles stabilisées AgNPs a été confirmée par spectre de diffraction des rayons X (Fichier supplémentaire 1 :Figure S6). Les valeurs des pics de diffraction de 38,5°, 44,8°, 64,2° et 78,0° correspondaient aux faces cristallines (111), (200), (220) et (311) de la structure cristalline cubique centrée (fcc) de nanoparticules contenant de l'Ag [33, 34]. Les potentiels zêta des micelles de copolymères linéaires/étoiles stabilisées AgNPs ont été mesurés. Comme le montre la figure 2, les potentiels zêta de ces AgNP stabilisés par des micelles de copolymère étaient d'environ 15,0 à 23,2 mV. De plus, avec la quantité croissante d'AgNO₃ , le potentiel zêta des AgNPs stabilisés par les micelles a remarquablement augmenté en raison de la décoration de plus d'AgNPs. Pour étudier davantage la dispersion des AgNPs et l'effet stabilisant des micelles sur les AgNPs, des simulations DPD de micelles de copolymères linéaires/étoiles ont stabilisé les AgNPs à différents PDMAEMA/AgNO₃ les rapports molaires ont été effectués. Comme le montre la figure 2, les résultats ont également démontré que les tailles des AgNPs étaient proportionnelles aux ratios où le nombre de petits AgNPs agrégés augmentait et la distance entre eux diminuait, entraînant une augmentation de la probabilité de collision et d'agglomération.

Les potentiels zêta et les vues en coupe de a linéaire et b les micelles de copolymères en étoile ont stabilisé les AgNPs. Les données ont été collectées avec différents PDMAEMA/AgNO₃ rapports molaires de (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Les spectres pour quatre micelles de copolymères linéaires stabilisés AgNPs possédaient une différence mineure au pic d'absorption maximum situé autour de 437 nm, qui était caractéristique du pic d'absorption de résonance plasmonique de surface (SPR) des AgNPs sphériques/presque sphériques, liée à la fois à l'excitation de résonance et à la transition interbande de eux (Fig. 3a). Le résultat a prouvé que le groupe amine tertiaire dans les copolymères linéaires pouvait réagir avec le nitrate d'argent et la formation d'AgNPs ne dépendait guère de l'encombrement stérique des micelles des copolymères linéaires. Par la suite, les copolymères étoiles avec le même bloc et degré de polymérisation dans les mêmes conditions, la taille des particules d'AgNPs a diminué lorsque le PDMAEMA/AgNO₃ rapport molaire augmenté. Cela s'est reflété à travers le décalage hypsochrome dans les spectres UV-Vis où les pics d'absorption maximum étaient à 429 nm, 426 nm, 421 nm et 414 nm, respectivement, en raison de la quantité différente d'AgNPs formé par la réduction de coordination sur l'amine tertiaire. de micelles de copolymères étoiles (Fig. 3b). En d'autres termes, la stabilisation stérique des copolymères étoiles pourrait mieux stabiliser les AgNPs et empêcher son agrégation supplémentaire à une petite quantité d'AgNPs. En revanche, l'augmentation de la quantité d'AgNPs a affaibli l'effet stabilisant, ce qui a fourni plus d'opportunités à la collision d'AgNPs, et a finalement abouti à des AgNPs plus grands. En comparant la figure 3a avec la figure 3b, les pics d'absorption à 437 nm des AgNPs dans les micelles de copolymères linéaires possédaient une distribution de longueur d'onde plus large, tandis que les AgNPs dans les micelles de copolymères en étoile étaient à environ 422 nm. Ici, il n'y avait pas de décalage vers le bleu dans les spectres des copolymères linéaires, ce qui pourrait s'expliquer par le fait que les blocs de micelles de copolymères linéaires ont un effet plus faible sur l'encombrement stérique pour les AgNPs, ce qui a entraîné une augmentation de la probabilité d'agglomération collisionnelle entre AgNPs.

Spectres UV-Vis de a linéaire et b micelles de copolymères étoiles stabilisées AgNPs à différents PDMAEMA/AgNO₃ rapports molaires de (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Des mesures MET ont ensuite été effectuées pour déterminer la taille, la distribution des tailles et la morphologie des AgNPs. Les images MET des AgNPs dépendaient de AgNO₃ les ratios d'alimentation ont été montrés dans la Fig. 4. Lorsque le PDMAEMA/AgNO₃ les rapports molaires étaient de 6 et 1, calculés à l'aide du logiciel ImageJ, la taille des particules des micelles de copolymères linéaires stabilisées AgNPs était de 11,1 nm et 25,7 nm, tandis que le diamètre des micelles de copolymères étoiles stabilisées AgNPs était de 3,7 nm et 6,4 nm, respectivement. L'augmentation de AgNO₃ contenu a conduit à plus d'atomes d'argent dans les micelles, une énergie de surface plus élevée et le nombre d'AgNPs agrégés augmente en conséquence avec une plus grande taille d'AgNPs. Il était clair que les AgNPs stabilisés par les micelles étaient monodisperses et sphériques avec des AgNPs stabilisés par des micelles de copolymères linéaires quelque peu inégaux. Les tailles des AgNPs stabilisées par les micelles complètent en outre les résultats UV-Vis.

TEM image of a , b linear copolymers and c , d star copolymers micelles stabilized AgNPs at different PDMAEMA/AgNO₃ molar ratios:a , c 6/1, b , d 1/1

Stability of the Linear/Star Copolymers Micelles Stabilized AgNPs

The stability of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs is of great influence for the development of biomedical field. Obviously, the SPR peak in UV-Vis spectra (Fig. 5) of star copolymer micelles stabilized AgNPs did not display any significant changes for at least 1 month even after further diluted by one time, three times, and six times, indicating that the prepared AgNPs appeared well long-term colloidal stability within the experimental concentration range. However, the results of linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed that the UV absorption wavelength decreased slightly as the increase of dilution ratios. And the micelles concentration of linear copolymer decreased after 1 month of placement may lead to insufficient provision of steric hindrances to stabilize AgNPs.

UV-Vis spectra of a linear copolymers and b star copolymers micelles stabilized AgNPs solution at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1 after 1 month at the diluted times of 1 (a), 3 (b), and 6 (c), respectively

From the thermogravimetric analysis curves in Fig. 6, it was shown that the initial decomposition temperature (T _onset ) of linear copolymers micelles was 217 °C, which shifted to 172 °C after silver loading, suggesting that the linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed lower thermal stability than the pure linear copolymers micelles. It may be due to the fact that the chemical structure of PDMAEMA in the molecular chain changes and the catalytic effect of AgNPs in the thermal degradation process cannot be ignored [35]. As for star copolymers and their stabilized AgNPs, T _onset were around 213 °C. The two T_onset of star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs showed very few gaps, which could be speculated that the more stable star-shaped copolymers have better effect on stabilizing AgNPs than the linear copolymers. Combined the results of UV-Vis, TEM, and TGA measurements, it could be inferred that compared to the linear copolymers, the star copolymers have superior advantages in topology for stabilizing AgNPs, such as better stability, more uniform dispersion, slower nucleation rate during reduction, and the better product with a smaller and more uniform size of AgNPs.

TGA curves of a linear copolymers and b star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1

Antibacterial Activity and Cell Viability

To evaluate the antibacterial activities of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs by optical density (OD₆₀₀ ) measurements, E . coli DH5α was selected as the Gram-negative bacterial model. The absorbance at 600 nm after incubation was tested by incubating the bacteria with the eight different concentrations of micelles and micelles stabilized AgNPs at 37 °C. Results shown in Fig. 7a illustrated that the bacterial growth curves were highly correlated with the AgNPs concentration in the LB medium. The inhibition of linear/star copolymers micelles on the growth of bacteria was weak, which was not fatal to bacteria. However, as the concentration of linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs increased, the survival rate of E . coli DH5α was significantly inhibited, indicating a strong antibacterial efficacy of AgNPs against E . coli DH5α. The concentrations of linear copolymers micelles stabilized AgNPs preventing the bacterial growth in the experiments were relatively higher than those of star copolymers micelles stabilized AgNPs, which might due to the fact that bigger size of AgNPs could lead to a lower antibacterial performance because of the inefficient exposure of bacteria to AgNPs and relatively slow release behavior of AgNPs.

un Antibacterial activity and b cell viability of linear copolymers and star copolymers micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1. *p <0.05, two-tailed Student t tester

Cancer is an uncontrollable disease of cell growth that can occur in any part of the body. The most common cancers are liver cancer, breast cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Among them, the liver cancer has the much higher prevalence in both developed and developing countries. Therefore, the toxicity experiments of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs on HepG2 cells were carried out, in which HepG2 cells were incubated with linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs at different concentrations (10, 50, 100, 200, 400 mg/L, respectively) for 48 h and the cell viability with MTT assay was the most intuitive data to evaluate the biocompatibility of the composite material. As shown in Fig. 7b, the percentage of viable cells for the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited negligible cytotoxicity, and was about 90% viability even at the highest concentration applied (400 μg/mL) after 48-h incubation, indicating the advantageous cytocompatibility of the micelles stabilized AgNPs within a relatively wide range of concentration.

Conclusion

In conclusion, PDMAEMA-based linear and star copolymer micelles as effective delivery carriers for silver-bearing antimicrobials were developed, and their in vitro antimicrobial efficacy and cell viability were investigated. Being a reducing agent and a stabilizer simultaneously, the micellar PDMAEMA core acted as loading platform for AgNPs in situ translated from the precursor silver nitrate. In silico simulation and experimental results indicated that both types of the copolymer micelles could generate monodisperse and spherical AgNPs. Compared with linear copolymers sliver-bearing micelles, the fabricated star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited smaller average size, better stability against dilution and pyrogenic decomposition, and enhanced antibacterial activities against E . coli DH5α due to the serious damage of bacterial membrane caused by loaded AgNPs. Moreover, both types of copolymer micelles stabilized AgNPs possessed great cytocompatibility toward HepG2 cells. Therefore, these studies may provide some guidance for the construction of more effective AgNPs weapon with well-defined and feasible polymer topology for combating the multiple bacteria-induced infections.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abréviations

AgNPs:

Nanoparticules d'argent

DMAEMA:

2-(dimethylamino) ethyl methacrylate

HEMA:

2-hydroxyethyl methacrylate

PEGMA:

Poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate

CuBr₂ :

Cupric bromide

¹ H NMR:

Proton nuclear magnetic resonance

FTIR :

Fourier-transform infrared spectroscopy

KBr:

Potassium bromide

UV-Vis:

Ultraviolet-visible

MTT :

Bromure de 3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium

HepG2:

Liver hepatocellular carcinoma

DPD:

Dissipative particle dynamics

SPR:

Surface plasmon resonance

XRD :

Diffraction des rayons X