Administration ciblée de paclitaxel et inhibiteur P-gp par nanoliposomes via anticorps PD-L1 pour vaincre le cancer gastrique multirésistant

Résumé

La multirésistance aux médicaments (MDR) basée sur les transporteurs d'efflux ATP-dépendants (glycoprotéine P (P-gp)) reste un obstacle majeur dans le traitement chimiothérapeutique réussi. Ici, nous avons étudié le potentiel de nanoliposomes conjugués à l'anticorps monoclonal PD-L1 (mAb) pour servir de plateforme d'administration ciblée pour la co-administration de paclitaxel (PTX) et d'inhibiteur spécifique du transport P-gp (TQD, tariquidar) dans les cancers gastriques résistants aux médicaments. Deux médicaments, PTX et TQD, ont été co-chargés dans un seul véhicule dans un ratio précis pour améliorer la perspective d'effet chimiothérapeutique combiné. L'étude d'internalisation cellulaire a indiqué que PD-PTLP avait une efficacité d'internalisation plus élevée dans les cellules SGC7901/ADR surexprimant le récepteur PD-L1 que le PTLP non ciblé. La synergie la plus élevée a été observée à une fraction de poids de 1/0,5 (PTX/TQD) et la combinaison de PTX et TQD a entraîné un effet synergique évident par rapport aux médicaments individuels seuls. Nos résultats in vitro ont montré que le TQD était efficace pour inverser la multirésistance dans les cellules SGC7901/ADR. La valeur IC50 de PD-PTLP était de 0,76 μg/ml comparée à 6,58 μg/ml et 7,64 μg/ml pour PTX et TQD, respectivement. PD-PTLP a déclenché des niveaux significativement plus élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et d'apoptose cellulaire comparé au PTX libre ou TQD. De plus, l'étude antitumorale in vivo a montré que la chimiothérapie combinée de PD-PTLP affichait une inhibition significative de la charge tumorale des xénogreffes résistantes aux médicaments avec des cellules TUNEL-positives significativement plus élevées. En outre, le PTX libre a entraîné une augmentation significative des niveaux d'AST et ALT tandis que PD-PTLP n'était pas significativement différent du témoin, indiquant l'innocuité. Globalement, nous pensons que la combinaison d'un médicament anticancéreux avec un inhibiteur P-gp pourrait fournir une direction potentielle vers le traitement des tumeurs gastriques résistantes aux médicaments.

Introduction

Les traitements chimiothérapeutiques actuels basés sur un régime à un seul médicament sont loin d'être parfaits et souffrent d'effets indésirables sévères à doses élevées et conduisent simultanément au développement de résistance aux médicaments [1]. La dernière décennie a témoigné de l'efficacité thérapeutique élevée des régimes combinés dans le traitement du cancer [2]. La combinaison de deux ou plusieurs médicaments a démontré une efficacité anticancéreuse synergique en raison de l'action pharmacologique différente des médicaments combinés [3, 4]. Cependant, le choix de la bonne combinaison de médicaments dépend de multiples facteurs, notamment le type de cellules cancéreuses, médicaments hydrophiles/hydrophobes, activités biochimiques et profils pharmacocinétiques des médicaments. Parmi tous, la combinaison de médicaments est sélective pour des types spécifiques de cancers [5].

Le cancer gastrique est un fardeau sanitaire mondial et la deuxième cause la plus courante de décès liés au cancer dans le monde. La prévalence du cancer gastrique est élevée en Asie de l'Est comme le Japon, la Corée et la Chine, cette dernière signalant le taux de mortalité le plus élevé au monde [6]. En moyenne, 400 000 nouveaux cas sont enregistrés chaque année en Chine et la plupart des cas sont diagnostiqués à des stades avancés [7, 8]. D'énormes progrès ont été réalisés dans les stratégies de traitement ; cependant, cela n'a pas amélioré le taux de survie et a entraîné un échec thérapeutique. L'échec du traitement est principalement attribué au développement de la chimiorésistance et à la toxicité sévère de la dose de chimiothérapie et à la récurrence d'épisodes de cancer gastrique [9]. Par conséquent, il y a une tâche urgente d'améliorer l'efficacité thérapeutique et de surmonter la métastase et la récurrence du cancer gastrique.

Le paclitaxel (PTX) est l'un des médicaments importants indiqués dans le traitement des cancers gastriques [10]. Le PTX inhibe la réplication cellulaire en interférant avec la dégradation des microtubules, entraînant ainsi un arrêt du cycle cellulaire. Cependant, l'acquisition de multirésistance aux médicaments (MDR) est un obstacle majeur au succès de la chimiothérapie [11, 12]. L'efflux ATP-dépendant médié par les transporteurs transmembranaires de la famille des cassettes de liaison à l'ATP (ABC), dans laquelle la glycoprotéine P (P-gp) est considérée comme le facteur abondant, est surexprimé dans les cancers gastriques [13]. En d'autres termes, le PTX sert de substrat pour les récepteurs P-gp, où l'efflux du médicament réduira la concentration intracellulaire du médicament, conduisant à une faible efficacité et une haute résistance [14]. À cet égard, le Tariquidar (TQD) est un inhibiteur puissant de P-gp de troisième génération et a été rapporté pour inverser la surexpression des récepteurs P-gp dans plusieurs cellules cancéreuses [15, 16]. Cependant, les rapports suggèrent que l'administration de TQD doit être terminée tôt car elle entrave la fonction P-gp du système physiologique normal. L'expression de P-gp est requise pour maintenir la barrière hémato-encéphalique (BHE) et éliminer les toxines des tissus normaux [17]. Puisque P-gp est présent dans les tissus normaux et agit comme une barrière contre les toxines cellulaires, l'inhibition non spécifique de PTX ou TQD pourrait potentiellement interférer avec les fonctions physiologiques normales et entraîner une toxicité adverse. De plus, PTX et TQD sont des médicaments hautement lipophiles avec une solubilité limitée dans les solutions aqueuses et le sang systémique, nécessitant le besoin d'un système d'administration de médicaments stable ciblé vers les cancers gastriques dans le corps [18].

Le système d'administration de médicaments (SAM) a considérablement augmenté la concentration des médicaments encapsulés dans les tissus cancéreux et a offert une libération soutenue du médicament pendant une période prolongée [19]. À cet égard, le liposome est l'un des vecteurs de médicaments les plus utilisés pour améliorer l'efficacité thérapeutique dans les cancers. Les liposomes ont gagné en importance en raison de leur biocompatibilité, modifications structurales de surface, chargement de médicaments hydrophiles/lipophiles et capacité de chargement élevée [20]. Les médicaments peuvent être incorporés de manière stable dans la bicouche lipidique du liposome et facilement dotés d'une capacité de circulation prolongée (PEGylation) par l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR) [21]. Récemment, il a été rapporté que les liposomes ont la capacité de conserver les ratios de multiples médicaments après administration intraveineuse [22]. Cette idée a été démontrée en 2017 après l'approbation de la FDA, Vyxeos® (formulation liposomale) contenant des ratios de cytarabine:daunorubicine dans le traitement de la leucémie [23]. Comparé aux formulations non ciblées, les formulations ciblées par ligand étaient très attractives et prometteuses. À cet égard, PD-1 est un récepteur de surface cellulaire connu pour la régulation négative du système immunitaire et la suppression de l'activité inflammatoire des cellules T. L'expression de PD-L1 a été rapportée chez 50 % des patients atteints de cancer gastrique, faisant de PD-L1 un récepteur de ciblage pour l'internalisation des nanoparticules [24, 25]. L'anticorps monoclonal PD-L1 (mAb) pourrait se lier spécifiquement au domaine extracellulaire de la protéine PD-L1 et pourrait être une excellente stratégie thérapeutique pour améliorer l'efficacité anticancéreuse [26].

L'objectif principal de l'étude présente était d'améliorer l'administration des médicaments combinés, PTX et TQD, pour améliorer l'efficacité anticancéreuse contre les cancers gastriques. Dans ce but, des nanoliposomes chargés en PTX et TQD conjugués à PD-L1 ont été formulés et évalués pour l'efficacité anticancéreuse dans des conditions in vitro et in vivo. L'efficacité in vivo a été évaluée dans un modèle de xénogreffe basé sur des cellules de cancer gastrique et une immunohistochimie (IHC) a été réalisée.

Conclusion

En conclusion, notre travail a réalisé une thérapie combinée contre la tumeur MDR par une stratégie d'administration programmée. Nous avons démontré le potentiel de la combinaison de PTX et d'inhibiteur P-gp (TQD) dans l'inhibition de la charge tumorale des xénogreffes SGC7901/ADR multirésistantes. La co-administration de PTX et TQD dans un nanovecteur multifonctionnel a permis le contrôle ratiométrique des médicaments anticancéreux co-chargés, a inhibé la pompe d'efflux P-gp et a exhibé une efficacité anticancéreuse synergique. Nous pensons que la combinaison d'un médicament anticancéreux avec un inhibiteur P-gp pourrait fournir une direction potentielle vers le traitement des tumeurs résistantes aux médicaments.

Matériaux et méthodes

Formulation des nanoliposomes conjugués à l'anticorps monoclonal PD-L1 chargés en PTX/TQD

La phosphatidylcholine d'œuf (EPC), le 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG) et DSPE-PEG2000-maleimide (DSPE-PEG2000-Mal) mélangés dans une solution de chloroforme à un ratio molaire de 3/2/0,5/0,25 avec PTX et TQD, puis le solvant organique a été évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif suivi d'une lyophilisation pendant 3 h. Le film lipidique a été hydraté avec une solution de sulfate d'ammonium 250 mM maintenue à pH 7,0. Les gros liposomes multilamellaires ont été soniqués pendant 30 min dans un sonificateur de type bain (Branson ultrasonicbath, USA) maintenu à 65 °C. Les liposomes ont été dialysés contre un grand volume d'eau distillée pendant strictement 1 h pour échanger le médicament libre et les composants initiaux. Les liposomes ont été redispersés dans un tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4). Le mAb PD-L1 a été conjugué au liposome en mélangeant dans un ratio 8:1 (liposome:mAb) et incubé à 4 °C pendant 4 h. Le mAb PD-L1 sera conjugué au DSPE-PEG2000-Mal par interaction entre les résidus sulfhydryles sur les anticorps aux groupes maleimide C-terminaux des liposomes. Les liposomes conjugués PD-L1 ont été centrifugés à 10 000 tr/min pendant 10 min et le surnageant a été éliminé et redispersé dans un tampon PBS et stocké à 4 °C jusqu'à analyse ultérieure. La quantité de PTX et TQD encapsulée dans le liposome a été évaluée par méthode HPLC. Le système HPLC Agilent Technologies modèle 1260 Infinity équipé d'un échantillonneur automatique Agilent Technologies et d'un détecteur à réseau de diodes G1315D a été utilisé dans l'étude. La phase mobile consiste en un mélange d'acétonitrile/eau (70:30 v/v) maintenu à un débit de 1 ml/min. Une colonne C18 (5 μm, 150 × 60 mm, ODS-3) a été utilisée pour éluer les échantillons et détectée à 227 nm. Avant, le liposome chargé PTX/TQD a été dissous dans de l'acétonitrile et vortexé pendant 15 min, filtré à travers un filtre de 0,45 μm, et 10 μl d'aliquote a été injecté dans la colonne HPLC.

Analyse de la distribution de taille et de la morphologie des particules

La distribution de taille et le potentiel zêta des formulations chargées en médicaments ont été déterminés par Malvern zetasizer (UK) à 25 °C. Avant l'expérience réelle, les dispersions de nanoparticules ont été diluées 10× avec de l'eau distillée et l'expérience a été réalisée à un angle de détection de 90° en triplicat. La morphologie des nanoparticules a été évaluée par microscope électronique en transmission (MET). Les dispersions de nanoparticules ont été diluées 10× avec de l'eau distillée et placées sur une grille de cuivre recouverte de carbone et séchées à l'aide d'une lampe IR, puis l'échantillon a été évalué par MET (CM 30, Philips (Eindhoven, Pays-Bas)) après coloration avec l'acétate d'uranyle (1 % p/v).

Analyse du profil de libération

Le profil de libération de PTX et TQD du nanoliposome a été évalué par méthode de dialyse. Pour cela, 15 mg de poudre lyophilisée de nanoliposomes conjugués au mAb PD-L1 chargés en PTX et TQD (PD-PTLP) a été dissous dans 1 ml d'eau distillée et scellé dans une membrane de dialyse (PMCO 3,5 kDa) et immergé dans 30 ml de tampon de libération respectif maintenu à 37 °C. À des moments prédéterminés, des aliquotes d'échantillons ont été prélevées et remplacées par une quantité égale de tampon de libération. L'étude a été poursuivie pendant 72 h. Les échantillons ont été filtrés à travers un filtre de seringue de 0,22 μm et injectés dans la colonne HPLC et évalués par la méthode mentionnée ci-dessus.

Études d'internalisation cellulaire

Les cellules SGC7901/ADR ont été cultivées dans le milieu modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10 % FBS et 100 UI/ml pénicilline et 100 μg/ml streptomycine sous atmosphère de 5 % CO₂ à 37 °C. Un microscope confocal à balayage laser (BX61WI ; Olympus, Tokyo, Japon) a été utilisé pour évaluer la distribution cellulaire et l'internalisation de PTLP et PD-PTLP dans les cellules SGC7901/ADR. Dans ce but, 1 × 10⁵ cellules ont été ensemencées dans chaque puits de plaque à 12 puits et incubées pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été exposées à PTLP et PD-PTLP et incubées pendant 3 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid et fixées avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min. Les cellules ont été à nouveau lavées avec du PBS et colorées avec 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min. Finalement, les cellules ont été soigneusement lavées et observées sous CLSM. L'expérience compétitive sur l'internalisation de PD-PTLP a été réalisée en prétraitant les cellules avec du mAb PD-L1 libre pendant 30 min et en les lavant. Les cellules ont été divisées en deux groupes, l'un traité avec du mAb PD-L1 libre et l'autre non traité avec du mAb PD-L1 libre. Les cellules ont été incubées avec PD-PTLP et incubées pendant 3 h et la même méthode a été suivie pour l'analyse d'internalisation cellulaire.

Expression des protéines par essai Western blot

Les cellules SGC7901/ADR ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité d'ensemencement de 3 × 10⁵ cellules/puits et incubées pendant 18 h. Les cellules ont été traitées avec différentes formulations (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) et incubées pendant 24 h. Les cellules ont été lavées et extraites avec un tampon de décollement et lysées à l'aide d'un tampon de lyse standard (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Les cellules ont été centrifugées à une vitesse de 12 000 tr/min pendant 15 min et le surnageant a été collecté et la quantification des protéines a été réalisée par dosage BCA (Beyotime). Une quantité égale de protéines a été chargée dans un gel SDS-PAGE à 8 % puis transférée sur une membrane de nitrocellulose (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). La membrane a été bloquée avec 5 % de lait écrémé pendant 1 h pour inhiber les sites de liaison non spécifiques. La membrane a été incubée avec des anticorps primaires (P-gp et GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, USA) à 4 °C pendant la nuit. La membrane a été lavée avec TBST et à nouveau incubée avec des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin ou -souris marqués à la peroxydase (lapin ou souris, 1:10 000, Abcam, MA, USA) à température ambiante. Les membranes ont été à nouveau lavées avec TBST. Les bandes ont été visualisées sous une méthode de chimiluminescence améliorée (EMD Millipore).

Analyse de cytotoxicité in vitro

L'effet cytotoxique des médicaments individuels et des formulations a été évalué par essai MTT. Brièvement, les cellules cancéreuses ont été déposées à une densité de 1 × 10⁴ cellules/puits dans une plaque à 96 puits et incubées pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec du PTX libre, TQD, PTLP et PD-PTLP, respectivement pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été soigneusement lavées et additionnées de 15 μl de solution MTT 5 mg/ml et soumises à 3 h d'incubation supplémentaire, puis 100 μl de DMSO a été ajouté pour extraire les cristaux de formazan. L'absorbance résultante a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques automatisé. La viabilité cellulaire est calculée par OD du groupe test/OD du témoin × 100 %. L'indice de combinaison a été évalué par le logiciel Calcusyn^TM. Toutes les expériences ont été réalisées en triplicat.

Analyse de l'apoptose et des espèces réactives de l'oxygène in vitro

Pour l'essai d'apoptose, les cellules cancéreuses ont été déposées à une densité de 2 × 10⁵ cellules/puits dans une plaque à 12 puits et incubées pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec du PTX libre, TQD, PTLP et PD-PTLP, respectivement pendant 24 h. Les cellules ont été extraites par décollement et centrifugées et les culots ont été redispersés dans 100 μl de tampon de liaison. Les cellules ont été co-colorées avec un combo de 5 μl d'Annexin-V/FITC et 2,5 μl de solution de travail PI et incubées pendant 15 min. Les cellules colorées ont été analysées par cytomètre de flux utilisant un BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, USA). L'Annexin-V et PI représentent l'indicateur d'apoptose précoce et l'indicateur d'apoptose tardive basé sur les composants structurels des cellules vivantes et mortes, respectivement.

Le 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) a été utilisé comme sonde pour l'analyse des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Pour l'analyse quantitative, 1 × 10⁴ cellules/puits ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à fond noir et incubées pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec du PTX libre, TQD, PTLP et PD-PTLP, respectivement pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec du tampon PBS puis incubées avec 1 ml de solution DCFH-DA selon les directives du fabricant pendant 30 min. Suivi par lyse des cellules et centrifugation à 10 000 tr/min pendant 15 min. Le surnageant résultant a été transféré dans une nouvelle plaque à 96 puits et la fluorescence a été mesurée à 485 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques automatisé. Simultanément, un ensemble séparé de cellules a été traité de la même manière et les images ont été observées au microscope à fluorescence (Nikon A1, Japon).

Efficacité antitumorale de PD-PTLP dans le modèle de xénogreffe

L'étude d'efficacité antitumorale a été réalisée sur des souris nues BALB/c obtenues du Centre des Animaux de Laboratoire, Quatrième Hôpital Affilié de l'Université Médicale de Harbin, Harbin. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux normes nationales pour la qualité des animaux de laboratoire. Les expériences ont été strictement réalisées conformément aux directives du Comité des Animaux Expérimentaux du Quatrième Hôpital Affilié de l'Université Médicale de Harbin, Harbin. Les animaux ont été injectés sous-cutanément avec 1 × 10⁶ cellules SGC7901/ADR dans 150 μl de milieu de culture dans le flanc droit des souris. Les tumeurs ont été laissées croître jusqu'à 100 mm³ avant l'expérience réelle. Les souris ont été divisées équitablement en cinq groupes avec huit souris dans chaque groupe. La dose individuelle de PTX et TQD a été fixée à 5 mg/kg, tandis que la combinaison a utilisé une dose totale de 5 mg/kg. L'injection par voie veineuse de la queue était tous les trois jours, au total trois injections ont été effectuées. À des jours prédéterminés, le volume tumoral et le poids corporel ont été mesurés. Le volume tumoral a été calculé en mesurant le diamètre le plus long et le plus court des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse numérique. Volume tumoral (V) = ½ × longueur × largeur (mm)². Les souris ont été sacrifiées à la fin de l'étude et la tumeur a été extraite et pesée. La tumeur a été soumise à une analyse immunohistochimique (IHC). Les tumeurs ont été extraites, tranchées en fines pièces, et fixées dans une solution de formol à 10 %. Les tumeurs ont été incluses dans de la cire de paraffine et ensuite l'essai TUNEL a été réalisé selon les directives du fabricant.

Analyse biochimique sérique

Les souris ont été administrées avec les formulations respectives ; 24 h plus tard, les souris ont été sacrifiées et des échantillons de sang ont été collectés des groupes témoins ainsi que des groupes traités test. Le sérum est séparé du sang total et stocké à -80 °C jusqu'à analyse ultérieure. L'analyse biochimique sérique a été menée pour évaluer la performance du foie. L'aspartate transaminase (AST) et l'alanine transaminase (ALT) ont été mesurées pour évaluer la fonction hépatique. Toutes les mesures ont été effectuées selon les procédures du kit de dosage biochimique.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation des nanoliposomes conjugués à PD-L1 chargés en PTX/TQD

Le PTX a été largement utilisé en clinique et principalement indiqué dans le traitement des cancers gastriques. Cependant, la majorité des patients souffrent apparemment d'une mauvaise réponse thérapeutique en raison de la multirésistance (MDR) des cancers gastriques. Une augmentation de la dose de PTX a entraîné une toxicité systémique accrue, faisant de la MDR un obstacle majeur dans le traitement réussi du cancer. Parmi la pléthore de mécanismes de MDR, l'efflux de médicament médié par P-gp est considéré comme principalement responsable de la résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses [27]. Par conséquent, dans cette étude, nous avons utilisé un second médicament (TQD) comme inhibiteur de P-gp pour surmonter le phénomène MDR dans les cellules cancéreuses et améliorer l'efficacité anticancéreuse de PTX. Nous avons soigneusement étudié la fraction de poids des deux médicaments dans laquelle ils exhibent l'effet synergique. Afin de maximiser l'effet anticancéreux, il est important de co-administrer les multiples médicaments dans un système de nanoparticules unique. L'administration de deux médicaments (PTX et inhibiteur P-gp) simultanément permettra la suppression efficace du mécanisme d'efflux de médicament et augmentera la perspective de concentrations intracellulaires accrues dans les cellules cancéreuses [28]. Dans ce but, dans cette étude, nous avons chargé deux médicaments dans la bicouche lipidique des nanoliposomes qui sont considérés comme extrêmement stables dans les circulations systémiques (Fig. 1). Pour obtenir un ciblage tumoral amélioré, les nanoliposomes ont été conjugués en surface avec le mAb PD-L1. Le groupe maleimide présent dans le nanoliposome se liera avec le groupe thiol du mAb PD-L1 et formera une liaison covalente stable. Mais une limitation possible de la conjugaison maleimide est que la réaction est réversible : le produit pourrait subir des réactions d'addition rétro-Michael avec les thiols biologiques dans le plasma, ce qui pourrait entraîner la libération du maleimide. Cependant, nous avons surmonté une telle réaction par une conjugaison maximale de surface de l'anticorps sur le liposome-maleimide. Il a été rapporté que le ligand de ciblage tumoral livrera spécifiquement la charge thérapeutique dans les tissus tumoraux et évitera les effets secondaires inutiles dans les tissus normaux. Auparavant, Patel et al. ont rapporté que l'incorporation d'inhibiteur P-gp avec PTX pourrait surmonter la MDR dans la cellule de cancer ovarien en conditions in vitro [11]. De même, Zou et al. et Zhang et al. ont rapporté que la cytotoxicité du PTX contre les cellules multirésistantes SKOV-3TR et A2780-Adr augmentait significativement en présence de Tariquidar. Cependant, dans ces études, soit une combinaison physique de PTX + TQD était utilisée, soit un vecteur non ciblé était développé [29, 30]. Important, toutes ces études ont été réalisées uniquement en conditions in vitro. L'étude présente s'est concentrée sur la conception du nanovecteur ciblé en utilisant une classe relativement nouvelle d'agent de ciblage, l'anticorps PDL1. De plus, l'étude présente a démontré l'efficacité de PTX + TQD dans un modèle de tumeur xénogreffe et a également évalué les paramètres sanguins pour les relier à la toxicité systémique.

Illustrations schématiques du chargement de paclitaxel et tariquidar dans des nanoliposomes conjugués en surface à l'anticorps monoclonal PD-L1 (mAb). Le liposome a été préparé par hydratation de film lipidique mince et sonication pour former les nanoliposomes chargés en médicaments

La taille moyenne des particules de PTLP était de 135,6 ± 1,26 nm alors qu'elle a augmenté à 168,59 ± 1,34 nm après conjugaison avec le mAb PD-L1 (PD-PTLP). La taille des particules a augmenté en raison du poids moléculaire élevé du mAb PD-L1 ; néanmoins, la taille globale inférieure à 200 nm et la forme sphérique étaient notables (Fig. 2a). Les nanoparticules de taille inférieure à 200 nm permettront une accumulation plus élevée dans les tissus tumoraux grâce à l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR). De plus, la présence de PEG permettra un temps de circulation sanguine prolongé dans la circulation systémique. Le potentiel zêta de PD-PTLP était de 22,1 ± 1,21 mV, ce qui n'autorisera aucune liaison non spécifique aux composants sanguins. PD-PTLP a exhibé une efficacité d'encapsulation élevée de ~95 % pour les deux médicaments (PTX et TQD). PD-PTLP a également exhibé un chargement élevé de médicament de 12-14 % p/p pour PTX et TQD, respectivement (Fig. 2b).

Caractérisation physicochimique des nanoliposomes conjugués à PD-L1 chargés en PTX/TQD. a Analyse de morphologie de PD-PTLP par microscope électronique en transmission (MET). b Capacité de chargement de médicament de PD-PTLP. c Libération in vitro de PTX et TQD de PD-PTLP dans des conditions de tampon pH 7,4 et pH 5,0 à 37 °C. **p < 0,01 est la différence statistique dans la libération de médicament entre les tampons pH 7,4 et pH 5,0

Libération in vitro des médicaments

Le comportement de libération de PTX et TQD de PD-PTLP a été étudié dans des conditions pH 7,4 et pH 5,0 à 37 °C. Comme montré dans la Fig. 2c, une libération contrôlée des médicaments (PTX et TQD) a été observée de PD-PTLP tout au long de la période d'étude (72 h). La libération du médicament de la bicouche épaisse du nanoliposome pourrait être responsable de la libération lente et soutenue des deux médicaments de PD-PTLP. Il faut noter qu'aucune différence significative n'a été observée dans le profil de libération de PTX et TQD en pH 7,4 et pH 5,0. À des temps plus longs, une différence significative dans la libération a été observée dans différentes conditions de pH. Il est notable qu'aucun élément sensible au pH n'a été ajouté dans le nanoliposome et une libération plus élevée du médicament dans des conditions acides pourrait être attribuée à une diffusion plus élevée à pH plus bas. Par exemple, ~85 % de PTX libéré en conditions pH 5,0 comparé à ~55 % de libération de médicament à l'environnement pH physiologique. Un profil similaire de libération rapide de petites molécules dans des conditions acides et libération plus lente dans des conditions pH basiques a été démontré par d'autres chercheurs. Néanmoins, une libération de médicament relativement faible en conditions pH 7,4 pourrait réduire les effets secondaires systémiques inutiles et prolonger la circulation systémique tandis qu'une libération plus élevée en pH 5,0 pourrait bénéficier à une efficacité thérapeutique plus élevée dans les tissus tumoraux.

Analyse d'internalisation cellulaire in vitro

L'efficacité d'administration des nanoliposomes ciblés (PD-PTLP) et non ciblés (PTLP) a été testée dans SGC7901/ADR. L'internalisation cellulaire a été évaluée en utilisant la rhodamine-B comme traceur de fluorescence. La rhodamine-B est le fluorophore couramment utilisé sans interactions biologiques cellulaires. Le noyau a été coloré avec le DAPI bleu et la couleur rouge provenait des nanoparticules. Les données CLSM révèlent clairement que PD-PTLP exhibait une forte fluorescence rouge dans les cellules cancéreuses comparé au PTLP non ciblé. Une fluorescence rouge plus élevée dans les cellules cancéreuses traitées par PD-PTLP attribuée à une internalisation plus élevée des nanoparticules (Fig. 3a). Le résultat des données CLSM indique que le récepteur PD-L1 exprimé sur la membrane cellulaire a été reconnu par le mAb PD-L1 conjugué sur la surface du nanoliposome. Un mécanisme d'internalisation non spécifique ou passif était évident dans les cellules cancéreuses traitées par PTLP. La spécificité de ciblage PD-L1 a été confirmée par l'expérience de prétraitement avec mAb PD-L1. Les cellules SGC7901/ADR ont été prétraitées avec mAb PD-L1 et incubées pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été exposées à PD-PTLP et PTLP et incubées pendant 3 h. Comme montré (Fig. 3b), les cellules prétraitées avec mAb PD-L1 ont montré une fluorescence rouge significativement moindre comparé aux cellules non traitées, indiquant que le mAb PD-L1 a été consommé par les récepteurs exprimés en surface et aucun récepteur supplémentaire n'était disponible pour la liaison et l'internalisation, résultant en une moindre absorption des nanoparticules et une internalisation moindre. Ces CLSM ont clairement révélé la spécificité de ciblage de PD-PTLP dans les cellules cancéreuses SGC7901/ADR.

a Images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) des cellules SGC7901/ADR après incubation avec PTLP et PD-PTLP pendant 3 h ; images CLSM des cellules SGC7901/ADR prétraitées avec/sans mAb PD-L1 après incubation avec PD-PTLP pendant 3 h. La rhodamine B a été utilisée comme traceur fluorescent et le DAPI pour colorer le noyau des cellules cancéreuses

Les nanoliposomes à double chargement renforcent l'effet antiprolifératif

Pour la thérapie combinée, différents ratios de deux médicaments (PTX et TQD) ont été utilisés pour établir l'étendue de l'effet synergique ou additif sur les cellules de cancer gastrique résistantes. Pour calculer l'isobologramme et l'indice de combinaison (CI), le logiciel CalcuSyn (Biosoft, Version 2.1) a été utilisé. Le graphique isobologramme peut être expliqué sur la base de l'équation de Chou-Talalay. Les valeurs CI sont caractérisées par synergique (CI < 0,9), additif (CI = 1) et antagoniste (CI > 1). Comme montré, tous les ratios de combinaison de PTX et TQD ont révélé une valeur CI de < 1 signifiant un mécanisme d'action synergique (Fig. 4a). Plus spécifiquement, la synergie la plus élevée a été observée à une fraction de poids de 1/0,5 (P/T) tandis que le niveau de synergie diminuait avec l'augmentation de la fraction de poids de TQD, indiquant l'importance de la présence des deux médicaments dans une fraction de poids spécifique. Des concentrations trop faibles et trop élevées de TQD dans un régime combiné n'ont pas produit le meilleur effet synergique. Pour toutes les expériences in vitro, nous avons utilisé le ratio P/T = 1/0,5 dans l'étude.

a Indice de combinaison (CI) de différentes fractions de poids de PTX et TQD dans les cellules SGC7901/ADR. L'indice de combinaison a été évalué par le logiciel Calcusyn^TM. b Viabilités cellulaires in vitro des cellules SGC7901/ADR après traitement avec diverses concentrations de PTX libre, TQD, PTLP et PD-PTLP pour une période d'incubation de 24 h. c Analyse Western blot de l'expression de P-gp dans les cellules SGC7901/ADR après traitement avec les formulations respectives. **p < 0,01 et ***p < 0,001 est la différence statistique entre le groupe traité par PTX libre et le groupe traité par PD-PTLP

L'effet cytotoxique in vitro des médicaments individuels ainsi que combinés a été déterminé par le protocole MTT après 24 h d'incubation. Comme montré dans la Fig. 4b, les NP vides n'avaient aucun effet sur la viabilité cellulaire, écartant la possibilité de toute interférence dans les résultats finaux. La monothérapie avec PTX et TQD a bien montré un effet cytotoxique dépendant de la concentration dans les cellules de cancer gastrique résistantes ; elle est restée en deçà d'une efficacité appréciable dans le traitement. L'effet antiprolifératif d'un agent unique a été remarquablement amélioré lorsqu'il était combiné avec le second médicament encapsulé dans un nanoliposome. La combinaison de PTX et TQD a entraîné un effet synergique évident comparé aux médicaments individuels seuls. De plus, le nanoliposome conjugué au mAb PD-L1 (PD-PTLP) a exhibé l'effet antiprolifératif le plus fort, indiquant l'influence du ligand de ciblage sur la surface de la nanoparticule. Cet effet accru de destruction cellulaire dans le groupe de traitement ciblé PD-L1 pourrait être attribué à l'internalisation cellulaire élevée des nanoliposomes ciblés PD-L1 par les cellules SGC7901/ADR, cohérent avec l'analyse d'internalisation cellulaire. La valeur IC50 de PD-PTLP était de 0,76 μg/ml comparée à 6,58 μg/ml et 7,64 μg/ml pour PTX et TQD, respectivement. Une diminution de dix fois de la valeur IC50 de PD-PTLP indique clairement que la résistance au PTX dans les cellules SGC7901/ADR surexprimant P-gp a été inversée par TQD. Nos résultats in vitro ont montré que TQD était efficace pour inverser la multirésistance dans les cellules SGC7901/ADR. Les résultats ont également montré que les nanoliposomes conservaient les actions pharmacologiques des médicaments encapsulés et libéraient le médicament de manière contrôlée dans les cellules cancéreuses. La thérapie combinée avec PTX et TQD a amélioré l'efficacité anticancéreuse avec une activité synergique accrue, surpassant les avantages minimaux de la monothérapie et les effets secondaires possibles associés. Globalement, le traitement combiné de PTX avec un inhibiteur P-gp efficace dans un nanoliposome pourrait être une stratégie prometteuse pour surmonter la MDR et traiter les cancers gastriques.

Afin d'évaluer le mécanisme moléculaire, une analyse Western blot a été réalisée sur SGC7901/ADR. Comme montré (Fig. 4c), le PTX n'avait aucun effet sur l'expression de la protéine P-gp, tandis qu'au contraire, le TQD a significativement diminué l'expression de P-gp, confirmant son rôle pharmacologique d'inhibiteur de P-gp. Intéressant, les médicaments combinés basés sur PTLP et PD-PTLP ont montré une différence insignifiante dans l'expression de la protéine comparé aux cellules cancéreuses traitées par TQD. Le résultat a démontré l'avantage de charger PTX et TQD (inhibiteur P-gp) ensemble dans un seul système de nanovecteur. Le résultat du Western blot pourrait être corroboré avec les résultats de viabilité cellulaire où la combinaison de PTX + TQD a inversé la MDR et exhibé une efficacité anticancéreuse plus élevée dans les cellules de cancer gastrique.

Analyse de l'apoptose par cytomètre de flux

L'analyse de l'apoptose des formulations individuelles a été évaluée par la méthode de coloration Annexin V-FITC/PI utilisant un cytomètre de flux. Les résultats de l'apoptose sont présentés dans la Fig. 5a. Comme montré, les cellules témoins n'ont montré aucun signe d'apoptose, tandis que le PTX libre et TQD ont exhibé une augmentation évidente des cellules en apoptose. Le médicament combiné basé sur PTLP a montré une apoptose deux fois plus élevée comparé aux médicaments individuels, indiquant l'effet anticancéreux synergique des formulations. Plus important encore, PD-PTLP a montré l'apoptose la plus élevée des cellules cancéreuses avec environ 60 % dans la région d'apoptose. L'effet d'apoptose accru de PD-PTLP a été attribué à une internalisation plus élevée des nanovecteurs à double chargement et au potentiel synergique de PTX et TQD de manière ratiométrique. L'effet de silence P-gp de TQD dans le régime combiné a amélioré l'effet anticancéreux de PTX dans les cellules cancéreuses. Le taux d'apoptose du médicament individuel était dans la plage entre 20 et 25 % tandis qu'environ 60 % de cellules en apoptose ont été observées pour les cellules traitées par PD-PTLP. PD-PTLP a induit plus d'apoptose que les médicaments libres et les liposomes non ciblés, suggérant que PD-L1 pouvait administrer PTX/TQD plus efficacement pour induire l'apoptose des cellules SGC7901/ADR.

a Essai d'apoptose des cellules SGC7901/ADR après coloration avec le combo Annexin V/PI utilisant un cytomètre de flux. Les cellules ont été traitées avec une concentration fixe de 2 μg/ml. b Analyse des espèces réactives de l'oxygène (ROS) des cellules SGC7901/ADR utilisant le 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) comme sonde. ***p < 0,001 est la différence statistique entre le groupe traité par PTX libre et le groupe traité par PD-PTLP

Détermination du niveau intracellulaire de ROS

Nous avons exploré la capacité des médicaments individuels et combinés à affectuer l'état redox des cellules cancéreuses en évaluant le niveau d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules de cancer gastrique. Les niveaux de ROS dans les cellules cancéreuses ont été évalués par DCFH-DA (fluorescence verte). Les données quantitatives de ROS sont présentées dans la Fig. 5b. Comme montré, les cellules non traitées n'avaient aucun signe de ROS ; cependant, PTX ou TQD ont induit des niveaux appréciables de génération de ROS. Important, TPLP et PD-TPLP ont déclenché des niveaux significativement plus élevés de ROS comparé au PTX libre ou TQD ou cellules témoins non traitées. Un ROS remarquablement plus élevé indique le potentiel de PD-TPLP à promouvoir une apoptose plus élevée. Les images microscopiques corroborent les résultats quantitatifs avec une fluorescence verte plus brillante et d'intensité plus élevée comparé aux cellules non traitées ou traitées par PTX libre ou TQD. L'intensité plus élevée de la fluorescence verte est une indication d'une production plus élevée de ROS. Le stress oxydatif tel que ROS est considéré comme un indicateur important de la cytotoxicité cellulaire. Des études ont montré que l'induction de ROS induit une multitude d'événements physiologiques, y compris les dommages à l'ADN, l'inflammation et l'apoptose cellulaire.

Combinaison de PTX et TQD inhibe la croissance des tumeurs résistantes aux médicaments

Finalement, l'efficacité thérapeutique et les paramètres de toxicité des formulations ont été étudiés sur un modèle de tumeur xénogreffe SGC7901/ADR résistante aux médicaments (Fig. 6a). Les médicaments ont été administrés par voie intraveineuse à une dose fixe de 5 mg/kg tous les 3 jours avec un total de trois injections. Le PTX/TQD a été administré à une fraction de poids fixe de 1/0,5. Comme prévu, le PTX libre et le TQD libre n'ont montré aucun effet inhibiteur sur la croissance des tumeurs MDR, suggérant le fait que les cellules SGC7901/ADR manifestent une tolérance aux médicaments sur la prolifération des tumeurs MDR. L'inhibiteur P-gp (TQD), bien qu'efficace pour inhiber les pompes d'efflux de médicaments, ne se convertit cependant pas en un résultat thérapeutique amélioré. En comparaison, la combinaison de PTX + TQD (PTLP) a affiché une inhibition significative de la croissance des tumeurs résistantes aux médicaments. La meilleure efficacité antitumorale a été observée avec PD-PTLP, qui était trois fois plus efficace comparé au témoin, 2,5 fois comparé aux médicaments libres, et environ deux fois plus efficace pour réduire la charge tumorale comparé aux formulations non ciblées (p < 0,05 ; p < 0,001). Le volume tumoral final du témoin, PTX libre, TQD, PTLP et PD-PTLP était ~2000 mm³, ~1650 mm³, 1625 mm³, ~1000 mm³ et ~650 mm³, respectivement. Les médicaments libres étaient légèrement efficaces au point de temps initial ; cependant, ils ont grandi de la même manière que le groupe témoin non traité. Les résultats révèlent clairement le potentiel de la combinaison de PTX + inhibiteur P-gp comme stratégie unique pour contrôler efficacement la charge tumorale. La suppression tumorale extensive dans PD-PTLP suggère clairement la plus grande efficacité antitumorale du groupe de formulations ciblées. Les tumeurs ont été extraites et pesées ; les poids tumoraux étaient cohérents avec les données de volume tumoral (Fig. 6b). Le groupe de souris traitées par PD-PTLP a montré la plus petite tumeur comparé à tout autre groupe traité par formulation (p < 0,001). Pour vérifier davantage l'effet inhibiteur des tumeurs individuelles, les tumeurs ont été soumises à l'essai TUNEL (Fig. 6c). Comme montré, PD-PTLP a montré de vastes étendues de coloration d'apoptose comparé au témoin non traité ou aux médicaments libres. PD-PTLP a montré des traits d'apoptose apparents avec des arrangements cellulaires désorganisés. L'effet important de destruction tumorale de PD-PTLP affiche la plus grande inhibition des cellules cancéreuses dans les cellules tumorales résistantes aux médicaments. L'excellente efficacité de PD-PTLP était principalement attribuée à la présence du ligand ciblé (mAb PD-L1) qui se lie aux récepteurs respectifs et augmente les concentrations intracellulaires. La présence du régime combiné et la libération de manière contrôlée pendant une période prolongée ont également contribué à son efficacité accrue. De plus, la couronne de surface PEG hydrophile dense pourrait offrir une excellente stabilité physique aux particules et pourrait potentiellement éviter l'absorption protéique inutile et éviter l'élimination rapide. La longue circulation et la taille nanométrique bénéficient à leur tour à l'accumulation plus élevée des particules dans les tissus tumoraux [31-33].

Efficacité antitumorale in vivo de différentes formulations contre les tumeurs SGC7901/ADR multirésistantes (MDR) ; a volume tumoral, b analyse du poids tumoral, et c essai TUNEL des tissus tumoraux. Les souris ont été administrées avec une dose fixe de 5 mg/kg avec une durée de trois fois pour trois administrations. Les cellules apoptotiques ont été évaluées par essai TUNEL. *p < 0,05 et **p < 0,05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p < 0,001 (PTX vs. PD-PTLP) - groupe traité

Analyse de la toxicité systémique

Le changement de poids corporel est un bon indicateur de toxicité systémique. Comme montré (Fig. 7a), les souris traitées avec du PTX libre ont perdu ~20 % de poids corporel au jour 10, ce qui a diminué progressivement pour retrouver le poids corporel original vers la fin de l'étude. Une perte de plus de 5 % du poids corporel est considérée comme causant une toxicité interne sévère et une perte de 20 % du poids corporel est considérée comme un effet indésirable significatif des médicaments libres [31]. Au contraire, PTLP ou PD-PTLP n'ont pas causé une telle perte de poids et les souris sont restées en bonne santé tout au long de la période d'étude, indiquant l'innocuité des nanoliposomes. Un système d'administration sans toxicité systémique et avec une efficacité antitumorale améliorée est considéré comme hautement efficace dans le traitement des tumeurs. La sécurité des nanoparticules a été étudiée davantage en mesurant les niveaux plasmatiques d'enzymes. Les niveaux plasmatiques d'aminotransférases (AST et ALT) ont été mesurés suite à l'administration de 24 h des formulations respectives (Fig. 7b, c). Comme montré, le PTX libre a entraîné une augmentation significative (p < 0,01) des niveaux d'AST et ALT tandis que PD-PTLP et PTLP étaient insignifiquement différents comparé au témoin non traité. L'AST est libérée dans le sérum lors de dommages d'organes tels que le cœur, les reins ou le foie, tandis que l'ALT est spécifiquement libérée en cas de lésion hépatique [34]. Les niveaux d'AST et ALT servent d'indicateur spécifique de dommage d'organe et à cet égard, PD-PTLP s'est montré être un vecteur sûr.

Analyse de toxicité systémique des formulations individuelles dans les tumeurs SGC7901/ADR ; a analyse du poids corporel des souris ; b, c évaluation biochimique sanguine des niveaux sériques d'AST et ALT comme paramètres de toxicité systémique. *p < 0,05 et **p < 0,01 est la différence statistique entre le groupe traité par PTX libre et le groupe traité par PD-PTLP

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'information supplémentaires.

Abréviations

EPR :

Effet de perméabilité et de rétention accrue

PD-PTLP :

Nanoliposomes conjugués au mAb PD-L1 chargés en PTX et TQD

P-gp :

Glycoprotéine P

PTLP :

Nanoliposomes chargés en PTX et TQD

PTX :

Paclitaxel

TQD :

Tariquidar