Nanoparticules bimetalliques Cu:Ag : Efficacité antibactérienne accrue contre les souches résistantes aux antibiotiques – Étude par ancrage moléculaire

Résumé

Cette étude évalue l'influence de diverses concentrations d'argent (Ag) au sein de nanoparticules bimetalliques Cu:Ag développées comme agents antibactériens prometteurs contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. Des nanoparticules Cu:Ag avec différents rapports de concentration en Ag (2,5 ; 5,0 ; 7,5 et 10 % en poids) dans une quantité fixe de Cu, notées 1:0,025, 1:0,050, 1:0,075 et 1:0,1, ont été synthétisées par coprécipitation en utilisant l'hydroxyde d'ammonium et l'eau déionisée comme solvant, le polyvinylpyrrolidone comme agent de coiffage, et l'hydrure de sodium et l'acide ascorbique comme agents réducteurs. Ces produits formulés ont été caractérisés par diverses techniques.

Introduction

Une variété de micro-organismes – bactéries, champignons, virus et parasites – sont présents dans l'environnement terrestre. Ils posent des problèmes dans la production et l'utilisation d'équipements médicaux, de produits de santé, d'aliments transformés, de systèmes de purification d'eau et de produits d'assainissement domestique. Les antibiotiques sont couramment utilisés pour tuer les bactéries pathogènes, mais leur usage fréquent rend les bactéries résistantes avec le temps et réduit les bactéries bénéfiques. Les infections causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques sont devenues une préoccupation majeure en médecine. De nombreux germes ont été identifiés comme résistants aux médicaments. De nouveaux efforts visent à remplacer les agents antimicrobiens actuels par des thérapies plus efficaces et complémentaires. La nanotechnologie a apporté une contribution substantielle à la production de nanomatériaux tels que les nanoparticules métalliques et d'oxydes métalliques (Ag, Cu, CuO, TiO₂, SiO₂, MgO, ZnO) pour combattre les micro-organismes résistants. Parmi celles-ci, les nanoparticules de Cu et d'Ag ont montré des propriétés antimicrobiennes encourageantes.

Ces dernières années, les nanoparticules bimetalliques ont été développées pour diverses applications en chimie, science des matériaux, biotechnologie et protection de l'environnement. Les nanoparticules bimetalliques contenant du cuivre (Cu) et de l'argent (Ag), avec une forte fraction d'atomes de surface et une grande surface spécifique, ont été largement étudiées. Elles suscitent un grand intérêt en raison de leurs propriétés chimiques, optiques, catalytiques, biologiques, plasmoniques et surtout antimicrobiennes améliorées. Les ions Ag peuvent être réduits par l'éthanol sous conditions atmosphériques à 800-1000 °C pour obtenir des nanoparticules d'argent, utilisées dans les crèmes solaires et le traitement de l'eau. Les nanoparticules de Cu sont fabriquées par réduction de sulfate de cuivre avec de l'hydrazine dans l'éthylène glycol sous irradiation micro-ondes et servent aussi d'agents antibactériens.

Les métaux Cu et Ag pris individuellement n'ont pas de propriétés optiques, catalytiques et structurelles prometteuses et ne peuvent être convertis en bimetalliques. En revanche, la combinaison des deux métaux (Cu:Ag) offre de nouvelles opportunités pour ajuster la structure et la morphologie du produit final pour les applications souhaitées. Selon sa structure finale (cœur-coquille, haltère, deux interfaces, mélange aléatoire, forme fleur), les nanoparticules bimetalliques peuvent présenter une gamme d'activités antimicrobiennes. Diverses méthodes de synthèse existent : coprécipitation, sol-gel, hydrothermale, réduction, micro-émulsion et méthode polyol.

Dans cette étude, des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag ont été synthétisées par coprécipitation en utilisant l'hydroxyde d'ammonium et l'eau déionisée comme solvant, le polyvinylpyrrolidone comme agent de coiffage, et l'hydrure de sodium et l'acide ascorbique comme agents réducteurs. Quatre échantillons avec diverses concentrations d'Ag ont été préparés. Avec l'augmentation des concentrations d'Ag, les échantillons ont montré une activité accrue contre Acinetobacter baumannii, responsable de fièvre et de nausées. Le matériau synthétisé a pris une apparence rouge lors de la croissance rapide, suggérant que l'activité antimicrobienne était renforcée avec l'augmentation des concentrations d'Ag. Par ailleurs, des prédictions in silico par ancrage moléculaire ont été réalisées pour identifier le patron d'interaction des nanoparticules Cu:Ag contre l'enzyme β-lactamase de la voie biosynthétique de la paroi cellulaire, ainsi que les enzymes FabI et FabH de la voie biosynthétique des acides gras.

Méthodes

Matériaux

Chlorure de cuivre(II) (CuCl₂·0,2H₂O, 98,9 %) et nitrate d'argent (AgNO₃) comme précurseurs, polyvinylpyrrolidone (PVP, poids moléculaire moyen 40 000) comme agent de coiffage, hydrure de sodium (NaBH₄, 99,9 %) et acide L-ascorbique (C₆H₈O₆, 99,0 %) comme agents réducteurs, et hydroxyde d'ammonium (NH₄OH) ont été acquis auprès de Sigma Aldrich, USA.

Synthèse des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag

Les nanoparticules bimetalliques Cu:Ag ont été préparées par coprécipitation comme illustré à la Figure 1. Dans de l'eau déionisée, 1,25 g de PVP et 0,5 g d'acide ascorbique ont été ajoutés et agités vigoureusement à 100 °C. Deux solutions de 40 mL d'hydroxyde d'ammonium ont été préparées individuellement ; dans l'une, 1,7 g de chlorure de cuivre, et dans l'autre, 1,7 g de nitrate d'argent ont été ajoutés. Ces deux solutions sont ensuite versées l'une après l'autre dans la solution initialement préparée avec l'ajout de 0,5 g de NaBH₄. Ensuite, la solution finale a été agitée à 100 °C pendant 4 h pour la rendre homogène, puis centrifugée à 6000 tr/min pour l'extraction complète des nanoparticules. Les nanoparticules bimetalliques obtenues ont été séchées à 100 °C pour éliminer complètement l'humidité et les impuretés. De même, quatre échantillons avec diverses concentrations d'Ag (2,5 %, 5 %, 7,5 % et 10 % en moles) ont été préparés avec des rapports de Cu fixes.

Activité antimicrobienne

Le potentiel bactéricide in vitro des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag a été évalué contre les bactéries pathogènes S. aureus, E. coli et A. baumannii isolées du lait de vaches atteintes de mammite, par la méthode de diffusion en puits. Les milieux Mannitol salt agar, MacConkey agar et Lauria Bertani agar ont été ensemencés avec les bactéries isolées à une croissance activée de 1,5 × 10⁸ UFC/mL. Après solidification du milieu, cinq puits ont été réalisés avec une pipette jaune de 15 mm de diamètre et 10 µL (5 µg/mL). Les nanoparticules Cu:Ag fraîchement préparées ont été chargées dans les puits avec différents rapports, en comparaison avec 10 µL d'amoxicilline (5 µg/mL) comme contrôle positif et 50 µL d'eau déionisée comme contrôle négatif. L'activité bactéricide a été déterminée en mesurant les zones d'inhibition (en mm) formées après incubation pendant 15 h à 37 °C.

Analyse statistique

L'activité bactéricide des nanoparticules synthétisées avec les mesures des zones d'inhibition (mm) a été considérée comme statistiquement significative en utilisant SPSS 20.0, analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA).

Étude par ancrage moléculaire

Les antibiotiques réduisent la croissance bactérienne et causent la mort des bactéries par dommages à la paroi cellulaire, perturbation des processus biochimiques, dommages à la membrane cellulaire et pénétration à travers le biofilm. Au cours des dernières décennies, de nombreuses nanoparticules à activité bactéricide potentielle ont été rapportées, tuant les bactéries soit par rupture de la paroi cellulaire, soit en bloquant la source de nourriture par un mécanisme similaire aux antibiotiques connus. Ainsi, les enzymes appartenant à ces voies biochimiques sont considérées comme des cibles importantes et attractives pour la découverte d'antibiotiques. Ici, des enzymes clés de la voie biosynthétique de la paroi cellulaire (β-lactamase) et de la voie biosynthétique des acides gras (FabH et FabI) ont été sélectionnées comme cibles possibles pour évaluer le mécanisme d'interaction des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag avec leur poche active en tant qu'inhibiteurs.

Les paramètres structuraux 3D des enzymes sélectionnées ont été récupérés de la Protein Data Bank avec les codes PDB : 4U0X (résolution 2,03 Å) pour la β-lactamase et 6AH9 (résolution 1,74 Å) pour la réductase enoyl-[acyl-porteur-protéine] (FabI) de A. baumannii. La β-lactamase (structure 3D) avec PDB ID : 1MWU (résolution 2,6 Å) et FabI avec code PDB : 4CV1 (résolution 1,95 Å) de S. aureus, tandis que pour FabH de E. coli, le code PDB est 4Z8D (résolution 2,0 Å).

L'étude d'ancrage moléculaire des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag a été réalisée avec le logiciel ICM Molsoft v3.8-4a ou supérieur (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) pour identifier les interactions de liaison avec les résidus clés du site actif. L'outil de préparation protéine/récepteur d'ICM a été utilisé pour l'optimisation et la préparation de structure des cibles enzymatiques sélectionnées. Les étapes comprenaient l'ajout d'atomes d'hydrogène polaires, la suppression des molécules d'eau et la minimisation d'énergie avec les paramètres par défaut. Le ligand co-cristallisé a été retiré pour laisser place à l'ancrage des nanoparticules. La poche de liaison a été définie par une grille spécifiant la position du ligand cristallisé. La conformation avec l'énergie de liaison la plus basse parmi les 10 conformations ancrées a été sélectionnée pour analyser le patron d'interaction et la tendance de liaison des nanoparticules bimetalliques Ag-Cu dans la poche active. Les logiciels PyMOL et Discovery Studio Visualizer ont été employés pour l'analyse et la représentation 3D des interactions de liaison. La structure des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag a été récupérée de PubChem au format .sdf.

Caractérisation

L'analyse structurale et la pureté de phase ont été observées par DRX (PAN analytical X'pert pro DRX) avec rayonnement Cu-Kα (λ = 0,154 nm, 20° à 80°). La présence de modes vibrationnels correspondant à divers groupes fonctionnels a été évaluée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) avec un spectromètre Perkin Elmer. Les spectres d'absorption ont été acquis à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible Genesys 10S. Le MEB-FEG couplé à un spectromètre EDS (JSM-6610LV) et le MET-HR (JEOL JEM 2100F) ont été utilisés pour visualiser les morphologies de surface. Le logiciel ICM v3.8-4a ou supérieur (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) a été utilisé pour l'analyse d'ancrage moléculaire.

Résultats et Discussion

L'analyse DRX a été entreprise pour évaluer la constitution des phases et la structure cristalline des produits formulés. La Figure 3a révèle le patron DRX tracé entre 20° et 80°. Dans le Cu:Ag bimetallique, les réflexions observées autour de ~ 38,2°, 46°, 64,4° et 77,1° sont attribuées aux facettes (111), (200), (220) et (311) de la phase Ag fcc selon JCPDS No. 04-0783. Pour le Cu, les diffractions apparaissant à 32,6°, 44,2° et 51° dénotent les plans de réseau (110), (111) et (200) confirmant la présence de CuO et de Cu métallique structurés fcc, bien corrélés avec JCPDS No. 04-0836. Dans le patron extrait, les pics d'Ag et de Cu sont observés, signifiant la présence de nanoparticules constituant les deux phases. De plus, l'existence de CuO dans les échantillons à faible teneur en Ag (1:0,025, 1:0,050, 1:0,075) révèle que les nanoparticules de Cu étaient oxydées et présentaient un comportement non protecteur à haute température en raison des faibles concentrations d'Ag. Inversement, dans l'échantillon à la plus haute teneur en Ag (1:0,1), le pic de CuO présente une faible intensité, indiquant la formation d'un produit partiellement exempt d'oxyde. Cela suggère que la résistance à l'oxydation des nanoparticules bimetalliques s'améliore par l'ajout d'Ag. Aucun pic d'impureté additionnel n'a été détecté dans les limites de détection de l'instrument.

Les spectres FTIR ont été enregistrés entre 500 et 4000 cm⁻¹ ; la bande transmise entre 600 et 900 cm⁻¹ est causée par la formation de liaisons Cu:Ag. La bande observée autour de ~ 1200 et 1400 cm⁻¹ est attribuée aux liaisons C-O et C-H respectivement ; les pics apparaissant à ~ 1800 et 2100 cm⁻¹ correspondent aux liaisons C=O et N-H dues au PVP et au NH₄OH. Les transmittances observées autour de ~ 2800 cm⁻¹ et 3400 cm⁻¹ sont attribuées à la présence de groupes C≡N et hydroxyle (O-H).

La Figure 4a montre les spectres d'absorption des nanoparticules bimetalliques Ag-Cu avec des bandes d'absorption nettes à 340, 410 et 500 nm, attribuées à l'absorption de résonance plasmonique de surface de l'Ag et du Cu métalliques. La bande à 410 nm survient typiquement en raison de la présence de nanoparticules d'Ag, et le pic ultérieur à 510 nm est attribué à l'existence de nanoparticules de Cu. On peut suggérer que les nanoparticules bimetalliques sont développées avec des phases distinctes d'Ag et de Cu, au lieu d'un développement bimetallique, ce qui a été affirmé par les résultats DRX. Un léger décalage vers le rouge de la bande d'absorption à 410 nm et une augmentation de l'absorption maximale avec l'augmentation de la teneur en Ag ont été observés. En utilisant l'équation de Tauc, le gap de bande des produits bimetalliques préparés a été calculé à 3,2, 2,9, 2,7 et 2,6 eV.

D'après les images MEB (Figure 5a-d), de petites particules étaient déposées à la surface de grosses particules. L'augmentation de la teneur en Ag de 2,5 à 7,5 % a conduit à la formation de diverses particules avec morphologie variable, culminant en nanoparticules Cu:Ag massives. L'accumulation de particules d'Ag inégales et minuscules s'est accrue avec la concentration de dopant, suggérant l'apparition de blocs plus dispersés à la surface. Cela signifie l'influence majeure du dopage d'Ag dans le Cu sur la morphologie, confirmée par les micrographies MET-HR.

Pour élaborer davantage sur la morphologie et l'espacement d des produits bimetalliques, le MET-HR avec résolution 10 nm a été utilisé. La Figure 6a montre un espacement d de 0,21 nm pour les nanoparticules de Cu correspondant à la facette (111) du Cu, comme évident dans les résultats DRX. La Figure 6b montre une légère augmentation de l'espacement de couche (0,21 à 0,22 nm) et des nanoparticules d'Ag avec une distance interplanaire de 0,24 nm correspondant au plan (111). Les Figures 6c-d montrent les espacements de couches calculés et les phases séparées du bimetallique, tandis que la Figure 6e montre la forme des particules d'Ag et de Cu. Les particules dans les images MET-HR possèdent une structure cœur-coquille. Dans la Figure 6d, au sein d'une seule particule, des franges de réseau émanant du Cu et de l'Ag ont été enregistrées, suggérant fortement la formation de nanoparticules bimetalliques cœur-coquille avec différents rapports Cu:Ag produisant des nanoparticules quasi-sphériques irrégulières. La variation de contraste au sein d'une seule particule peut indiquer la présence de deux matériaux constitutifs distincts.

La présence de pics distincts dans le spectre EDS et la composition élémentaire provenant du bimetallique affirment la formation réussie de nanoparticules Cu:Ag. La Figure 7a représente le spectre EDS de l'échantillon 1:0,050 montrant des pics nets de Cu et d'Ag. La Figure 7b de l'échantillon 1:0,10 montre des pics pour C et O détectés dans les échantillons dopés, dus aux pastilles de carbone utilisées pour maintenir les échantillons lors de l'examen MEB et/ou aux comptages de fond du capteur MEB-EDS.

L'efficacité bactéricide in vitro des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag par essai de diffusion en puits sur gélose est présentée dans le Tableau 1. Les résultats démontrent une relation de proportionnalité directe entre la concentration des nanoparticules synthétisées et les zones d'inhibition (mm). Des zones d'inhibition statistiquement significatives (P < 0,05) ont été enregistrées pour (2,5, 5, 7,5 et 10 % en poids) le dopant Ag contre S. aureus, E. coli et A. baumannii, variant de 0,85-2,8 mm, 0,55-1,95 mm et 0,65-1,85 mm respectivement. Tous les résultats ont été comparés avec l'eau déionisée (0 mm) et l'amoxicilline (4 mm) comme contrôles négatif et positif. Similairement, l'efficacité en pourcentage des nanoparticules dopées a augmenté (21,2-70 %), (13,7-48,7 %) et (16,2-46,2 %) contre S. aureus, E. coli et A. baumannii respectivement. Globalement, les nanoparticules bimetalliques Cu:Ag se sont révélées plus puissantes contre S. aureus (Gram +) comparées à E. coli et A. baumannii (Gram -).

La taille, la concentration et la forme des nanoparticules affectent directement le stress oxydatif produit par les nanostructures. L'efficacité bactéricide sous forme de zones d'inhibition (mm) s'est améliorée grâce à un plus grand % en poids de dopage d'Ag dans les nanoparticules bimetalliques Cu dopés à l'Ag en raison de la disponibilité accrue de cations (++). L'action bactéricide concernant la taille et la concentration dépeint une relation inverse avec la taille. Les structures nano-dimensionnées produisent efficacement des espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui résident dans les membranes cellulaires bactériennes, entraînant l'extrusion des organites cellulaires et ultimement la mort des bactéries. Outre la production de ROS, l'interaction cationique de Ag⁺ et Cu²⁺ avec les parties chargées négativement de la membrane cellulaire bactérienne résulte en une efficacité bactéricide améliorée aux concentrations croissantes par lyse cellulaire et effondrement bactérien.

Les applications biologiques de diverses classes de nanoparticules ont été largement étudiées ces dernières décennies. En raison de leurs caractéristiques uniques, elles ont été largement utilisées pour leur potentiel comme agents bactéricides capables de substituer les antibiotiques traditionnels. Les nanoparticules interagissent avec les cellules bactériennes, perturbent la perméation de la membrane cellulaire et détruisent les voies métaboliques clés. Le mécanisme spécifique de toxicité des nanoparticules envers les bactéries doit être exploré. On pense que les nanoparticules interagissent avec la cellule bactérienne impliquant des forces électrostatiques, des forces de van der Waals ou des interactions hydrophobes aboutissant à la mort des bactéries. Les enzymes ont été rapportées comme principaux facteurs de virulence impliqués dans l'infection bactérienne et leur ciblage pour inhiber leur activité aide à lutter contre l'infection causée. Ici, l'étude d'ancrage moléculaire des nanoparticules Cu:Ag contre des cibles enzymatiques de la voie de la paroi cellulaire et de la voie biosynthétique des acides gras a identifié le patron d'interaction de liaison de ces nanoparticules dans la poche active. En tenant compte du potentiel antibactérien in vitro de ces nanoparticules contre A. baumannii, S. aureus et E. coli, les cibles enzymatiques ont été sélectionnées à partir de ces micro-organismes pour obtenir un aperçu du mécanisme possible derrière leur activité bactéricide.

La meilleure conformation ancrée observée pour les nanoparticules bimetalliques Cu:Ag avec la β-lactamase de A. baumannii a révélé une interaction par liaison hydrogène avec Glu272 (2,8 Å) et Ser286 (3,2 Å) ainsi qu'une interaction de contact métallique avec Val292, avec un score d'ancrage de -4,013 kcal/mol (Figure 8a). De même, le score de liaison des nanoparticules bimetalliques Ag-Cu contre la β-lactamase de S. aureus était de -4,981 kcal/mol avec des liaisons hydrogène avec Ser403 (3,2 Å), Tyr519 (3,6 Å), Gln521 (3,0 Å) et Asn464 (3,1 Å) comme montré Figure 8b.

La seconde cible enzymatique, FabI, appartenant à la voie biosynthétique des acides gras, a montré que les nanoparticules bimetalliques Cu:Ag sont des inhibiteurs potentiels. Les nanoparticules bimetalliques Cu:Ag ont montré un bon score de liaison (-3,385 kcal/mol) contre FabI de A. baumannii avec liaisons hydrogène avec Ser201 (2,7 Å), Ala199 (3,5 Å) et Leu198 (3,3 Å) (Figure 8c). De même, la meilleure conformation ancrée des nanoparticules Ag-Cu avec le site actif de FabI de S. aureus a montré des liaisons hydrogène avec Gly202 (2,5 Å) et Gln155 (2,5 Å) avec un score de liaison de -3,012 kcal/mol (Figure 8d).

En outre, la capacité de liaison des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag contre FabH de E. coli a été évaluée avec un score de liaison de -4,372 kcal/mol ayant des interactions par liaisons hydrogène avec Thr254 (3,5 Å), HIE244 (2,6 Å) et Glu302 (3,0 Å) (Figure 8e).

Conclusion

Des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag ont été préparées par coprécipitation pour des applications de lutte contre les affections bactériennes. Les profils DRX confirment la présence de CuO et de Cu et Ag métalliques structurés fcc. Les pics d'Ag et de Cu observés signifient des nanoparticules bimetalliques comportant les phases Ag et Cu. Les plans observés en DRX correspondent bien aux anneaux SAED. Les groupes chimiques attachés aux produits formulés et la bande de transmittance caractéristique entre 600 et 900 cm⁻¹ sont causés par la formation de liaisons Cu:Ag. Les spectres UV-vis tracés montrent une absorption à 410 nm due à la présence de nanoparticules d'Ag, et un pic à 510 nm attribué à l'existence de nanoparticules de Cu. Les particules dans les images MET-HR présentent une structure cœur-coquille. Les nanoparticules Cu:Ag montrent clairement la formation de nanoparticules bimetalliques avec différents rapports Cu:Ag produisant des nanoparticules quasi-sphériques irrégulières. L'espacement d des nanoparticules de Cu (0,21 nm) correspond à la facette (111) du Cu détectée en DRX. Une légère augmentation de l'espacement de couche (0,21 à 0,22 nm) montre que les nanoparticules d'Ag avec distance de couche 0,24 nm correspondent au plan (111). L'étude d'ancrage moléculaire montre un bon accord avec l'activité bactéricide in vitro. La tendance de liaison des nanoparticules bimetalliques Cu:Ag contre l'enzyme β-lactamase de la voie biosynthétique de la paroi cellulaire ainsi que les enzymes FabI et FabH de la voie biosynthétique des acides gras démontre leur potentiel d'inhibition qui doit être exploré davantage par des études d'inhibition enzymatique.