Nanocomposites à base d'oxyde de graphène décorés de nanoparticules d'argent en tant qu'agent antibactérien

Contexte

Le développement des antibiotiques a joué un rôle important dans le contrôle du nombre d'infections bactériennes. Cependant, l'utilisation inappropriée et la surutilisation des antibiotiques ont conduit au développement d'une multirésistance aux médicaments chez de nombreuses espèces bactériennes. Certaines souches sont devenues résistantes à pratiquement tous les agents couramment disponibles :les bêta-lactamines, les tétracyclines et les aminosides [1]. Les principaux agents pathogènes résistants sont les Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline. , Entérocoque résistant à la vancomycine , et Klebsiella pneumoniae produisant des -lactamases à spectre étendu et Escherichia coli [2, 3]. Les bactéries, avec leurs très grandes populations et leur temps de prolifération rapide, sont capables de développer rapidement des mécanismes de résistance aux antibiotiques lorsqu'un sous-ensemble de la population bactérienne survit au traitement antibiotique. De plus, les bactéries résistantes aux antibiotiques sont capables de transférer des copies d'ADN qui codent pour un mécanisme de résistance à d'autres bactéries apparentées à distance, qui sont alors capables de transmettre les gènes de résistance aux générations suivantes. Ainsi, l'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques représente un problème sérieux qui pourrait être surmonté par le développement de nouveaux agents antimicrobiens. Les agents antibactériens sont très importants dans l'industrie textile, la désinfection de l'eau, la médecine et l'emballage alimentaire. Les nanoparticules et les nanomatériaux peuvent être utilisés comme alternative aux antibiotiques [4]. Le mécanisme de l'activité antibactérienne des nanoparticules varie selon les différents types de nanoparticules. Alors que certains mécanismes proposés concernent la structure physicochimique des nanoparticules, d'autres concernent la libération accrue d'ions antibactériens à partir des surfaces des nanoparticules. De multiples mécanismes d'action simultanés contre les microbes nécessiteraient une variété de mutations synchrones de l'ADN dans la même cellule microbienne pour le développement de la résistance; par conséquent, il est difficile pour les cellules bactériennes de devenir résistantes aux nanoparticules et aux nanomatériaux. Les nanomatériaux antimicrobiens, tels que l'argent, le cuivre, les fullerènes et les nanotubes de carbone à paroi simple, peuvent offrir plusieurs avantages en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques et de leurs surfaces élevées [5,6,7,8]. Les mécanismes exacts de la toxicité des nanoparticules (NP) contre diverses bactéries ne sont pas complètement compris. Selon les recherches actuelles, les principaux processus sous-jacents aux effets antibactériens des NP sont la perturbation de la membrane cellulaire bactérienne, la libération d'ions métalliques, la génération de ROS, la pénétration de la membrane cellulaire bactérienne et l'induction d'effets antibactériens intracellulaires, y compris les interactions avec l'ADN et protéines [9, 10]. Les NP sont capables de se fixer à la membrane des bactéries par interaction électrostatique et de perturber l'intégrité de la membrane bactérienne. La charge positive de la surface des NPs est essentielle pour l'adhésion. La charge positive permet une addition électrostatique entre les NP et la membrane cellulaire chargée négativement des micro-organismes [11]. La connexion électrostatique entre les NP et les protéines contenant du soufre présentes à la surface des cellules bactériennes provoque des changements irréversibles dans la structure de la paroi cellulaire entraînant des dommages à la paroi cellulaire et à la membrane [12]. La membrane bactérienne est cruciale, quel que soit le statut métabolique de la cellule, car elle fournit une perméabilité sélective pour l'homéostasie cellulaire et la transduction de l'énergie métabolique. La deuxième activité antibactérienne et antifongique des NP est due à leur capacité à produire des ROS et des espèces de radicaux libres [13]. Augmentation du niveau d'hyperoxydation induite par les ROS des lipides, des protéines et de l'ADN [14].

De plus, les structures de nombreux types de NP sont adaptées au transport d'agents antimicrobiens [15, 16]. Les vecteurs peuvent aider à protéger les médicaments de la résistance des bactéries cibles. Un système d'administration de médicaments à base de nanoparticules peut aider à cibler les antibiotiques sur un site d'infection et ainsi minimiser les effets secondaires systémiques. D'autres avantages incluent une meilleure solubilité des médicaments hydrophobes, un temps de circulation systémique et une demi-vie prolongés du médicament, et une libération prolongée du médicament [4].

Récemment, il a été démontré que le graphène, un nouvel allotrope du carbone, a une activité antibactérienne. Le graphène est un matériau composé d'atomes de carbone qui sont liés ensemble dans un motif répétitif d'hexagones. Une caractéristique unique des flocons de graphène est le rapport de son épaisseur à la surface. La surface du graphène est recouverte d'un nuage d'électrons, ce qui prédispose probablement ce matériau à être un donneur d'électrons et lui donne la capacité de faire des liaisons spéciales. Les bords du graphène ont d'autres liaisons (caractéristique des liaisons de type diamant sp3), et ces endroits peuvent avoir des caractéristiques physico-chimiques différentes [17]. Ces caractéristiques suggèrent que le graphène peut être exposé à une adhérence plastique à différentes structures intercellulaires, y compris des cellules bactériennes [18,19,20]. De plus, comme il a deux côtés actifs (surface et bords), le graphène peut attacher des molécules biologiques à ses bords et adhérer à la surface cellulaire. Une forme oxydée de graphène, l'oxyde de graphène (GO), est facilement dispersible dans l'eau et d'autres solvants organiques en raison de la présence des fonctionnalités d'oxygène. Les groupes oxygénés permettent la fonctionnalisation chimique simple des feuilles GO via des interactions covalentes et non covalentes. La forte activité antibactérienne de GO a été rapportée. L'activité antibactérienne de GO a été attribuée au stress membranaire induit par les bords tranchants des nanofeuillets d'oxyde de graphène, ce qui peut entraîner des dommages physiques aux membranes cellulaires, entraînant la perte de l'intégrité de la membrane bactérienne [21]. Récemment, des nanoparticules antimicrobiennes fonctionnalisées au graphène ont été utilisées comme matériaux antibactériens prometteurs [22, 23]. Les nanocomposites peuvent surmonter les limitations des composants individuels. Par exemple, les nanomatériaux antibactériens attachés au substrat de graphène sont plus stables et bien dispersés [24]. Ces nanocomposites pourraient contenir des métaux, des oxydes métalliques et des polymères.

L'une des méthodes les plus prometteuses contre les bactéries résistantes aux médicaments peut être des matériaux modifiés en surface avec des nanoparticules biocides. Les technologies à ultrasons ont été confirmées comme une méthode efficace de revêtement de divers matériaux avec des substances antibactériennes et fongicides [25,26,27,28]. De nombreux chercheurs classent la méthode par ultrasons comme une « technologie verte » [29, 30]. La méthode est basée sur l'utilisation de phénomènes de cavitation, qui sont la formation, la croissance et l'effondrement de bulles de cavitation dans le milieu liquide [31, 32]. L'implosion des bulles génère d'immenses quantités d'énergie dans des microrégions jusqu'à 5000 K et une pression jusqu'à 2000 atm en peu de temps [33, 34]. Par conséquent, des ondes de choc et des microjets dirigés vers la surface solide sont générés [35]. Situées dans un milieu liquide, les NP sont entraînées par l'effet d'implosion et des jets à grande vitesse (> 100 m/s) sur la surface du solide et forment une couche [36]. La cavitation acoustique peut également entraîner une modification des propriétés physiques des objets soniqués, par exemple le redimensionnement des flocons GO [37, 38].

Nous avons obtenu des résultats prometteurs dans nos études précédentes avec Salmonella enterica et Listeria monocytogenes traité avec du graphène vierge, GO et GO réduit [20]. Parmi les différents types de graphène, GO s'est également avéré avoir l'activité antibactérienne la plus élevée à faible concentration. Les cellules bactériennes étaient réparties sur toute la surface du GO. Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que le GO décoré de nanoparticules d'argent (GO-Ag) aura une influence toxique plus forte sur les cellules microbiennes que le GO nu ou les nanoparticules d'argent (Ag-NP). Parce qu'il a deux côtés actifs (surface et bords), l'oxyde GO peut attacher les Ag-NP aux bords et adhérer à la surface de la cellule. L'activité antibactérienne des nanocomposites à base de graphène peut être due à la perturbation de la membrane cellulaire et au stress oxydatif. L'objectif de cette étude était d'évaluer l'activité antimicrobienne de nanocomposites à base de GO décorés avec des Ag-NPs par rapport aux GO et Ag-NPs nus en utilisant des bactéries gram-négatives (Escherichia coli ), bactéries à Gram positif (Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis ), et les levures pathogènes (Candida albicans ) en utilisant un modèle in vitro. L'enquête a consisté en une analyse structurelle de nanocomposites utilisant la diffraction des rayons X, la transmission par spectroscopie Raman, le FT-IR, la microscopie électronique (MET), la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie à force atomique (AFM), l'évaluation de la morphologie des cellules microbiennes, l'évaluation de viabilité cellulaire par dosage PrestoBlue™, étude de l'intégrité de la membrane cellulaire par dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) et évaluation de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS).

Méthodes

Synthèse, modification et caractérisation de l'oxyde de graphène

Dans cette étude, une poudre de graphite disponible dans le commerce (Acros Organics, New Jersey, USA) a été oxydée par la méthode de Hummers modifiée [39]. Dix grammes de poudre de graphite ont été mélangés avec 230 mL d'acide sulfurique concentré (98 %) en dessous de 10 °C. Ensuite, 4,7 g de nitrate de sodium et 30 g de permanganate de potassium ont été ajoutés progressivement au mélange d'acide sulfurique et de graphite tout en maintenant la température en dessous de 10°C. Ensuite, le mélange a été chauffé à 30°C et agité pendant 2 heures. Dans l'étape suivante, 100 mL d'eau ont été ajoutés et la température du mélange a atteint ~ 100 °C. Enfin, le mélange a été traité avec 10 ml de peroxyde d'hydrogène. Pour la purification, la suspension a été filtrée et lavée avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que le pH du filtrat atteigne 6,5.

Les diagrammes de diffraction des rayons X de GO ont été recueillis à température ambiante dans la plage de 2 angles thêta de 10° à 100° avec le pas de 0,02° en utilisant le diffractomètre à poudre à rayons X (CuK _α1 ) (X'Pert PRO, PANalytical, Almelo, Pays-Bas).

L'analyse des teneurs pondérales en carbone, hydrogène, azote et soufre dans GO a été réalisée à l'aide de l'appareil Vario EL III produit par Elementar Analysensysteme GmbH (Langenselbold, Allemagne). Avant d'effectuer des mesures d'analyses chimiques de GO, les échantillons ont été soumis à une désorption de 24 h dans une station de désorption (VcPrep 061, Micromeritics, Norcross, GA, USA) sous vide (0,05 mbar) à 50 °C. La teneur en oxygène a été calculée en soustrayant les teneurs déterminées en carbone, hydrogène, azote et soufre de 100 % du poids.

La spectroscopie Raman a été réalisée à l'aide d'un microscope inVia Raman (Renishaw, Royaume-Uni). L'oxyde de graphène a été analysé avec la longueur d'onde laser de 514 nm avec les 5% de sa puissance initiale. Les spectres ont été collectés à partir de cinq points différents sur l'échantillon. Le temps d'exposition était de 10 s et deux scans ont été collectés.

Les mesures FT-IR ont été effectuées à l'aide du spectromètre Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, USA) en mode de réflectance totale atténuée sur un cristal de diamant. Cinq microlitres de suspension aqueuse d'oxyde de graphène ont été versés goutte à goutte sur la surface du cristal de diamant et ont été laissés à sécher. Après séchage, le spectre a été collecté dans la plage 400-4000 cm ⁻¹ .

Les mesures de la taille moyenne des particules et du potentiel zêta ont été effectuées à l'aide du Zetasizer Nano-ZS ZEN 3600 produit par Malvern Instruments Ltd. (Malvern, Royaume-Uni) en utilisant le mode de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et l'électrophorèse laser Doppler, respectivement, à température ambiante (23 ° C).

Analyse TEM/SEM/AFM des nanomatériaux

La morphologie des poudres et des feuilles a été déterminée à l'aide du microscope électronique à transmission (TEM ; JEM-1220 JEOL, Tokyo, Japon, tension d'accélération de 80 kV) et du microscope électronique à balayage (SEM ; Zeiss, Ultra Plus, Oberkochen, Allemagne). Des échantillons pour les observations MET ont été préparés en plaçant des gouttelettes d'hydrocolloïdes sur des grilles MET (Formvar sur 3 mm 200 Mesh Cu Grids, Agar Scientific, Stansted, Royaume-Uni). Immédiatement après le séchage à l'air des gouttelettes, les grilles ont été insérées dans le microscope.

Pour l'analyse SEM, les échantillons ont été recouverts d'une fine couche de carbone à l'aide d'un pulvérisateur (SCD 005/CEA 035, BAL-TEC, Pfäffikon, Suisse). Une procédure de mesure interne en laboratoire a été appliquée (P5.10, édition 6 du 26.08.2015).

L'imagerie AFM (microscopie à force atomique) a été réalisée à l'aide du logiciel Asylum Research MFP3D Bio (version :Asylum Research MFP3D 15.106.09). L'imagerie de la topographie de surface et la détection de GO sur les surfaces de feuille testées ont été réalisées à l'aide de deux modes d'imagerie, le mode AC pour l'imagerie à contraste de phase et la microscopie à force latérale (LFM) pour la détection de GO, car GO réduit les forces de friction [40].

Préparation de feuilles de polyuréthane revêtues de GO et Ag-NPs

Pour recouvrir les feuilles de polyuréthane, des suspensions d'Ag-NPs (HydroSilver1000, Amepox, Łódź, Pologne) et GO ont été utilisées. Les suspensions de GO, Ag-NPs et GO-Ag (GO (200 μg/mL), Ag-NPs (100 μg/mL), GO (200 μg/mL) + Ag-NPs (100 μg/mL)) ont été préparé dans de l'eau déionisée (conductance 0,09 μS/cm, déioniseur :HLP 20UV, Hydrolab, Staszyn, Pologne). Les suspensions ont été utilisées sans purification ni filtration supplémentaires.

Le revêtement par ultrasons de feuilles de polyuréthane (15 × 15 × 0,05 mm) a eu lieu dans un flacon en verre d'un volume de 50 ml. Des échantillons de feuille ont été fixés sur un support (Teflon) et subséquemment immergés dans les suspensions préparées. Le processus de revêtement a été effectué à l'aide d'un cornet à ultrasons (corne Ti, Ø13 mm, 60 % d'efficacité, 20 kHz, Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA) placé à l'aplomb des échantillons de feuille présents dans la suspension. La température du processus était de 30 ± 1 °C. Les échantillons couverts ont été rincés dans de l'eau déminéralisée et séchés dans une chambre laminaire puis emballés dans des emballages stériles.

Énergie sans surface

Des tests de mouillabilité ont été effectués à l'aide du goniomètre Data Physics OCA – 20 (DataPhysics Instruments GmbH, Filderstadt, Allemagne). L'énergie libre de surface (SFE) a été calculée à l'aide de la méthode d'Owens, Wendt, Rabel et Kaelble (OWRK) en utilisant deux liquides d'essai :de l'eau déminéralisée et du diiodométhane [41].

Culture et préparation des bactéries et levures

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) et Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Escherichia coli (ATCC 25922), et Candida albicans (90028) ont été obtenus auprès de LGC Standards (Lomianki, Pologne). Les souches ont été stockées sous forme de suspensions de spores dans 20 % (v /v ) glycérol à - 20 °C. Avant leur utilisation expérimentale, les souches ont été décongelées et le glycérol a été éliminé en lavant les cellules bactériennes avec de l'eau distillée. Les bactéries et levures ont ensuite été cultivées sur les milieux nutritifs suivants :gélose tryptique soja pour S . aureus et E . coli , gélose cerveau-cœur pour S . épiderme , et gélose de Sabouraud pour C . albicans (Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne). Les bactéries et levures cultivées sur des plaques de gélose ont été récoltées en lavant doucement les plaques avec une solution saline distillée stérile. Pour calculer le nombre de bactéries dans la suspension cellulaire, la densité optique des suspensions à 600 nm (DO₆₀₀ ) a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). Les courbes d'étalonnage pour chacun des micro-organismes ont été préparées en effectuant des dilutions en série au dixième (jusqu'à 10 ^− 5 ) de suspensions bactériennes et de levure de densité optique connue. Un millilitre de chaque dilution a été étalé sur des boîtes de Pétri contenant le milieu nutritif. Après 24 h d'incubation à 37 °C, le nombre de colonies formées sur les boîtes de Pétri a été dénombré. Sur la base des résultats des dénombrements (réalisés en triple), la densité de la suspension bactérienne d'origine en unités formant colonie (UFC)/mL a été calculée.

Dosage antimicrobien

L'inoculum pour le dosage antibactérien a été préparé à partir d'organismes en croissance active (phase logarithmique). Les inoculums de tous les micro-organismes ont été préparés à partir d'une culture d'une nuit cultivée en aérobie dans un bouillon Mueller-Hinton (MH) à 37 °C. La concentration en bactéries et levures a été déterminée en mesurant la densité optique à 600 nm (DO₆₀₀ ). Brièvement, des suspensions bactériennes et de levure ont été préparées à partir de cultures d'une nuit et ajustées à 10 ⁶ UFC/ml. L'inoculum a été inoculé uniformément sur la surface de la gélose MH dans des boîtes de Pétri par écouvillonnage. Des feuilles stériles recouvertes de GO, Ag-NPs et GO-Ag ont été déposées sur la surface de la gélose. Des feuilles sans nanoparticules ont été utilisées comme groupe témoin. La croissance des bactéries et levures sous les foils a été mesurée après 24 h d'incubation à 37 °C.

Test de viabilité

La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du test de viabilité cellulaire PrestoBlue™ (Life Technologies, Taastrup, Danemark). Le réactif PrestoBlue™ est rapidement réduit par les cellules métaboliquement actives, fournissant une mesure quantitative de la viabilité et de la cytotoxicité. Les cellules bactériennes et de levure ont été cultivées sur des feuilles recouvertes de GO, Ag-NPs et GO-Ag situées sur des inserts insérés dans des plaques à 6 puits (200 μL de bouillon MH avec 5 × 10 ³ cellules par feuille) et incubé pendant 24 h. Dans l'étape suivante, 90 μL de chaque échantillon ont été transférés dans des plaques à 96 puits et 10 μL de réactif PrestoBlue™ ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 h supplémentaires à 37 °C. La densité optique de chaque puits a été enregistrée à 570 nm sur un lecteur ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent assay) (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage (OD_test − OD_vide )/(OD_contrôle − OD_vide )×100 %, où OD_test est la densité optique des cellules exposées aux feuilles testées, OD_contrôle est la densité optique de l'échantillon de contrôle, et OD_blanc est la densité optique des puits sans cellules bactériennes et de levure.

Intégrité de la membrane

Un test LDH (In Vitro Toxicology Assay Assay Kit, basé sur la lactique déshydrogénase, Sigma-Aldrich, Hambourg, Allemagne) a été utilisé pour évaluer l'intégrité de la membrane cellulaire. Le NAD réduit résultant (NADH ⁺ ) a été utilisé dans la conversion stoechiométrique d'un colorant tétrazolium. Lorsque des aliquotes acellulaires du milieu des cultures ont été dosées, la quantité d'activité LDH pourrait être utilisée comme indicateur de l'intégrité de la membrane. Si la membrane était endommagée, des molécules de LDH intracellulaires étaient libérées dans le milieu de culture. Les cellules bactériennes et de levure ont été cultivées sur des feuilles (GO, Ag-NPs et GO-Ag) situées sur des inserts insérés dans des plaques à 6 puits (200 μL de bouillon MH avec 5 × 10 ³ cellules par feuille) et incubé pendant 24 h. Des cellules cultivées sur papier d'aluminium sans nanoparticules ont été utilisées comme contrôle. Après ce temps, les échantillons ont été transférés dans des tubes de microcentrifugation et centrifugés à 1200 tr/min pendant 5 min. Cent microlitres de surnageant ont été transférés dans des plaques à 96 puits et 100 μL du mélange de dosage de LDH ont été ajoutés à chaque puits. La plaque a été couverte et incubée pendant 30 minutes à température ambiante. La densité optique de chaque puits a été enregistrée à 450 nm sur un lecteur ELISA (Infinite M200, Tecan, Männedorf, Suisse). La fuite de LDH a été exprimée en pourcentage {(OD_test − OD_vide ) − (OD_contrôle − OD_vide )/(OD_contrôle − OD_vide )}×100 %, où OD_test est la densité optique des cellules exposées aux feuilles testées, OD_contrôle est la densité optique de l'échantillon de contrôle, et OD_blanc est la densité optique des puits sans cellules.

Analyse SEM des micro-organismes

Avant l'analyse SEM, des échantillons de bactéries et de levures incubées sur des feuilles avec GO-Ag et des bactéries non traitées ont été préparés. Brièvement, une goutte de culture bactérienne et de levure (10 ⁶ CFU/ml) a été incubée sur des feuilles avec un nanocomposite GO-Ag, ou des bactéries non traitées ont été déposées sur la surface d'un verre de couverture stérile et incubées pendant 24 h à 37 °C à l'intérieur d'une boîte de Pétri vide. Tous les échantillons ont été séchés et recouverts d'or. Enfin, les échantillons ont été imagés au MEB (FEI Quanta 200, Tokyo, Japon) à une tension d'accélération de 15 kV.

Production ROS

La production de ROS a été évaluée à l'aide du DCFDA, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni). Le DCFDA utilise le réactif de perméation cellulaire 2′,7′–diacétate de dichlorofluorescéine, un colorant fluorogène qui mesure les activités hydroxyle, peroxyle et autres ROS au sein de la cellule. Après diffusion dans la cellule, le DCFDA est désacétylé par les estérases cellulaires en un composé non fluorescent, qui est ensuite oxydé par les ROS en 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF). Les cellules bactériennes et de levure ont été cultivées sur des feuilles (GO, Ag-NPs et GO-Ag) situées sur des inserts insérés dans des plaques à 6 puits (200 μL de bouillon MH avec 5 × 10 ³ cellules par feuille) et incubé pendant 24 h. Des cellules cultivées sur papier d'aluminium sans nanoparticules ont été utilisées comme contrôle. Après ce temps, les échantillons ont été transférés dans des tubes de microcentrifugation et centrifugés à 1200 tr/min pendant 5 min. Cent microlitres de surnageant ont été transférés dans des plaques à 96 puits, et 100 μL de DCFDA dilué ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 45 min supplémentaires à 37 °C dans l'obscurité. La production de DCF a été mesurée par spectroscopie de fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation à 485 nm et une longueur d'onde d'émission à 535 nm sur un lecteur ELISA (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA).

Résultats

Caractéristiques des GO et Ag-NPs

L'analyse chimique a révélé la présence d'azote, de carbone, de soufre, d'hydrogène et d'oxygène (tableau 1).

L'analyse de phase de l'échantillon GO (Fig. 1) a révélé la présence d'impuretés provenant de traces de graphite, de nitrate de sodium et probablement d'une forme réduite d'oxyde de graphène.

Diagrammes de diffraction des rayons X des poudres GO. L'analyse de phase de l'échantillon GO a révélé la présence d'impuretés provenant de traces de graphite, de nitrate de sodium et probablement d'une forme réduite d'oxyde de graphène

La spectroscopie Raman peut donner des informations sur les caractéristiques structurelles de l'oxyde de graphène. La bande D est attribuée au désordre structurel, tandis que la bande G provient de l'étirement de la liaison du carbone sp ² atomes [42]. Les bandes supplémentaires (dont D′, 2D et D + G) proviennent des défauts présents dans la structure graphitique du matériau carboné. Je _D /Je _G (calculé à partir de l'intensité des bandes D et G) peut être utilisé pour caractériser le désordre de la structure graphitique dans les matériaux carbonés. Comme on peut le voir sur la figure 2, GO a une structure très désordonnée en raison de nombreux groupes fonctionnels dans la structure formés lors de l'oxydation de la poudre de graphite. La position de la bande D est de 1351 cm ⁻¹ et la bande G 1590 cm ⁻¹ ; le je _D /Je _G le rapport est de 1,15.

Spectre Raman de l'oxyde de graphène avec déconvolution proposée des bandes D, G, D′, 2D et D + G. GO a une structure très désordonnée en raison de nombreux groupes fonctionnels dans la structure formés lors de l'oxydation de la poudre de graphite. La position de la bande D est de 1351 cm ⁻¹ et la bande G 1590 cm ⁻¹ ; le je _D /Je _G le rapport est de 1,15

Le spectre FT-IR de l'oxyde de graphène collecté en mode ATR a révélé que GO possède de nombreux groupes fonctionnels présents dans la structure. Le pic le plus notable peut être observé à ~ 3 500 cm ⁻¹ , qui est attribué principalement à l'eau et aux groupes hydroxyle (Fig. 3). Un pic très intense autour de 1080 cm ⁻¹ peut également être attribué à des groupes hydroxyle. Le pic vers 1600 cm ⁻¹ est généralement attribué aux liaisons C=C présentes dans le carbone graphitique. Cependant, nos précédentes études XPS montrent qu'il existe quelques liaisons C=C dans l'oxyde de graphène [43]; par conséquent, nous attribuons ce pic à principalement de l'eau encore présente dans l'oxyde de graphène. D'autres pics observés sur le spectre FT-IR montrent que GO est riche en groupes contenant des liaisons C=O (principalement des groupes carboxyle), pic vers 1720 cm ⁻¹ , époxy (C–O–C) avec le pic visible à environ 1200 cm ⁻¹ , et liaisons C–H (pic autour de 2 800 cm ⁻¹ ). L'analyse FT-IR est en bon accord avec les mesures XPS effectuées pour l'oxyde de graphène où des groupes hydroxyle, carboxyle, époxy et carbonyle ont également été identifiés [44]. GO et GO après une homogénéisation par ultrasons de 10 min ont été comparés (Fig. 4 et 5), et de même, les Ag-NPs avec Ag-NPs après une homogénéisation par ultrasons de 10 min (Figs. 4 et 6) ont été comparés. Afin d'éviter des changements dans la morphologie des composés, tous les composés ont été rapidement refroidis avec de l'azote liquide et séchés dans un lyophilisateur. La figure 5a, b présente les flocons de GO, tandis que la figure 5c, d montre les effets des ultrasons sur les flocons de GO, qui subissent un repliement partiel et une fragmentation. La figure 6 montre également un effet similaire pour les Ag-NPs, où un changement de morphologie du matériau est visible. La figure 6a, b affiche le poly(alcool vinylique) séché, qui a été utilisé pour stabiliser la suspension aqueuse d'Ag-NPs. L'effet destructeur de l'homogénéisation par ultrasons était notable car la structure de l'alcool polyvinylique était décomposée en longues parties hétérogènes avec de petites ouvertures sphériques (Fig. 6c, d).

Spectre FT-IR (ATR, réflectance totale atténuée) de l'oxyde de graphène avec proposition d'affectation des groupes fonctionnels présents dans GO. Les pics les plus notables ont été observés à ~ 3 500 cm ⁻¹ , (attribué à l'eau et aux groupes hydroxyle), ~ 1080 cm ⁻¹ (groupes hydroxyle), ~ 1600 cm ⁻¹ (attribué aux liaisons C=C présentes dans le carbone graphitique). D'autres pics observés sur le spectre FT-IR montrent que GO est riche en groupes contenant C=O (principalement des groupes carboxyles), pic vers 1720 cm ⁻¹ , époxy (C–O–C) avec le pic visible à environ 1200 cm ⁻¹ , et liaisons C–H (pic autour de 2 800 cm ⁻¹ )

Images MET de paillettes GO agglomérées (a ), GO flocons après traitement aux ultrasons (b ), Ag-NPs agglomérés (c ), Ag-NPs après traitement aux ultrasons (d ), et GO-Ag (e , f ). La diminution de la taille moyenne des particules de GO après traitement aux ultrasons a été causée par la défragmentation ou le repliement des flocons de GO. La diminution de la taille moyenne de l'Ag après traitement aux ultrasons a été causée par la défragmentation des agglomérats d'Ag. Remarque :Les flèches indiquent les Ag-NPs/agglomérats

Comparaison de la morphologie des paillettes GO lyophilisées (a , b ) et GO flocons après traitement aux ultrasons (c , d ) par microscopie électronique à balayage. La diminution de la taille moyenne des particules de GO après traitement aux ultrasons a été causée par la défragmentation ou le pliage des flocons de GO

Comparaison de la morphologie du mélange Ag-NP lyophilisé (a , b ) et mélange Ag-NP après traitement aux ultrasons (c , d ) par microscopie électronique à balayage

Taille moyenne et potentiel Zeta

Les résultats de la taille moyenne des particules/agglomérats dans les suspensions aqueuses sont présentés dans le tableau 2. Des analyses de taille moyenne ont été effectuées pour les suspensions concentrées qui n'ont pas été soumises à une homogénéisation par ultrasons (telle que reçue) et pour les suspensions diluées. Les suspensions diluées avant le test ont été soumises à une homogénéisation par ultrasons, avec des paramètres d'homogénéisation identiques à ceux utilisés lors du revêtement par ultrasons de la feuille avec des couches de nanomatériaux (Ag-NPs, GO). Pour la suspension Ag-NP, l'action des ultrasons a provoqué une augmentation de la taille moyenne des particules de 80 à 218 nm. La principale cause de l'augmentation de la taille moyenne des particules après homogénéisation par ultrasons dans la suspension (en dehors du processus d'agglomération Ag-NP) était que les Ag-NP étaient entraînés dans le poly(alcool vinylique) qui a été utilisé pour la stabilisation de la suspension. The large standard deviation of the Ag-NP sample homogenized by ultrasound resulted from the presence of both loose Ag-NPs and Ag-NPs driven into the poly(vinyl alcohol) in the suspension. In the case of GO suspension, the average particle size of the sample subject to ultrasonic homogenization was 263 nm and was ca 7.7 times smaller than the average particle size of the sample that was not subject to homogenization. The obtained results are convergent with the SEM tests (Fig. 5), which show the destructive effect of ultrasounds on GO flakes. The decrease of the average GO particle size was caused by defragmentation or folding of the GO flakes. However, it should be emphasized that the results of the average particle size of GO suspension samples involve an error related to the nanomaterial shape. The results obtained by the DLS method are a hydrodynamic average that is calculated based on the shape of a sphere that has the same diffusion coefficient as the measured particles; however, the shape of GO was flakes, which was confirmed by SEM images.

Test results of the zeta potential analysis of samples are provided in Table 3. The zeta potential of Ag-NPs in a water suspension was merely − 5.9 mV, which resulted in a lack of electrostatic stability of the sample. The sample of Ag-NP suspension was stabilized sterically by preserving Ag-NP distances through poly(vinyl alcohol) addition, which prevented agglomeration/aggregation of Ag-NPs. The zeta potential of the GO suspension sample, in turn, was − 41 mV, which gave a moderate electrostatic stability to the sample. A moderate electrostatic stability of a sample is characterized by slow sedimentation with virtually negligible change of particle size in the period of declared fitness of the suspension. The zeta potential result of the mixture of Ag-NPs and GO was − 7.1 mV, which potentially means that during the action of the ultrasounds, the GO flakes were coated by poly(vinyl alcohol) and Ag-NPs. The obtained zeta potential result of the mixture of Ag-NPs and GO sample in the water suspension implied that electrostatic stability was not present.

Foil Characteristics

In order to determine the morphology of the created layers, four types of foil samples were compared (Fig. 7):pure polyurethane foil (A, B), GO-coated polyurethane foil (C, D), Ag-NP-coated polyurethane foil (E, F), and GO-Ag mixture-coated polyurethane foil (G, H).

Scanning electron microscopy images of a , b non-coated polyurethane foil with a smooth surface with single impurities; c , d foil coated with GO, the broken-down GO flakes deposited on the polyurethane foil surface; e , f foil coated with Ag-NPs on which grid structures composed of polyvinyl alcohol and Ag-NPs are observed; et g , h foil coated with GO-Ag, which was mixed under the influence of ultrasounds and deposited on the foil surface

Figure 7a, b shows an uncoated polyurethane foil with a smooth surface with single impurities. In Fig. 4c, d, the broken-down GO flakes deposited on the polyurethane foil surface are noticeable. Figure 7e, f shows the foil surface coated with Ag-NPs on which grid structures composed of polyvinyl alcohol and Ag-NPs are observable. Figure 7g, h presents a mixture of GO-Ag composition, which was mixed under the influence of ultrasounds and deposited on the foil surface.

AFM Analysis and Surface Free Energy

AFM and LFM were used to complement the information about the surface morphology investigated by SEM. The investigation confirmed evolution of surface morphology by sonication of the polyvinyl alcohol with Ag-NP, GO, and GO-Ag NP solutions on the foils. Pure polyurethane foil was used as a reference foil in relation to foils coated by the ultrasonic method. The images in Fig. 8 are the AFM phase contrast images made in AC; additionally, cross sections of the GO flakes are attached under the corresponding images. Figure 8a is an image of pure polyurethane film; Fig. 7b depicts the Ag-NP-coated film, where characteristic and homogeneous grid structures are observable, being similar to those in Fig. 8e, f. Figure 8c, d shows GO-Ag-NP-coated film. Figure 8e shows the surface of the foil almost entirely covered with GO flakes; the phase contrast image helps to observe these two phases, the darker area is GO and the lighter area is polymer foil. It was noticed that the morphology of the foils has changed after Ag-NP coating comparing to the not-coated foils. The GO-Ag-NP coating differs from the previous one because it contains also small amounts of GO flakes seen as small black spots on the image, as it was mentioned earlier. Figure 8f depicts magnification of one GO flake made in LFM. The reduced friction confirms that it is, in fact, a GO flake.

AFM phase contrast images and cross sections topographic images of graphene flakes:a non-coated foil polyurethane foil; b Ag-NPs coated foil where characteristic and homogeneous grid structures are observed; c , d GO-Ag-coated foil; e GO-coated foil, the surface of the foil almost entirely covered with GO flakes; the phase contrast image helps to observe these two phases, the darker area is GO and the lighter area is polymer foil; f LFM image of graphene flake. Red marks, area of cross section

The polar component for the GO-coated foil increased in relation to pure foil, from 2.3 ± 0.6 to 68.9 ± 2.8 mJ/m ² , while the dispersion component decreased from 34.4 ± 1.3 to 8.2 ± 1.2 mJ/m ² . SFE increased from 36.7 ± 1.4 to 77.0 ± 3.4 mJ/m ² . A similar effect was not observed on foil surfaces coated with Ag-NPs and GO-Ag mixture. SFE of foil samples coated with Ag-NPs and GO-Ag mixture does not differ statistically (Table 4).

Antibacterial Properties

The antibacterial activity of the different foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag were tested with E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans. Results showed that after co-incubation with bacteria at 37 °C for 24 h, foils inhibited the growth of all tested microorganisms but to various degrees. The maximum antibacterial effect against all tested microorganisms was with foil coated with the GO-Ag nanocomposite. The bacterial growth of the cells treated with foils coated with GO and Ag-NPs was slightly lower than that of cells in the control group whereas the growth of bacterial cells treated with foils coated with GO-Ag was greatly inhibited, 88.6% of E . coli , 79.6% of S . aureus , 76.5% of S . epidermidis , and 77.5% of C . albicans (Figs. 9, 10, and 11).

Antimicrobial properties of GO-Ag coated foils. The growth of E . coli (b , c ), S . aureus (c , d ), S . epidermidis (e , f ), and C . albicans (g –i ) colonies is reduced after co-incubation with GO-Ag-coated foils at 37 °C for 24 h. un Representative agar plate with GO-Ag-coated foils. Notes:Black arrows point to GO-Ag coated foils; arrowheads point to colonies of microorganisms

Morphology of microorganisms after co-incubation with GO-Ag-coated foils. Scanning electron microscopy images of bacteria and yeast in the control foils (a , c , e , g ) and foils coated with GO-Ag (b , d , f , h ) after incubation at 37 °C for 24 h. E . coli (un , b ), S . aureus (c , d ), S . epidermidis (e , f ), and C . albicans (g , h ) show decreased growth and deformed morphology after co-incubation with GO-Ag-coated foils

Foils coated with nanomaterials decrease E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans viability. Viability of bacteria and yeast after incubation on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h was assessed with Presto Blue assay. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–d) indicate significant differences between the concentrations (P  = 0.001); error bars are standard deviations

Membrane Integrity

In cases where the cell membrane is damaged, intracellular LDH molecules could be released into the culture medium. The LDH level outside the cells demonstrates the cell membrane integrity. Foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag disrupted cell membrane functionality and integrity with significant differences between control groups and the Ag-NPs and GO-Ag groups (Fig. 12). The highest disruption of cell membranes was observed in the GO-Ag groups, 66.3% of E . coli , 59.4% of S . aureus , 54.8% of S . epidermidis , and 48.5% of C . albicans .

Foils coated with nanomaterials decreased E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans membrane integrity. Membrane integrity of bacteria and yeast after incubation on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h was assessed with LDH assay. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–c) indicate significant differences between the concentrations (P  = 0.000); error bars are standard deviations

ROS Production

Low levels (or optimum levels) of ROS play an important role in signaling pathways. However, when ROS production increases and overwhelms the cellular antioxidant capacity, it can induce macromolecular damage (by reacting with DNA, proteins, and lipids) and disrupt thiol redox circuits. Foils coated with Ag-NPs and GO-Ag (P  < 0.05) increased the ROS production of all tested microorganisms compared to the control group. Foils coated with GO only increased the ROS production of C . albicans . The highest ROS production was observed in the GO-Ag group (Fig. 13).

Effect of foils coated with nanomaterials on the production of reactive oxygen species. E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans were cultured on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h. Production of reactive oxygen species was assessed with DCFDA, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–d) indicate significant differences between the concentrations (P  = 0.000); error bars are standard deviations

Discussion

The discovery of antibiotics, natural products produced by microorganisms that are able to prevent the growth of bacteria and thus cure infectious diseases, revolutionized medical therapy; however, the overuse and misuse of antibiotics have been key factors contributing to antibiotic resistance. Now, the era of antibiotics is coming to an end, and new antibacterial agents are needed. In recent years, studies have reported nanoparticles as a promising alternative to antibacterial reagents because of their antibacterial activity in several biomedical applications [19, 45]. Nanoparticles can be an effective way to control many pathogenic and antibiotic-resistant microorganisms. Among many metal nanoparticles, Ag-NPs have been intensely studied because of the distinct properties of their antibacterial activity [7]. Ag-NPs have been proved effective against over 650 microorganisms including bacteria (both gram-positive and negative), fungi, and viruses; however, the precise mechanism of antimicrobial action is not understood completely [46]. Ag-NP exposure to microorganisms could cause adhesion of nanoparticles to the peptidoglycan and the cell membrane [47], penetration inside the cell [48], induction of ROS [49], and damaging of intracellular structures [50]. However, bare Ag-NPs aggregate when they come into contact with bacteria; thus, they lose their active surface area and show weaker antibacterial activity [51]. To overcome this problem, nanocomposites composed of graphenic materials and Ag-NPs or other metal nanoparticles could be fabricated. GO with oxygen-containing functional groups is water soluble and therefore more biocompatible than pristine graphene. As a result, Ag-based GO nanocomposites may be used as antibacterial agents. However, the information about antimicrobial properties of graphene-based composites is limited, and mechanisms of toxicity or lack of toxicity are not fully explained.

The aim of this work was to study the action of graphene oxide-based nanocomposites decorated with Ag nanoparticles on S . aureus , S . epidermidis , E . coli , and C . albicans growth; membrane integrity; and ROS production. After co-incubation with the bacterial and yeast cells for 24 h, foils coated with GO-Ag nanocomposite inhibited the growth of all tested microorganisms with varying degrees, 88.6% of E . coli , 79.6% of S . aureus , 76.5% of S . epidermidis , and 77.5% of C . albicans . This action is most probably due to an increase in cell membrane and wall penetration by the nanoparticles. Some researchers suggest that the antimicrobial activity of graphene-based nanocomposites may be due to the disruption of cell membrane integrity and oxidative stress [52].

Foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag disrupted cell membrane functionality and integrity with significant differences between the control group and the Ag-NPs and GO-Ag groups. The highest disruption of cell membranes was observed in the GO-Ag groups, 66.3% of E . coli , 59.4% of S . aureus , 54.8% of S . epidermidis , and 48.5% of C . albicans . However, foils coated with bare Ag-NPs also disrupted cell membranes. It has been proposed that Ag-NPs are able to interact with bacterial membranes by increasing permeability and changing the structure of membranes, which finally leads to cell death [50]. Ag-NPs can cause direct damage to the bacterial cell membrane. Bacteria may be killed by the combined bactericidal effects of the released Ag ⁺ ions and Ag nanoparticles. Additionally, the antimicrobial potential of Ag-NPs is also influenced by the thickness of the cell wall of the microorganisms [53]. The wall of gram-positive cells contains a thick layer (20–80 nm) of peptidoglycan, which is attached to teichoic acids. In gram-negative bacteria, the cell wall comprises a thin (7–8 nm) peptidoglycan layer and contains an outer membrane. The thicker peptidoglycan layer in gram-positive bacteria, such as S . aureus et S . epidermidis , may explain why these bacteria are more resistant to the antibacterial effects of GO-Ag.

Many studies have sought to establish a mechanism of action of antibacterial activity exhibited by silver in both its colloidal and ionic form. A disruption of membrane functionality from an interaction between released Ag ⁺ ions and the cell membrane and extensive cell membrane damage caused by the formation of ROS ultimately causes damage to the cell due to oxidative stress. Additionally, Ag ⁺ ions could cause dysfunction of the respiratory electron transport chain by uncoupling it from oxidative phosphorylation by inhibiting respiratory chain enzymes [54]. Foils coated with Ag-NPs and GO-Ag increased the ROS production of all tested microorganisms compared to the control group. The biological targets are DNA, RNA, proteins, and lipids. Lipids are one major target during oxidative stress. Free radicals can directly attack polyunsaturated fatty acids in bacterial and yeast membranes and activate peroxidation of lipids. A fundamental effect of lipid peroxidation is a decrease in membrane fluidity, which can significantly disrupt membrane-bound proteins. DNA is also a main target. Mechanisms of DNA damage involve abstractions and addition reactions by free radicals leading to carbon-centered sugar radicals and OH- or H-adduct radicals of heterocyclic bases. The sugar moieties producing single- and double-strand breaks in the backbone, adducts of base and sugar groups, and cross-links to other molecules can block replication. Foils coated with GO increased the ROS production at very low levels. However, Hu et al. [55] demonstrated that GO had a detrimental effect on E . coli due to decreased production of ATP and increased ROS production. Zhao et al. [56] reported the antibacterial activity of GO and reduced GO. Also, Gurunathan et al. [57] presented that GO and reduced GO showed significant antibacterial activity in a concentration- and time-dependent manner. Their results demonstrated that oxidative stress is a key mechanism for the antibacterial activity of GO and reduced GO through ROS generation. Nanda et al. [53] reported the effect of cystamine-conjugated GO against E . coli , S . typhimurium , E . faecalis , and B . subtilis with ROS production and high antibacterial activity.

Kurantowicz et al. [20] confirmed that bacteria could adhere to the GO surface, which results in the highest antibacterial activity. GO is characterized by a high degree of oxygenated functional groups:carbonyl, carboxylate, and hydroxyl. We hypothesize that these groups can be attractive groups for bacterial and yeast attachment. These groups are present on a large range of nutrients (amino acids, fatty acids) which are commonly recognized by microorganisms. In the present study, foils coated with GO induced membrane disruption and ROS production at a lower level than the Ag-NP and Ag-GO groups; however, cell viability was decreased, which is likely connected to the smaller active surface of GO after ultrasonic modifications.

Conclusions

Ag-NPs, GO, and Ag-GO nanocomposites demonstrated the antibacterial activity that is stronger against gram-negative bacteria (E . coli ) versus gram-positive bacteria (S . aureus et S . epidermidis ) and yeast (C . albicans ). The results showed that the decoration of GO with Ag-NPs promotes a synergistic effect and reduces dramatically the concentrations required to inhibit all tested bacterial and yeast strains. The antimicrobial potential of Ag-GO is also influenced by the thickness of the cell wall of the microorganisms. The thicker peptidoglycan layer in gram-positive bacteria, such as S . aureus et S . epidermidis , may explain why these bacteria are more resistant to the antibacterial effects of GO-Ag. A disruption of membrane functionality from an interaction between released Ag nanoparticles/Ag ⁺ ions and the cell membrane and extensive cell membrane damage caused by the formation of ROS ultimately caused damage to the cell due to oxidative stress. In order to explain the mechanism of ROS production, additional studies are needed. Our research indicates the potential applicability of GO-Ag as an antimicrobial agent.

Abréviations

AFM :

Microscopie à force atomique

Ag-NPs:

Silver nanoparticles

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

GO :

Oxyde de graphène

GO-Ag:

Graphene oxide decorated with silver nanoparticles

LDE:

Laser Doppler electrophoresis

LDH:

Lactate dehydrogenase

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SEM :

Microscopie électronique à balayage

XRD :

Diffraction des rayons X