Synthèse verte de nanoparticules d'argent par extrait de levure : morphologie contrôlée et activité antibactérienne renforcée

Résumé

La biosynthèse pour préparer des nanoparticules d'argent (Ag NPs) antimicrobiennes est une méthode verte sans agents réducteurs et surfactants cytotoxiques. Ici, des Ag NPs à forme contrôlée et bien dispersées sont biosynthétisées utilisant l'extrait de levure comme agents réducteur et capteur. Les Ag NPs synthétisées présentent une forme sphérique uniforme et une taille fine, taille moyenne 13,8 nm. Les biomolécules d'acides aminés réducteurs, d'acide alpha-linolénique et de glucides dans l'extrait de levure jouent un rôle significatif dans la formation des Ag NPs, prouvé par analyse spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). De plus, les acides aminés à la surface des Ag NPs portent des charges nettes négatives maximisant les interactions de répulsion électrostatique en solution alcaline, assurant stabilité favorable >1 an sans précipitation. Les Ag NPs en traitement combiné avec ampicilline inversent la résistance dans cellules E. coli résistantes à l'ampicilline. Ces Ag NPs monodispersées pourraient être alternative prometteuse pour désinfection souches bactériennes multirésistantes, avec cytotoxicité négligeable et bonne biocompatibilité cellules Cos-7.

Introduction

Infections résistantes aux médicaments : cause majeure décès, risque sérieux santé publique. Résistance croissante aux antimicrobiens = problème urgent médecine [1]. Nombreuses souches Staphylococcus aureus résistantes méthicilline = cause majeure infections nosocomiales. Autres bactéries résistantes : Neisseria gonorrhoeae résistante pénicilline, Escherichia coli (E. coli) multirésistant [2,3]. Mécanismes résistance majeurs : efflux accru, absorption réduite antibiotiques [4]. Autre mécanisme : expression enzymes modifiant structure moléculaire antibiotiques [5]. Bien que efforts développement prochaine génération agents antimicrobiens, besoin accru méthodes désinfection supérieures.

Nanoparticules d'argent (Ag NPs) utilisées nombreuses applications : vecteurs protéines, radiosensibilisateurs, amélioration efficacité cellules solaires carburant, agents antibactériens [6-8]. Nanoparticules incluant métalliques, Ag NPs = plus utilisées agents antimicrobiens [9]. Réalité : Ag NPs activité antimicrobienne significative souches bactériennes, cytotoxicité négligeable cellules animales [10,11]. De plus, Ag NPs activité antimicrobienne champignons, certains virus, souches bactériennes résistantes antibiotiques. Mécanismes action : suppression réplication ADN, blocage différence potentiel électrique membranes cytoplasmiques, suppression chaîne respiratoire [12]. Taille, structure surface, formes contrôlées Ag NPs rôles cruciaux activité antimicrobienne et autres applications. Méthode générale préparation Ag NPs : réduction ions argent présence surfactant approprié pour croissance contrôlée [13]. Majorité agents réducteurs/surfactants cytotoxiques cellules tissus humains, contamination environnementale potentielle. Donc effort essentiel développer méthodes vertes préparation Ag NPs forme contrôlée.

Ce travail présente nouvelle voie biosynthèse Ag NPs utilisant extrait levure. Pendant processus, extrait levure fournit agents réducteur et capteur : acides aminés, vitamines, glucides ; ions argent = accepteur électron. Résultat : stabilité favorable agents capteurs organiques surface, Ag NPs monodispersées préservées >1 an sans précipitation. Ag NPs activité antibactérienne supérieure ampicilline contre E. coli résistant ampicilline. Comparé méthodes synthétiques conventionnelles, biosynthèse présentée : biocompatible, rentable, écologiquement bénigne. Ag NPs forme contrôlée bien dispersées bon effets antibactériens E. coli.

Méthodes

Matériaux

Nitrate d'argent (AgNO₃), saccharose (C₁₂H₂₂O₁₁), chlorure sodium (NaCl), hydroxyde sodium (NaOH) : Sinopharm Co., Ltd. Levure boulangère sèche : AB/MAURI Co., Ltd. E. coli : TransGen Biotech Co., Ltd. Kit CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) : Promega Biotech Co., Ltd. Plasmide pcDNA3.4, tampon échantillon 1×NuPAGE® LDS, milieu DMEM modifié Dulbecco, sérum bovin fœtal (FBS) : Thermo Fisher Scientific Inc. Ampicilline, milieu Luria-Bertani (LB) : Sangon Biotech Co., Ltd. Tous réactifs analytiques, sans purification. Eau ultra-pure déionisée (18,2 MΩ·cm) utilisée tout au long.

Synthèse des Ag NPs

Cellules levure ensemencées milieu LB, agitées ~150 tr/min overnight 25 °C activation. Cellules activées lavées solution saline 0,9 %, dispersées solution saccharose 2 % agitation ~150 tr/min 6 h 25 °C. Extrait de levure sans cellules collecté pour biosynthèse Ag NPs par centrifugation 2000 tr/min 5 min. Pendant processus biosynthétique, pH extrait levure ajusté 10 solution NaOH, puis solution AgNO₃ ajoutée progressivement sous agitation magnétique vigoureuse. Ag NPs obtenues dialysées membranes 1 kDa 5 jours, lyophilisées pour caractérisation.

Caractérisations

Images MET Ag NPs : JEM-2100, tension accélération 200 kV (JEOL, Japon). Images MEB : Carl Zeiss ULTRA plus MEB (Carl Zeiss, Allemagne) équipé spectromètre dispersion énergie (EDS) 20 kV. Spectres absorption UV-Vis : Lambda 950 UV/Vis/NIR spectrophotometer (Perkin-Elmer, USA). Diagrammes DRX poudre : D8 Advance (Bruker, Allemagne). FTIR : 4000-500 cm⁻¹ pastilles KBr, spectromètre Vertex 70 (Bruker, Allemagne). Potentiel zêta Ag NPs : Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, UK) 25 °C. Éléments surface Ag NPs : XPS Kratos AXIS Ultra DLD source Al Kα monochromatique (1486,6 eV) (Shimadzu, Japon). Composants acides aminés : analyseur acides aminés haute vitesse L-8900 (Hitachi, Japon).

Test cytotoxicité cellulaire

Explorer biocompatibilité Ag NPs préparées : test MTS évaluer cytotoxicité [13]. Cellules Cos-7 cultivées DMEM + 10 % FBS milieu complet incubateur humidifié 5 % CO₂ 37 °C. Cellules semées plaques 96 puits fond plat densité 10000 cellules/puits, 24 h. Milieu remplacé DMEM frais contenant différentes concentrations Ag NPs. Après 24 h incubation, cellules viables relatives déterminées MTS. Absorbance 490 nm SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA). Cellules non traitées DMEM = contrôle.

Test SDS-PAGE

SDS-PAGE standard gel séparation 10 % (p/v), gel empilement 4 %. Échantillons bouillis 5 min 1×NuPAGE® LDS Sample Buffer, centrifugés 12000 tr/min 5 min avant application gels. Marqueur protéine standard référence. Gels colorés 0,5 % Bleu Coomassie. Images gels enregistrées GelDoc XR⁺ (Bio-Rad, USA).

Études activité antimicrobienne

Déterminer activité antimicrobienne : Ag NPs testées activité bactéricide contre E. coli [14]. Colonie unique E. coli cultivée overnight 37 °C LB milieu agitateur orbital 150 tr/min. Colonies ajustées DO 0,01–0,02 à 600 nm LB frais. 100 µl dilutions sérielles Ag NPs plaques 96 puits. Plaques inoculées 100 µl solution E. coli diluée, incubées 16 h 37 °C. Viabilité E. coli : absorbance 600 nm SpectraMax® M5. Analyse cinétique évaluer sensibilité antibactérienne E. coli dans temps. 100 µl E. coli ajouté tubes stériles contenant 10 et 20 µg/ml Ag NPs. Absorbance 600 nm mesurée après 1, 2, 4, 6 h.

Test unité formant colonie (UFC) pour Ag NPs contre cellules bactériennes résistantes antibiotiques. E. coli exprime stablement plasmide pcDNA3.4 gène β-lactamase conférant résistance ampicilline comme modèle. Quand E. coli-Amp⁺ phase log croissance, cellules cultivées gélose LB traitement ampicilline seule ou traitement combiné Ag NPs + ampicilline, incubées 37 °C 18 h. Nombre colonies E. coli-Amp⁺ formées plaques LB calculé. Tous tests ≥3 fois.

Résultats et discussion

Synthèse des Ag NPs

Schéma 1 illustration schématique : préparation Ag NPs commence par auto-assemblage biomolécules extrait levure formant micelles levure. Ag⁺ réduit in situ par agents réducteurs extrait levure : acides aminés, vitamines, glucides. Nanoparticules Ag formées stabilisées par biomolécules. Revêtement surface Ag NPs augmente affinité membrane bactérienne, augmentant perméabilité paroi cellulaire. Interaction Ag NPs / peptidoglycane change configuration peptidoglycane → processus apoptose → dommage bactéries.

Illustration schématique proposée biosynthèse Ag NPs.

Caractérisation structurale des Ag NPs

Figure 1a : image MEB typique → Ag NPs forme sphérique, taille fine. EDX confirme formation Ag NPs (Fig. 1b). Pic absorption optique fort ~3 keV = pic typique résonance plasmonique surface nanocristaux argent. Quantités mineures O, C = fine couche cap organique Ag NPs synthétisées. Réaction AgNO₃ + NaOH → petite quantité Ag₂O. Donc peu O aussi attribuable présence Ag₂O. Morphologie/taille Ag NPs caractérisées MET haute résolution (HRTEM). Ag NPs diamètre 10,3–18,9 nm (Fig. 1c), moyenne 13,8 nm (Fig. 1d). Taille, forme, chimie surface Ag NPs → effet important activité antimicrobienne. Taille plus petite, surface plus grande → meilleure interaction membrane bactérienne → activité antimicrobienne renforcée [15-17]. Franges réseau claires image HRTEM : espacement 0,15 nm (Fig. 2a) = plans (220) argent. Figure 2b : nature cristalline Ag NPs démontrée motifs diffraction zone sélectionnée (SAED) typiques, anneaux brillants = plans (311), (220), (200), (111) [18,19].

a Image MEB émission champ Ag NPs, b Spectre EDX Ag NPs, c Image MET Ag NPs, d Distribution taille Ag NPs.

a Franges réseau Ag NPs image HR-TEM, b Anneaux circulaires Ag NPs motifs SAED typiques.

Spectre UV-Vis Ag NPs : pic fort 418 nm = résonance plasmonique surface (Fig. 3a). Solution jaune Ag NPs synthétisées (Fig. 3b) = formation Ag NPs. Analyse DRX Ag NPs : quatre pics intenses 77,36°, 64,30°, 43,52°, 38,16° → plans (311), (220), (200), (111) argent (Fig. 3c). Données confirmées carte JCPDS n° 04-0783 [20]. DRX → nature cristalline Ag NPs, accord rapport antérieur [21]. FTIR caractérise/identifie biomolécules potentielles Ag NPs synthétisées (Fig. 3d). Bande large 3405 cm⁻¹ = étirement −OH [22]. Pic plus faible 2915 cm⁻¹ = vibration étirement −CH₂. Bande 1655 cm⁻¹ extrait levure = vibration étirement C=O groupes carboxyle, décalage 1573 cm⁻¹ Ag NPs = interaction groupes carboxyle/Ag NPs [23]. Pic net 1375 cm⁻¹ = vibration étirement C–N. Bandes 1048, 1083 cm⁻¹ = vibrations étirement C–O–C, C–OH [24,25]. Résultats : biomolécules extrait levure responsables biosynthèse Ag NPs. Revêtement surface Ag NPs affecte affinité membrane bactérienne [26,27]. États Ag NPs caractérisés XPS. Figure 4a : balayage complet spectre XPS pics nets → C 1s, Ag 3d, Ag 3p, Ag 3s, O 1s. Pics Ag 3d (5/2) et Ag 3d (3/2) ~368,5 et 374,5 eV (Fig. 4b). Écart énergie 6,0 eV = formation Ag NPs [28,29].

a Spectre UV-Vis Ag NPs, b Photo Ag NPs synthétisées, c Diagramme DRX Ag NPs, d Spectre FTIR Ag NPs et extrait levure.

a Balayage complet spectre XPS Ag NPs, b Spectre Ag 3d XPS.

Charge surface Ag NPs déterminée Malvern Zeta Nano ZS-90, paramètre important stabilité/dispersion solutions colloïdales. Potentiel zêta = potentiel électrostatique surface frontière couche diffuse/couche compacte, indicateur applications polymères biomédicaux [30]. Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1 : pH 3 → zêta Ag NPs légèrement négatif (−3,2 mV). Zêta diminue monotone −12,1 mV pH 7,0 → −24,4 mV pH 11,0 → groupes chargés négativement surface Ag NPs. Gao et al. : dispersion/stabilité Ag NPs attribuée charge surface [31]. Groupes chargés négativement → stabilité/dispersion améliorées solutions aqueuses [32].

Cytotoxicité Ag NPs et analyse biomolécules

Biocompatibilité Ag NPs synthétisées importante applications biomédicales futures. Cytotoxicité Ag NPs : viabilité cellules Cos-7 test MTS. Cellules Cos-7 incubées Ag NPs différentes concentrations 24 h. Figure 5a : aucune cytotoxicité significative concentrations ≤200 µg/ml. Conclusion : Ag NPs cytotoxicité négligeable, bonne biocompatibilité cellules Cos-7.

a Cytotoxicité Ag NPs cellules Cos-7, b Analyse SDS-PAGE. Ligne 1 : contrôle tampon chargement. Lignes 2–4 : Ag NPs synthétisées. Ligne 5 : extrait levure centrifugé 8000 tr/min.

Explorer mécanismes synthèse Ag NPs : analyse biomolécules surface Ag NPs et extrait levure. Figure 5b : SDS-PAGE → aucune protéine détectable ou marginale surface Ag NPs synthétisées ou extrait levure. Détermination biomolécules extrait levure analyseur acides aminés haute vitesse. Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1 : ~22 acides aminés extrait levure, riches acide glutamique, acide γ-aminobutyrique, ornithine, acide alpha-linolénique. Point isoélectrique ~6, sauf lysine/arginine ~10-11. Composants variés −NH₂ : urée, ammoniaque, asparagine, glutamine. Biomolécules acides aminés réducteurs, acide alpha-linolénique, glucides extrait levure → rôle significatif formation Ag NPs. Rapporté : réductase NADH-dépendante [33,34] ou enzyme nitrate réductase impliquée réduction [35-37] biosynthèse Ag NPs extrait microorganisme.

Biomolécules extrait levure rôle décisif formation Ag NPs : protection agrégation. Stabilisateurs biomolécules empêchent réactions redondantes entre Ag NPs [38]. Molécules amphotères acides aminés = groupes basiques/acides. Charge nette composés acides aminés = négative/positive selon pH solution extrait levure, affectant capacité liaison synthèse Ag NPs [39]. Solution alcaline : acides aminés surface Ag NPs charges nettes négatives → maximisent répulsion électrostatique [40-42]. Biomolécules extrait levure = agent capteur, rôle clé contrôle distribution taille, forme, morphologie formation Ag NPs. pH facteur important synthèse contrôlée Ag NPs. pH <7 → nucléation taux faible. Ag NPs formées quelques minutes pH élevé, taille particule diminue pH augmente. Équilibre optimal croissance/nucléation [43]. Ag NPs instables/agglomérées toujours présentes réduction pH extrêmes (>11) [44].

Activité antibactérienne

E. coli évaluée extensivement activité antimicrobienne Ag NPs. Croissance E. coli présence/absence Ag NPs prouve capacité antimicrobienne. Figure 6a : Ag NPs synthétisées activité antibactérienne significative manière concentration-dépendante contre E. coli. Test inhibition croissance : réduction complète E. coli concentrations Ag NPs >20,0 µg/ml vs contrôle négatif. Concentration inhibitrice moitié (EC₅₀) = 13,4 µg/ml. Dose 20,0 µg/ml Ag NPs effet antibactérien significatif E. coli tout temps testé, 10,0 µg/ml effet inhibiteur partiel (Fig. 6b).

a Inhibition croissance E. coli, b Analyse cinétique effet antibactérien.

Investiguer si Ag NPs affectent vraiment cellules bactériennes résistantes antibiotiques : activité antibactérienne Ag NPs contre E. coli résistant ampicilline par test UFC. E. coli-Amp⁺ exprime stablement haut nombre copies plasmide pcDNA3.4 gène β-lactamase conférant résistance ampicilline [45]. Cellules E. coli-Amp⁺ cultivées gélose LB traitement ampicilline seule ou combiné Ag NPs. Activité inhibitrice Ag NPs préparées Fig. 7. Noté : Ag NPs traitement combiné ampicilline → activité antibactérienne supérieure ampicilline seule. En contraste, traitement ampicilline seule = aucune activité inhibitrice E. coli-Amp⁺. Thérapie combinée antibiotiques + Ag NPs = stratégie complémentaire surmonter cellules bactériennes résistantes, améliorant approches thérapeutiques actuelles. Résultats globaux contribuent développement inhibiteurs antibactériens alternatifs traiter infections souches multirésistantes.

Croissance E. coli-Amp⁺ traitement ampicilline seule (50 µg/ml) ou combinaison Ag NPs (25 µg/ml). a Haute densité, b Faible densité cellules E. coli-Amp⁺.

Besoin grand nouveaux médicaments mécanismes différents combattre résistance bactérienne. Ag NPs utilisés produits médicaux, soins personnels, textiles pour activité antimicrobienne puissante. Multiples mécanismes Ag NPs combattent résistance microbienne [46]. Ag NPs s'accumulent surface membrane bactérienne, augmentent perméabilité paroi cellulaire. Interaction Ag NPs/peptidoglycane change configuration peptidoglycane → dommage membrane bactérienne [47]. Caractéristiques forme, structure surface, morphologie, dispersité, biocompatibilité Ag NPs → rôle significatif activité antimicrobienne.

Conclusions

Nouvelle méthode biosynthétique préparation Ag NPs utilisant extrait levure. Micelles levure formées mélange solution Ag⁺ + extrait levure. Biomolécules bioréductrices rôle majeur réduction Ag⁺. Biomolécules assurent stabilité favorable, monodispersité, distribution taille contrôlée Ag NPs synthétisées, stabilité >1 an sans précipitation. Analyse acides aminés haute vitesse : extrait levure riche biomolécules : acides aminés, acide alpha-linolénique, acide aminobutyrique. Ag NPs activité antibactérienne significative concentration-dépendante E. coli. Inhibition croissance : réduction complète E. coli concentrations >20,0 µg/ml. Ag NPs traitement combiné ampicilline → activité antibactérienne supérieure ampicilline seule contre E. coli-Amp⁺. Revêtements surface Ag NPs augmentent affinité membrane bactérienne, perméabilité paroi cellulaire. Interaction Ag NPs/peptidoglycane change configuration peptidoglycane → apoptose bactéries. De plus, Ag NPs stabilisées biomolécules = cytotoxicité faible, bonne biocompatibilité cellules Cos-7.

Disponibilité des données et matériaux

Jeux de données soutenant conclusions étude actuelle disponibles auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Abréviations

Ag NPs :

Nanoparticules d'argent

DMEM :

Milieu modifié Dulbecco Eagle

E. coli :

Escherichia coli

EDS :

Spectromètre dispersion énergie

FBS :

Sérum bovin fœtal

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HRTEM :

MET haute résolution

LB :

Luria-Bertani

SAED :

Diffraction zone sélectionnée

MEB :

Microscopie électronique à balayage

MET :

Microscopie électronique en transmission

UV-Vis :

Ultraviolet-visible

DRX :

Diffraction rayons X poudre