Fullerénol hydrosoluble à groupes hydroxyles optimisés : inactivation photodynamique biphotonique de microbes infectieux à ultra-faible énergie

Matériaux et Méthodes

Préparation et caractérisation des fullerénols hydrosolubles, C₆₀(OH)₂₁ et C₆₀(OH)₄₆

Le fullerène brut a été obtenu commercialement (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), et le précurseur C₆₀(OH)₁₂ a été produit comme décrit précédemment. D'abord, 100 mL de solution de peroxyde d'hydrogène à 30 % (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés au matériau de départ, 0,5-1,0 g de C₆₀(OH)₁₂, et le mélange a été vigoureusement agité à 60 °C sous air. Après refroidissement, un mélange de solvants comprenant 2-propanol, éther diéthylique et hexane (100-200 mL chacun ; Sigma-Aldrich) a été ajouté à la solution, qui a été ensuite centrifugée et décantée. Le solide restant a été lavé deux fois avec 200 mL d'éther diéthylique par centrifugation et décantation. Finalement, les produits finaux de C₆₀(OH)₂₁ et C₆₀(OH)₄₆ hydrosolubles ont été obtenus en séchant le résidu sous vide à température ambiante pendant la nuit, respectivement. Le poids du produit final a été calibré par analyse thermogravimétrique. La morphologie du produit final a été observée par microscopie électronique à transmission à haute résolution (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tokyo, Japon) à une résolution d'environ 1,11 ± 0,03 nm et 1,13 ± 0,04 nm pour C₆₀(OH)₂₁ et C₆₀(OH)₄₆ respectivement. La diffusion dynamique de la lumière (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, West Midlands, UK) a aussi servi à déterminer la taille des matériaux. Les groupes fonctionnels exposés des matériaux préparés ont d'abord été examinés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR, RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). La spectroscopie UV-vis des matériaux a été réalisée avec un spectromètre (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tokyo, Japon). La chimie de surface du fullerénol a été examinée par spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS, spectromètre PHI 5000 VersaProbe, Chanhassen, MN, USA). Le poids moléculaire du fullerénol a été déterminé par spectrométrie de masse par désorption de champ (FD, AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tokyo, Japon), et le nombre de groupes hydroxyles a été confirmé à 21 et 46 respectivement.

Cultures bactériennes

E. coli, issu de notre propre laboratoire, a été cultivé sur gélose nutritive LB (par litre : tryptone 10 g, extrait de levure 5 g, chlorure de sodium 8 g, agar 15 g, pH ajusté à 7,5) (Sigma-Aldrich) et incubé à 37 °C.

Essai de biocompatibilité par comptage d'unités formant colonies (UFC)

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) a été mis en présence du matériau (0-9 μg mL⁻¹) et incubé 3 h à 37 °C (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1). Après incubation, le mélange a été centrifugé et les pellets de bactéries dilués (OD₆₀₀ ~ 0,05). Un facteur de dilution de 10⁻⁵ à 10⁻⁸ a été appliqué aux bactéries incubées et ensemencé sur plaques d'agar. Les plaques sont restées en incubateur (37 °C) pendant la nuit. Le nombre de bactéries survivantes a été déterminé et exprimé en pourcentage (%) correspondant à l'unité UFC mL⁻¹ après incubation. Données en moyennes ± écart-type (n = 6).

Mesure de ψ_Δ

Selon l'étude précédente, ψ_Δ peut être obtenu. Les mesures de ψ_Δ ont été réalisées dans D₂O à 355 nm, en utilisant le meso-tétra(4-sulfonatophényl)porphine dichlorhydrate (TSPP ; Sigma-Aldrich) comme référence (ψ_Δ = 0,64).

Mesure du rendement quantique de fluorescence

Le rendement quantique de photoluminescence (PL) relatif de l'agent de contraste est généralement le rapport des photons émis aux photons absorbés :

$$ \mathrm{QY}={\mathrm{QY}}_{\mathrm{ref}}\ \left({\eta}^2/{\eta_{\mathrm{ref}}}^2\right)\left(I/A\right)\left({A}_{\mathrm{ref}}/{I}_{\mathrm{ref}}\right) $$ (1)

où QY_ref = 0,28 est le QY de la Cy5.5 dissoute dans le DMSO (Sigma-Aldrich) comme référence, η est l'indice de réfraction de l'eau bidistillée = 1,33 (η_ref du DMSO = 1,48), I l'intensité de fluorescence intégrée et A l'absorbance à la longueur d'onde d'excitation. L'excitation monophotonique (OPE) ou biphotonique (TPE) donne le même QY.

Système optique laser femtoseconde pour mesures d'absorption biphotonique (TPA) et luminescence biphotonique (TPL)

Un système optique laser femtoseconde titane-saphir (ti-sa) fait maison (taux de répétition 80 MHz ; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) a été utilisé selon les études précédentes.

Mesure TPA

Avec une vitesse de balayeur galvanométrique de 2 m ms⁻¹, le spectre d'excitation a été mesuré de 720 à 820 nm avec une puissance d'excitation de 2,8 mW [puissance avant objectif ; puissance après objectif (ou sur échantillon) de 0,9856 mW ou 98,56 nJ pixel⁻¹]. Ainsi, les spectres TPA relatifs en fonction de la longueur d'onde d'excitation pour les fullerénols ont été mesurés.

Mesure des spectres TPL

Le matériau a été exposé à la TPE du laser femtoseconde à une longueur d'onde d'excitation de 760 nm, une zone de balayage de 200 × 200 μm², une fréquence de 10 kHz, un temps d'exposition de 1,638 s/(balayage, pixel) = 100 μs, 128 × 128 pixels balayage⁻¹, et une surface de pixel de 1562,5 × 1562,5 nm². La surface du foyer focal a été calculée comme πd²/4, où d = 0,61 λ/ouverture numérique (NA) est la largeur à mi-hauteur de la taille du faisceau. Par exemple, au point focal x–y avec excitation 760 nm et un objectif × 40 à immersion d'huile avec NA de 1,3, d = 0,61 × 800 nm/1,3 = 375,38 nm = 0,37538 μm, et la résolution de l'axe z a été mesurée à 0,90159 μm. Pour l'excitation 760 nm, le temps d'exposition par balayage pour un nanomatériau individuel s'exprime comme (surface du foyer focal/surface du pixel) × 100 = 4,0776 ms, et le temps d'exposition total t = 4,0776 ms × nombre de balayages. Un objectif × 40 à immersion d'huile (NA 1,3) a été utilisé pour collecter les signaux, et la plage de détection du spectromètre était 300-695 nm.

De plus, les calculs de puissance laser (mW ou nJ pixel⁻¹) utilisés sur l'échantillon étaient les suivants. Pour l'objectif × 40 à immersion d'huile (NA 1,3), le taux de transmission à 760 nm est d'environ 88 % dans ce système optique, et la puissance laser de la sortie à l'objectif n'est que 40 % de la puissance de sortie originale en raison des pertes. Par conséquent, l'énergie calculée après l'objectif (sur échantillon) est P_output (mW) × 40 % × 88 % = 0,352 × P_output (mW). Par exemple, P_output = 2,8 mW, l'énergie calculée après l'objectif (sur l'échantillon) est 3,0 mW × 40 % × 88 % = 0,9856 mW. Avec un taux de balayage de 10 kHz (chaque impulsion reste 0,1 ms pixel⁻¹), l'énergie calculée sur l'échantillon (J pixel⁻¹) était d'environ P_output (mW) × 40 % × 88 % × 0,1 ms = 0,0352 × P_output (J pixel⁻¹). Par exemple, P_output = 2,8 mW, l'énergie (J pixel⁻¹) sur échantillon = 2,8 mW × 40 % × 88 % × 0,1 ms = 0,09856 μJ pixel⁻¹ = 98,56 nJ pixel⁻¹. La puissance après l'objectif (sur l'échantillon) a été utilisée et mentionnée tout au long de ce manuscrit.

Mesure de la section efficace absolue d'excitation biphotonique (TPE)

La section efficace absolue de TPE a été mesurée via le signal de luminescence par le système optique laser femtoseconde selon les études précédentes. La TPL de la fluorescéine et de la rhodamine B (Sigma-Aldrich) a dû être vérifiée. Les résultats sont montrés en Figure 1b et ont été obtenus en mesurant la dépendance de l'intensité d'émission avec une plage de puissance d'excitation de 704 nJ pixel⁻¹ (7,04 mW) à 2816 nJ pixel⁻¹ (28,16 mW). Une dépendance quadratique avec des exposants de 2,03 pour la fluorescéine et 2,02 pour la rhodamine B a été mesurée pour l'augmentation de la puissance d'excitation afin de déterminer la luminescence par TPE. Selon les études précédentes, les sections efficaces d'action de TPE pour la fluorescéine et la rhodamine B sont de 36,4 et 68,0 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹) respectivement, pour excitation 760 nm. Nous nous sommes aussi référés au site gratuit https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, fourni par le Prof. Chris Xu (Université Cornell, NY, USA). Les sections efficaces d'action TPE pour la fluorescéine et la rhodamine B ont été calculées à 36,5 et 66,1 GM respectivement (Tableau 1), indiquant une erreur < 5 % par rapport au laboratoire du Prof. Xu. Dans cette étude, la rhodamine B a été choisie comme référence standard pour déterminer la section efficace, et les sections efficaces absolues de TPE calculées pour les fullerénols C₆₀(OH)₂₁ et C₆₀(OH)₄₆ hydrosolubles étaient d'environ 1230,51 GM et 1037,21 GM respectivement. Les paramètres mesurés pour calculer les sections efficaces absolues de TPE des échantillons sont montrés au Tableau 3. Aucune variation inter-lot n'a été observée pour les matériaux en propriétés biphotoniques et capacité photodynamique biphotonique.

Système optique laser femtoseconde (pour microscopie d'imagerie de durée de vie de fluorescence, FLIM)

Un système optique laser femtoseconde ti-sa fait maison (taux de répétition 80 MHz ; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) a été utilisé selon les études précédentes. Les données de durée de vie et paramètres sont générés en utilisant l'ajustement par équation triple-exponentielle tout en surveillant l'émission sous TPE (Ex, 760 nm).

Calcul des taux de décroissance radiative et non-radiative

Le QY de PL et la durée de vie sont des paramètres majeurs pour étudier les caractéristiques d'émission de colorants fluorescents dans divers environnements. Le QY (Q) s'exprime comme :

$$ Q=\frac{\varGamma }{\varGamma +k} $$ (2)

où Γ est le taux de décroissance radiative, et k le taux de décroissance non-radiative. La durée de vie de fluorescence est généralement définie comme le temps moyen requis pour qu'un électron à l'état excité décroisse vers l'état fondamental. La durée de vie TPL τ peut aussi être relative aux taux de décroissance :

$$ \tau =\frac{1}{\varGamma +k} $$ (3)

D'après les équations (2) et (3), les taux de décroissance radiative et non-radiative peuvent être calculés.

Lors de l'absorption d'un photon, un des électrons faiblement liés de la molécule fluorescente — un fluorophore — est promu à un niveau d'énergie supérieur. Le fluorophore est alors dans un état excité, A*. Cet état est métastable ; le fluorophore retournera donc à son état fondamental stable, A. Il peut le faire soit radiativement en émettant un photon de fluorescence hν :

$$ A\ast \rightarrow A+ h\nu $$

soit non-radiativement en dissipant l'énergie de l'état excité sous forme de chaleur :

$$ A\ast \rightarrow A+\mathrm{chaleur} $$

La dépoblación de l'état excité dépend des voies de désexcitation disponibles. La fluorescence est la désexcitation radiative du niveau vibrationnel le plus bas du premier état singulet excité électroniquement, S₁, vers l'état fondamental électronique, S₀. Les états singulets sont les niveaux d'énergie qui peuvent être peuplés par l'électron faiblement lié sans renversement de spin. Les processus d'absorption et d'émission sont illustrés par un diagramme de niveaux d'énergie nommé d'après Aleksander Jablonski.

La durée de vie de fluorescence, τ, est le temps moyen pendant lequel un fluorophore reste dans l'état singulet excité électroniquement S₁ après excitation. τ est défini comme l'inverse de la somme des paramètres de taux pour tous les processus de dépoblación de l'état excité : Éq. (3), où la constante de taux non-radiative k est la somme de la constante de taux pour conversion interne k_ic et la constante de taux pour croisement intersystème vers l'état triplet k_isc tel que k = k_ic + k_isc. L'émission de fluorescence se produit toujours depuis le niveau vibrationnel le plus bas de S₁, une règle connue sous le nom de règle de Kasha, indiquant que le fluorophore n'a pas de mémoire de sa voie d'excitation ; par exemple, OPE et TPE donnent le même spectre de fluorescence, QY et durée de vie.

Détermination des taux de viabilité bactérienne après exposition laser

Méthode de comptage UFC

Bactéries (OD₆₀₀ ~ 0,05) mises en présence du matériau (3 ou 6 μg mL⁻¹) par incubation 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Après incubation, le mélange a été centrifugé et les pellets de bactéries dilués (OD₆₀₀ ~ 0,05) et exposés à une puissance TPE de 211,2 nJ pixel⁻¹ avec 800 balayages (environ 3,2621 s de temps d'exposition effectif total ; Ex, 760 nm). Ensuite, un facteur de dilution de 10⁻⁵ à 10⁻⁸ a été appliqué aux bactéries incubées et ensemencé sur plaques d'agar. Les plaques sont restées en incubateur (37 °C) pendant la nuit. Le nombre de bactéries survivantes a été déterminé et exprimé en pourcentage (%) correspondant à l'unité UFC mL⁻¹ après incubation. Données en moyennes ± écart-type (n = 6).

Kit LIVE/DEAD

Bactéries (OD₆₀₀ ~ 0,05) mises en présence du matériau (3 ou 6 μg mL⁻¹) par incubation 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Après incubation, le mélange a été centrifugé et les pellets de bactéries dilués (OD₆₀₀ ~ 0,05) et exposés à une puissance TPE de 211,2 nJ pixel⁻¹ avec 800 balayages (environ 3,2621 s de temps d'exposition effectif total ; Ex, 760 nm). Ensuite, les pellets ont été colorés avec un kit LIVE (SYTO 9, fluorescence verte)/DEAD (iodure de propidium, PI, fluorescence rouge) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) selon les instructions. La viabilité des bactéries a été quantifiée pour les tests antimicrobiens, montrant que presque toutes les bactéries traitées par le nanomatériau étaient mortes après traitement. Une viabilité similaire a été quantifiée par la méthode de comptage UFC pour déterminer les effets antibactériens efficaces des matériaux en PDT. Données en moyennes ± écart-type (n = 6).

Détection des ROS

Oxygène singulet (¹O₂)

(a) Matériau (3 ou 6 μg mL⁻¹) mis en présence de bactéries (OD₆₀₀ ~ 0,05), incubé 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Ensuite, le mélange a été exposé à la photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 balayages ; Ex, 760 nm) et finalement mélangé au réactif Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) (1 μM ; Thermo Fisher Scientific) (Ex/Em : 488/525 nm). Un spectromètre de fluorescence a été utilisé pour les mesures. Pour la neutralisation des ROS, le mélange a été mélangé à 30 ppm d'antioxydant α-tocophérol/linoléate de méthyle (Sigma-Aldrich) dans l'obscurité et exposé à la photoexcitation TPE avec le même traitement. (b) Matériau (3 ou 6 μg mL⁻¹) mis en présence de bactéries (OD₆₀₀ ~ 0,05), incubé 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Ensuite, exposé à la photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 balayages ; Ex, 760 nm) et finalement mélangé à 10 μM de trans-1-(2′-méthoxyvinyl)pyrène (t-MVP, Thermo Fisher Scientific) / 0,10 M SDS (Sigma-Aldrich) (Ex/Em : 352/465 nm). Pour la neutralisation des ROS, le mélange a été mélangé à 30 ppm d'antioxydant α-tocophérol/linoléate de méthyle dans l'obscurité. La réaction de t-MVP avec ¹O₂ donne un intermédiaire dioxétane qui fluorescence pendant sa décomposition en 1-pyrènecarboxaldéhyde. De plus, cette sonde fluorescente hautement sélective ne réagit pas avec d'autres espèces d'oxygène activées comme les radicaux hydroxyles, superoxyde ou peroxyde d'hydrogène. Un spectromètre de fluorescence a été utilisé pour les mesures. La neutralisation des ROS a été conduite avec le même traitement que précédemment décrit.

Anion radical superoxyde (O₂^·−)

(a) Matériau (3 ou 6 μg mL⁻¹) mis en présence de bactéries (OD₆₀₀ ~ 0,05), incubé 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Ensuite, exposé à la photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 balayages ; Ex, 760 nm) et finalement mélangé au 2,3-bis(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT, 0,45 mM ; Sigma-Aldrich). Ce matériau interagit avec O₂^·− et produit du XTT-formazan, résultant en une forte absorption (470 nm). Un spectromètre UV-vis a été utilisé pour surveiller cette absorption. Pour la neutralisation des ROS, le mélange a été mélangé à 30 ppm d'antioxydant α-tocophérol/linoléate de méthyle dans l'obscurité et exposé à la photoexcitation TPE avec le même traitement. (b) Matériau (3 ou 6 μg mL⁻¹) mis en présence de bactéries (OD₆₀₀ ~ 0,05), incubé 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Ensuite, exposé à la photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 balayages ; Ex, 760 nm) et finalement mélangé à 50 mM tampon bicarbonate (pH 8,60) et glutathion (γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine, GSH, Sigma-Aldrich) / 0,80 mM tampon bicarbonate (essai d'Ellman pour détection O₂^·−). Les expériences suivantes ont été conduites selon la procédure d'une étude précédente. La perte de GSH (%) a été calculée comme la différence d'absorbance entre l'échantillon et le témoin négatif divisée par l'absorbance du témoin négatif. Le signal de l'O₂^·− généré a été obtenu comme décrit dans le calcul précédent. Données en moyennes ± écart-type (n = 6).

Essai d'internalisation

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) a été incubé avec 3 μg mL⁻¹ de matériau. L'absorbance d'une quantité de 3 μg mL⁻¹ de matériau a été enregistrée par spectroscopie UV-vis (Abs, ~ 203 nm). Les matériaux ont été mélangés avec E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) à 37 °C de la 1^re à la 10^e heure respectivement, et centrifugés (1200 tr/min) pour éliminer l'excès de matériaux et garder le surnageant et mesurer son absorbance. La différence d'absorbance entre le surnageant collecté et les matériaux originaux a été estimée, donnant le pourcentage d'internalisation à chaque point temporel. Données en moyennes ± écart-type (n = 6).

Analyse statistique

La significativité statistique a été déterminée par analyse de variance. La valeur p a été considérée statistiquement significative pour tous les traitements.

Résultats et Discussion

Caractérisation du fullerénol hydrosoluble

Le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble (fullerénol), déterminé comme circulaire et monodispersé, a été synthétisé selon une étude précédente. La taille latérale moyenne du fullerénol était d'environ 1,13 ± 0,04 nm, déterminée par images TEM à bas grossissement (Figure 2a) et HR-TEM (Figure 2b). De plus, le fullerénol présentait une cristallinité favorable avec un bon espacement de réseau, correspondant à l'espacement d des franges de réseau {1\( \overline{1} \)00} du fullerénol. Cependant, ces particules peuvent former des agrégats par liaisons hydrogène en solution aqueuse à pH 7,0. La taille moyenne des agrégats formés était d'environ 130 nm, révélée par analyse DLS. De plus, les agrégats sont restés hautement stables pendant 3 mois dans différents environnements physiologiques : solution aqueuse pH 7,0, tampon phosphate 1× et milieu de culture (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Dans le spectre d'absorption UV-vis du fullerénol, des pics d'absorbance ont été observés à environ 216 et 309 nm, attribués respectivement à la transition π–π* des liaisons C=C aromatiques et aux transitions n–π* de l'épaule C=O. La transition π-électronique dans le fullerénol contenait de l'oxygène (Figure 2c), comme observé typiquement pour les dispersions aqueuses, confirmant la présence du fullerénol. Des caractérisations supplémentaires ont été effectuées par FTIR, XPS et spectrométrie de masse pour confirmer les propriétés des matériaux préparés. Le FTIR a analysé les groupes fonctionnels exposés des matériaux préparés. Les résultats ont révélé les bandes caractéristiques suivantes : bande d'étirement C–O à ~ 1109 cm⁻¹ (bande 1), bande d'étirement C–OH phénolique à ~ 1271 cm⁻¹ (bande 2), bande d'étirement C=O alcoolique tertiaire à ~ 1422 cm⁻¹ (bande 3), bande d'étirement C=C à ~ 1674 cm⁻¹ (bande 4), bande d'étirement C=O à ~ 1721 cm⁻¹ (bande 5), et bande d'étirement C–H liaisons hydrogène intermoléculaires et O–H carboxylate à ~ 3318 cm⁻¹ (bande 6). Une bande d'interférence CO₂ a aussi été observée. Ces bandes révèlent des groupes hydroxyles et carbonyls exposés ainsi que des liaisons C=C aromatiques (Figure 2d). L'XPS a examiné la chimie de surface du fullerénol, qui contient principalement des atomes de carbone. Les spectres C(1s) déconvolués du fullerénol ont révélé un cycle non oxygéné (C–C/C=C, 286,1 eV), liaison C–O (286,9 eV) et liaison C=O (288,0 eV). De plus, le rapport O(1s)/C(1s) était d'environ 35,8 % (Figure 2e). Le poids moléculaire du fullerénol a aussi été déterminé par spectrométrie de masse FD (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2) ; le nombre de groupes hydroxyles (C–OH) a été confirmé à 46, cohérent avec les ratios atomiques et compositions de liaisons du fullerénol résumés en Figure 2. Ces résultats de caractérisation confirment la synthèse réussie du fullerénol.

Génération de ROS par le fullerénol hydrosoluble sous TPE

Un PS absorbe et transfère l'énergie lumineuse à d'autres molécules non absorbantes pour générer des ROS, qui tuent les cellules cibles, endommagent la vasculature tumorale et activent une réponse immune antitumorale. Les PS ont un arrangement particulier d'électrons dans leurs orbitales moléculaires. Comme presque toutes les molécules, à l'état fondamental (singulet), les PS ont des paires d'électrons à spins opposés dans les orbitales moléculaires de basse énergie. L'absorption de lumière à une longueur d'onde appropriée élève un électron vers une orbitale de haute énergie sans changer son spin. C'est un état singulet excité (S₁) de courte durée (nanosecondes), et le PS peut perdre son énergie et retourner à l'état fondamental en émettant de la lumière (fluorescence) ou de la chaleur. Alternativement, un croisement intersystème, où le spin de l'électron excité s'inverse, peut se produire dans l'état S₁. Cette inversion de spin est responsable de la durée de vie relativement longue (microsecondes) de l'état triplet excité (T₁). Les transitions radiatives triplet-singulet sont inhibées car elles nécessitent un changement de spin électronique, processus lent. Depuis l'état T₁, le PS peut retourner à l'état fondamental en émettant de la lumière (phosphorescence) ou en transférant de l'énergie à une autre molécule. Il peut aussi perdre de l'énergie par conversion interne ou transitions sans rayonnement en collision avec d'autres molécules. Plus la durée de vie du PS dans l'état T₁ est longue, plus ses chances de collision avec une autre molécule sont grandes, résultant en production de ROS. La photosensibilisation des fullerénols hydrosolubles résulte en leur transition vers un état T₁ de longue durée et transfert d'énergie ou d'électrons à l'oxygène moléculaire, produisant des ROS comme ¹O₂ et O₂^·−, qui jouent un rôle majeur en PDT. Par conséquent, ¹O₂ et O₂^·− produits par le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble doivent être détectés directement par irradiation laser. Pour détecter la formation de ¹O₂ et O₂^·− pendant la PDT, dans cette étude, la PDT a été initiée en combinant le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble à l'état triplet excité, l'oxygène, et la lumière configurée à une longueur d'onde et énergie appropriées, ainsi qu'en introduisant les réactifs SOSG, t-MVP, XTT et GSH. Pour exploiter la capacité bactéricide potentielle des matériaux, une longueur d'onde d'environ 760 nm a été déterminée comme la plus efficace pour dériver le rapport TPA maximal relatif du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble sous TPE (Figure 3a) ; ceci est attribuable aux transitions interbandes impliquées. Cette longueur d'onde a été utilisée dans les expériences subséquentes. Le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble a été photoexcité par TPE à une puissance de 211,2 nJ pixel⁻¹ avec 800 balayages (Ex, 760 nm ; temps d'exposition effectif total ~ 3,2621 s) et dose délivrée de 3 ou 6 μg mL⁻¹ (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2). De plus, pour confirmer l'implication des ROS dans les effets PDT du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble, l'α-tocophérol a été utilisé pour la neutralisation des ROS. La quantité de ROS générés a diminué après ajout d'α-tocophérol, mais la viabilité bactérienne observée a augmenté comme attendu. De plus, la quantité de ROS générés dépendait de la dose délivrée. Pour prévenir la production de ¹O₂ et O₂^·− possiblement engendrée par l'exposition involontaire du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble à la lumière blanche — ce qui aurait pu compromettre les expériences — les expériences PDT subséquentes ont été conduites dans l'obscurité. Cette étude s'est concentrée sur les quantités de ¹O₂ et O₂^·− générés. Le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble a exhibé des effets antibactériens considérables, démontrant son potentiel d'application en PDT. Notamment, après la même expérience, le C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble (Fichier supplémentaire 1 : Figs. S3, S4 ; Figure 3a) était moins efficace pour former ¹O₂ et O₂^·− comparé au C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2). Le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble a généré plus de ¹O₂ et O₂^·− que le C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble ; de plus, le C₆₀(OH)₄₆ et C₆₀(OH)₂₁ hydrosolubles avaient des valeurs de Φ_Δ d'environ 0,93 et 0,85 respectivement (pour référence, Φ_Δ = 0,64 est le QY du TSPP dissous dans D₂O).

Détermination de la capacité antimicrobienne par TPE

Avant les expériences antimicrobiennes, la toxicité des fullerénols hydrosolubles doit être examinée pour exclure les facteurs pouvant contribuer à l'élimination bactérienne et fausser les résultats. De plus, pour prévenir la production possible de ROS engendrée par l'exposition involontaire des matériaux expérimentaux à la lumière blanche, qui pourrait fausser les résultats, les expériences PDT doivent être conduites dans l'obscurité. Cette étude a utilisé E. coli Gram-négatif comme modèle expérimental. Un essai de comptage UFC a déterminé le nombre de bactéries survivantes (exprimé en pourcentage, correspondant à UFC mL⁻¹). Les bactéries ont été traitées avec deux types de fullerénols hydrosolubles préparés (gamme de doses, 0 à 9 μg mL⁻¹) et incubées dans l'obscurité 3 h à 37 °C pour déterminer l'absorbance à 600 nm (OD₆₀₀ ~ 0,05 ; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1). Les niveaux de croissance des bactéries traitées avec les fullerénols hydrosolubles ont d'abord été surveillés en mesurant l'absorbance à 600 nm. L'absorbance initiale était 0,05 OD₆₀₀, et l'absorbance associée aux deux matériaux a atteint ~ 0,37 avec le temps. Aucun des deux matériaux n'inhibait la prolifération bactérienne. De plus, les matériaux ont engendré une réduction log₁₀ proche de 0 du nombre de bactéries survivantes (Figure 3b), correspondant à une viabilité d'environ 100 % (Figure 3c). Ainsi, les matériaux présentaient une excellente biocompatibilité avec les bactéries. Par conséquent, les matériaux soumis à 3 h d'incubation dans l'obscurité à 37 °C ont été utilisés pour les expériences. Bien que le fullerénol hydrosoluble puisse générer des ROS, les interactions entre matériaux et réactifs (SOSG, t-MVP, XTT, GSH) peuvent résulter en faux signaux ROS positifs, faussant les résultats PDT. Par conséquent, pour exclure cette possibilité, des bactéries ont été introduites et traitées avec les matériaux dans cette étude. La quantité de ROS générés par les E. coli traités par les matériaux photoexcités a été observée. Le Tableau 2 présente la quantité observée de ROS, révélant une tendance similaire aux Tableaux S2–S3 (Fichier supplémentaire 1 : matériaux seuls et Bacillus subtilis Gram-positif traités par matériaux) ; ces résultats étaient cohérents avec le signal de phosphorescence de ¹O₂ émis par les matériaux à 1270 nm (Figure 3d). La PDT contre E. coli a été réalisée par irradiation à faible dose d'énergie (211,2 nJ pixel⁻¹ avec 800 balayages, temps d'exposition effectif total ~ 3,2621 s ; Ex, 760 nm). Les effets de la PDT sur la viabilité de E. coli traité avec les matériaux photoexcités biphotoniques ont alors été déterminés (Figure 4). Aucun effet bactéricide n'a été observé sur les bactéries seules (avec ou sans exposition laser) ou sur le panel de bactéries traitées par les matériaux sans traitement laser (Figure 4a). Après TPE, la viabilité bactérienne était relativement faible ; spécifiquement, la viabilité pour le panel traité avec le C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble était d'environ 15 %, correspondant à une réduction d'environ 0,823 log₁₀ (Figure 4b). En revanche, la viabilité pour le panel traité avec le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble était d'environ 0 (efficacité d'élimination 100 %, correspondant à une réduction ~ 7,736 log₁₀). Quand la dose était augmentée, des effets bactéricides complets étaient observés pour les deux matériaux (Figure 4c, d). Cependant, les effets antimicrobiens ne différaient pas par type de bactérie (Gram-négatif E. coli ou Gram-positif B. subtilis) après photoexcitation (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5). De plus, concernant les fullerénols qui éliminaient les bactéries, une composition plus élevée en groupes hydroxyles augmentait la capacité bactéricide comparée à une composition plus faible sous conditions de traitement identiques.

Observation des E. coli traités par fullerénol hydrosoluble par TEM et investigation des propriétés biphotoniques

Pour observer la disruption des bactéries traitées par le matériau après photoexcitation, le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble à haute efficacité PDT a été sélectionné, et les bactéries ont été imagées par TEM. Les E. coli nus (Figure 5a) ont été incubés avec le fullerénol hydrosoluble pendant 3 h, résultant en une adsorption substantielle des matériaux sur les surfaces bactériennes. Néanmoins, aucune morphologie inhabituelle n'a été observée, indiquant une morphologie bactérienne vivante normale (Figure 5b). Les résultats de l'essai d'internalisation ont révélé l'adsorption des matériaux sur la surface bactérienne, avec un taux d'adsorption correspondant d'environ 85 % dans les premières 3 h d'incubation (Figure 5c) ; le taux a atteint la saturation de la 3^e à la 10^e heure. Par conséquent, les matériaux étaient adsorbés et formaient une barrière externe sur la surface bactérienne. Cependant, les E. coli présentaient une apparence déformée et des changements morphologiques sévères après 3 jours d'incubation (Figure 5d), résultant en une réduction de 0,940 log₁₀ correspondant à une viabilité d'environ 18 % (Figure 5f ; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6). L'absorption et le revêtement du matériau sur la surface bactérienne supprimaient l'absorption des nutriments essentiels pour la croissance microbienne et engendraient des changements de perméabilité de la membrane (paroi), induisant des déséquilibres osmotiques internes et inhibant la croissance microbienne. En d'autres termes, le fullerénol hydrosoluble avait des effets antibactériens (bactériostatiques ou bactéricides) après 3 jours d'incubation. De plus, les bactéries traitées par le matériau photoexcité, particulièrement E. coli, exhibaient des morphologies uniques avec dommages sévères après 3 h d'incubation (Figure 5e, f ; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6). Aucune bulle générée par la chaleur ne s'est formée sur la surface bactérienne endommagée, indiquant que le fullerénol hydrosoluble n'avait pas de propriétés photothermiques après photoexcitation (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7). La viabilité de E. coli a aussi été déterminée par fluorescence et quantification (Figure 6). La fluorescence verte indicative de bactéries vivantes en Figure 6a révèle que les bactéries exposées au seul traitement laser étaient largement indemnes, cohérent avec les résultats de Figure 5a. Des bactéries mortes étaient détectables après traitement avec les matériaux et exposition laser (fluorescence rouge en Figure 6b), résultat cohérent avec Figure 5e. La viabilité bactérienne a été quantifiée pour des tests antimicrobiens supplémentaires. Une élimination quasi-complète des bactéries traitées par le matériau (Figure 6c) a été observée. La viabilité a aussi été quantifiée par essai UFC (Figures 4a, b et 5f, et Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6) pour démontrer l'efficacité antibactérienne du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble en PDT. Selon les résultats des Figures 4, 5, 6 ; Tableau 2 ; et Tableau S2 (Fichier supplémentaire 1), E. coli traité avec le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble était sensible à la photoexcitation, menant à un taux de mortalité plus élevé, une génération de ROS accrue et un effondrement morphologique plus sévère comparé à E. coli traité avec le C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble. En général, la section efficace absolue pour TPE rend les fluorophores efficaces pour les études microscopiques non-linéaires car le rapport de l'énergie absorbée au flux d'énergie d'entrée vers un spécimen est élevé, minimisant le photodommage possible aux spécimens. Quand les techniques biphotoniques sont utilisées pour imager les activités moléculaires dans des préparations biologiques vivantes et tissus troubles, une section efficace favorable est souhaitable. Dans cette étude, la section efficace absolue de TPE calculée pour le C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble était d'environ 1037 GM (unité Goeppert-Mayer, 1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹) à une longueur d'onde d'excitation de 760 nm (la fluorescéine était la référence standard pour la section efficace [39, 40] ; Figure 1b et Tableaux 1 et 3) ; la section efficace absolue calculée pour le C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble était d'environ 1230 GM, similaire aux valeurs obtenues dans des études pertinentes. Ces sections efficaces absolues pourraient faciliter le processus biphotonique. De plus, la fluorescence du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble a été illuminée par un processus biphotonique (Figure 1b). Le QY de fluorescence relatif était d'environ 0,02 (le QY de la Cy5.5 dans le DMSO [31] servait de référence : QY_ref = 0,28) ; de même, le QY absolu [64] était d'environ 0,01, et les mêmes QY étaient dérivés pour OPE et TPE [31]. En revanche, le C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble avait des QY relatifs et absolus plus faibles (0,06 et 0,05 respectivement). De plus, cette étude a investigué la durée de vie des fullerénols. Les effets des taux de décroissance radiative et non-radiative sur le QY et la durée de vie ont été calculés. La durée de vie moyenne du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble était d'environ 7,797 ns, calculée à partir des durées de vie observées de 0,149, 1,775 et 19,679 ns ; la durée de vie moyenne du C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble était d'environ 5,251 ns (Figure 7 et Tableau 4). Par conséquent, le rapport des taux de décroissance radiative à non-radiative du C₆₀(OH)₄₆ hydrosoluble était d'environ 0,020 (dérivé de taux d'environ 2,565 × 10⁶ s⁻¹ à 1,257 × 10⁸ s⁻¹), tandis que celui du C₆₀(OH)₂₁ hydrosoluble était d'environ 0,064 (environ 1,143 × 10⁷ s⁻¹ et 1,790 × 10⁸ s⁻¹ ; Fichier supplémentaire 1 : Tableau S4). Cette constatation est attribuable à l'existence d'un groupe hydroxyle à la surface du fullerénol hydrosoluble, qui a induit la recombinaison non-radiative des paires électron-trou, menant à l'inhibition de l'émission d'état intrinsèque. Cependant, les groupes hydroxyles au bord du fullerénol hydrosoluble peuvent avoir un orbital moléculaire hautement occupé. Ceci peut être attribué à la forte interaction orbitale entre groupes hydroxyles, augmentant ainsi l'efficacité du croisement intersystème (plutôt que la génération de fluorescence) et générant de nombreux triplets de nanomatériaux avec une haute composition en groupes hydroxyles ; par conséquent, cela résulterait en une valeur élevée de Φ_Δ pour le fullerénol hydrosoluble et l'induirait à réagir avec l'oxygène selon le diagramme de Jablonski. Par conséquent, la PDT biphotonique peut être efficacement réalisée en utilisant une ultra-faible énergie en un temps extrêmement court, fournissant une approche alternative pour tuer les espèces malignes.

Conclusions

Cette étude a révélé qu'un matériau fullerénol hydrosoluble avec une composition plus élevée en groupes hydroxyles avait des photopropriétés supérieures à celles d'un fullerénol avec une composition plus faible ; les photopropriétés supérieures peuvent être attribuées à l'exposition laser réduite et aux matériaux utilisés pour le traitement. De plus, le fullerénol hydrosoluble avec une composition plus élevée en groupes hydroxyles a exhibé une TPA élevée, une section efficace absolue favorable pour TPE, et une haute stabilité biphotonique. Par conséquent, ce fullerénol a un potentiel comme PS biphotonique en PDT biphotonique couplée à la TPE. Cette propriété est probablement due à la présence d'un groupe hydroxyle à la surface du fullerénol hydrosoluble, qui a causé la recombinaison non-radiative des paires électron-trou, menant à l'inhibition de l'émission d'état intrinsèque. De plus, les groupes hydroxyles au bord du fullerénol hydrosoluble peuvent avoir un orbital moléculaire hautement occupé ; cela peut être attribué à la forte interaction orbitale entre les groupes hydroxyles, augmentant ainsi l'efficacité du croisement intersystème (plutôt que la génération de fluorescence) et générant de nombreux triplets de matériau avec une haute composition en groupes hydroxyles. Par conséquent, le fullerénol hydrosoluble aurait une valeur élevée de Φ_Δ et réagirait avec l'oxygène selon le diagramme de Jablonski. Par conséquent, la PDT biphotonique peut être efficacement réalisée en utilisant une ultra-faible énergie en un temps extrêmement court. En conséquence, cette approche alternative efficace pour gérer les espèces malignes présente des possibilités pour de futures applications cliniques.

Disponibilité des données et matériaux

Tous les ensembles de données sont présentés dans l'article principal.

Abréviations

PS:

Photosensibilisateurs

QY:

Rendement quantique

PDT:

Thérapie photodynamique

UV–vis:

Ultraviolet–visible

ROS:

Espèces réactives de l'oxygène

ψ_Δ:

Rendement quantique d'oxygène singulet

NIR:

Proche infrarouge

TPE:

Excitation biphotonique

E. coli:

Escherichia coli

HR-TEM:

Microscopie électronique à transmission à haute résolution

DLS:

Diffusion dynamique de la lumière

FTIR:

Infrarouge à transformée de Fourier

XPS:

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

FD:

Désorption de champ

CFU:

Unité formant colonie

TSPP:

Meso-tétra(4-sulfonatophényl)porphine dichlorhydrate

PL:

Photoluminescence

DMSO:

Diméthylsulfoxyde

OPE:

Excitation monophotonique

TPA:

Absorption biphotonique

TPL:

Luminescence biphotonique

ti-sa:

Titane-saphir

NA:

Ouverture numérique

FLIM:

Microscopie d'imagerie de durée de vie de fluorescence

¹O₂:

Oxygène singulet

SOSG:

Singlet Oxygen Sensor Green

t-MVP:

Trans-1-(2′-méthoxyvinyl)pyrène

O₂^·−:

Anion radical superoxyde

XTT:

2,3-Bis(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide

GSH:

Glutathion, γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine

S₁:

Singulet

T₁:

Triplet

B. subtilis:

Bacillus subtilis

GM:

Goeppert-Mayer