Points quantiques de carbone dérivés de l'écorce de Phellodendron chinensis carbonisée protègent les reins contre l'insuffisance rénale aiguë induite par le venin de Deinagkistrodon acutus

Résumé

Contexte

En tant que nanomatériau émergent, les points quantiques de carbone (PQC) ont fait l'objet d'une attention considérable pour les applications biomédicales. Cependant, peu d'informations sont disponibles sur leur bioactivité d'inhibition de l'insuffisance rénale aiguë (IRA) induite par le venin de serpent.

Méthodes

Cette étude rapporte le développement d'un processus de pyrolyse vert, en une étape, pour synthétiser des PQC en utilisant l'écorce de Phellodendron chinensis (EPC) comme unique précurseur, et leur application potentielle comme protecteur contre l'IRA induite par le venin de Deinagkistrodon acutus (D. acutus) a été étudiée pour la première fois. Le modèle d'IRA a été établi en injectant le venin de D. acutus dans la cavité abdominale de souris et les effets protecteurs potentiels des PQC d'écorce de Phellodendron chinensis carbonisée (EPC-PQC) sur les anomalies rénales incluant la dysfonction, les réactions inflammatoires, les dommages tissulaires et la thrombopénie à six points temporels (1, 3 et 12 h, et 1, 2 et 5 jours) ont été investigués.

Résultats

Ces résultats ont démontré que les EPC-PQC inhibaient significativement la dysfonction rénale (réduction des concentrations de créatinine sérique (CRS), d'urée sanguine (US), de protéines urinaires totales (PUT) et de microalbuminurie (MALB)) et la production de chémoattractant (protéine chimiotactique des monocytes 1 (MCP-1)), de cytokines pro-inflammatoires (interleukine (IL)-1β) et de cytokine anti-inflammatoire (IL-10) en réponse à l'injection intrapéritonéale de venin de D. acutus. L'effet bénéfique des EPC-PQC sur les souris envenimées était similaire à celui sur le changement d'histologie rénale et la thrombopénie.

Conclusions

Ces résultats ont démontré les effets protecteurs remarquables des EPC-PQC contre l'IRA induite par le venin de D. acutus, ce qui non seulement élargirait les applications biomédicales des PQC mais fournirait également une cible potentielle pour le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques pour l'IRA induite par l'envenimation par morsure de serpent D. acutus.

Introduction

Deinagkistrodon acutus (D. acutus), appartenant à la famille des Viperidae, est considéré comme l'un des serpents terrestres les plus dangereux en Chine [1]. L'envenimation par D. acutus est associée à une série de symptômes tels qu'hémorragie, thrombopénie et dommage direct possible au rein [2, 3]. L'insuffisance rénale aiguë (IRA) est l'effet systémique le plus grave et la complication courante de l'envenimation par D. acutus qui mène directement à une dysfonction rénale persistante et une morbidité élevée [4, 5]. Le traitement topique actuel implique l'utilisation d'antivenin hyperimmunitaire dérivé du cheval comme antidote. Cependant, son efficacité est limitée pour neutraliser les dommages tissulaires locaux, surtout dans la survenue d'IRA, et a plusieurs effets insatisfaisants tels que des réactions anaphylactiques et pyrogéniques [6]. De plus, le coût relativement élevé et la mauvaise stabilité de l'antivenin contribuent également au traitement insatisfaisant des personnes mordues par D. acutus, surtout dans les zones sauvages ou rurales [7,8,9]. Par conséquent, il y a un besoin urgent de médicaments complémentaires efficaces, sûrs et abordables pour le traitement de l'IRA induite par le venin de D. acutus.

Les points quantiques de carbone (PQC), une nouvelle classe de nanomatériaux de carbone avec une taille < 10 nm, ont été découverts fortuitement par séparation et purification de nanotubes de carbone à paroi unique en 2004 [10] et ont attiré beaucoup d'intérêt au cours de la dernière décennie en raison de leurs propriétés remarquables telles que la biocompatibilité appréciable, la faible toxicité, la haute solubilité dans l'eau et les matières premières abondantes [11,12,13]. L'avènement des PQC a contribué à la recherche sur le développement de divers nanosystèmes « intelligents » incluant principalement ceux pour le bioimagerie [14], la biomédecine [15], l'administration de médicaments [16] et la photocatalyse [17].

Notamment, le développement de PQC avec un potentiel bioactif inhérent fournit de nombreuses stratégies pour la découverte d'une nouvelle génération de médicaments pour le contrôle ou le traitement efficace de certaines maladies en raison des avantages remarquables susmentionnés. Dans plusieurs bioactivités telles qu'antibactérienne pour traiter la kératite bactérienne [18], hémostatique [19], de type peroxydase [20], anticancéreuse, antivirale et anti-inflammatoire [21] ont été rapportées. Ces effets ont attiré l'attention des scientifiques pour étudier des applications pharmaceutiques et biomédicales supplémentaires des PQC. En particulier, les activités d'atténuation des PQC dérivés de l'épi de Schizonepeta carbonisée [22] sur l'hémorragie induite par le venin de D. acutus ont fourni une nouvelle perspective sur l'investigation des effets bénéfiques des PQC sur l'IRA induite par la morsure de serpent D. acutus, qui est restée peu comprise jusqu'à présent.

Les PQC d'écorce de Phellodendron chinensis carbonisée (EPC-PQC) sont synthétisés par pyrolyse directe de l'EPC (un type de médecine traditionnelle chinoise, utilisée depuis > 1000 ans) en utilisant un traitement de pyrolyse en une étape. Les EPC-PQC sont des PQC hypotoxiques variant en diamètre de 1,2 à 4,8 nm. Les EPC-PQC ont été rapportés pour posséder des effets hémostatiques remarquables, ce qui a non seulement élargi l'application biomédicale des PQC mais a également été pionnier dans l'élucidation de la base matérielle hémostatique de l'EPC [23]. Notamment, l'EPC, une médecine traditionnelle chinoise préparée par traitement au charbon, a été enregistrée pour la première fois dans les Prescriptions sacrées de Taiping pour le soulagement universel (978-992 ap. J.-C., en Chine). Le profil de sécurité et l'efficacité thérapeutique satisfaisante de l'EPC, tels que l'hémostase et l'anti-inflammation, ont encouragé son application clinique continue pendant plus de 1000 ans, ce qui a été reconnu dans la Pharmacopée de la République populaire de Chine (PRC, 2015). Cependant, l'étude de bioactivités sous-jacentes supplémentaires des EPC-PQC a été un défi. En particulier, il y a peu d'informations sur l'inhibition de l'IRA induite par l'envenimation de D. acutus.

De plus, la morsure de serpent envenimation a été rapportée pour potentiellement compromettre la physiologie rénale directement par les composants néphrotoxiques ou par l'activation ou la modulation de médiateurs immunitaires et inflammatoires [24]. Ces effets sont principalement sur les paramètres biomédicaux [25] (concentrations de créatinine sérique (CRS), d'urée sanguine (US), de protéines urinaires totales (PUT) et de microalbuminurie (MALB)), cytokines inflammatoires (interleukine (IL)-1β), cytokine anti-inflammatoire (IL-10) et protéine chimiotactique des monocytes 1 (MCP-1), le changement d'histologie rénale et le nombre de plaquettes (PLT). Dans la présente étude, nous avons synthétisé des EPC-PQC en utilisant une méthode de pyrolyse verte en une étape et, pour la première fois, investigué leurs effets protecteurs contre le développement de ces anomalies dans l'IRA induite par injection intrapéritonéale de souris avec le venin de D. acutus.

Matériaux et méthodes

Produits chimiques

Le matériau EPC a été acheté auprès de Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, Chine), et l'EPC carbonisée a été préparée dans notre laboratoire. Les membranes de dialyse avec un poids moléculaire de 1000 Da ont été achetées auprès de Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, Chine). Le kit de comptage cellulaire (CCK)-8 a été acheté auprès de Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japon). Le venin lyophilisé de D. acutus a été fourni par An Ren Snake Farm (Comté de Yujiang, Yingtan, Jiangxi, Chine) pour usage expérimental. Les autres réactifs chimiques de grade analytique ont été obtenus de Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, Chine). Les kits ELISA pour MCP-1, IL-10 et IL-1β de souris ont été achetés auprès de Cloud-Clone Corp. (Wuhan, Chine). Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant de l'eau déionisée (ED).

Animaux

La gestion animale et les protocoles de recherche ont été soutenus et approuvés par le Comité institutionnel d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université de médecine chinoise de Beijing. Des souris mâles Kunming (pesant 30,0 ± 2,0 g) ont été achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., avec un certificat de conformité pour animaux de laboratoire, et étaient gardées en cages à température et humidité constantes sur un cycle lumière/obscurité de 12 h avec accès ad libitum à la nourriture et à l'eau.

Préparation de la solution de venin

Le venin lyophilisé a été dissous dans du sérum physiologique avec mélange doux pendant 20 min (concentration finale : 5 mg/mL) et stocké à -20 °C jusqu'à utilisation.

Préparation des EPC-PQC

L'EPC carbonisée a été préparée en utilisant une méthode de pyrolyse en une étape avec l'EPC comme unique précurseur selon des méthodes précédentes [23]. Brièvement, les échantillons d'EPC étaient placés dans des creusets en porcelaine séparés et chauffés pendant 1 h à 350 °C dans un four préchauffé. Après refroidissement à 30 °C, les résidus noirs homogènes obtenus étaient broyés en poudre fine et bouillis deux fois dans l'eau à 100 °C pendant 1 h à chaque fois. Ensuite, la solution était collectée en pré-filtrant la suspension à travers une membrane d'acétate de cellulose de 0,22 μm. Les impuretés non carbonées étaient éliminées par dialyse contre l'ED pendant 72 h (poids moléculaire retenu : 1000 Da). La solution d'EPC-PQC était concentrée et stockée à 4 °C jusqu'à utilisation. Le diagramme de flux dans la Fig. 1 illustre le processus ci-dessus.

Caractérisation des EPC-PQC

La morphologie des PQC a été étudiée en utilisant un microscope électronique à transmission (MET, JEM-2100 electron, JEOL, Japon) avec une énergie électronique de 200 kV. Les détails structuraux ont été examinés en utilisant la MET à haute résolution (HRTEM) en utilisant un microscope électronique Tecnai G2 20 (FEI, USA). Le spectre ultraviolet-visible (UV-Vis) et les propriétés de fluorescence ont été enregistrés et mesurés en utilisant la spectroscopie UV-Vis (CECIL, Cambridge, UK) et de fluorescence (F-4500, Tokyo, Japon), respectivement. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a été utilisée pour analyser l'information des groupes fonctionnels de surface à une fenêtre spectrale entre 400 et 4000 cm⁻¹.

Tests de cytotoxicité

Les lignées cellulaires d'hépatocytes humains L02 et de rein embryonnaire humain 293 T ont été utilisées pour évaluer la cytotoxicité potentielle des EPC-PQC en utilisant un test CCK-8. Les cellules L02 étaient cultivées dans le milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contenant 10% de sérum fœtal bovin (SFB) tandis que les cellules 293 T étaient cultivées dans le milieu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) à haute teneur en glucose, contenant 10% de SFB. Les deux lignées cellulaires étaient incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% CO₂.

Les cellules L02 et 293 T étaient ensemencées à une densité de 2,0 × 10⁴ cellules/puits dans des plaques à 96 puits et cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5% CO₂ pendant 24 h. Ensuite, les deux types de cellules étaient traitées avec 100 μL de différentes concentrations (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 et 19,5 μg/mL) des solutions d'EPC-PQC en milieu sans sérum et incubées pendant 24 h supplémentaires. Par la suite, le milieu contenant les EPC-PQC était éliminé et les cellules étaient lavées deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS). La cytotoxicité était déterminée en lisant la plaque à 450 nm immédiatement après l'ajout de 10 μL du réactif CCK-8 et incubation pendant 4 h à 37 °C.

IRA induite par le venin de D. acutus et traitement

Modèle d'IRA induite par le venin de D. acutus

Le modèle murin d'IRA a été établi en injectant intrapéritonéalement les souris avec le venin de serpent D. acutus. Les souris étaient aléatoirement divisées en cinq groupes de 36 animaux chacun : contrôle ; modèle ; et groupes de traitement à forte, moyenne et faible dose d'EPC-PQC. Le groupe modèle recevait le venin de D. acutus à 1 mg/kg (0,15 mg/mL, 0,2 mL) poids corporel et 0,5 mL de sérum physiologique intrapéritonéalement, tandis que les groupes de traitement à forte, moyenne et faible dose d'EPC-PQC recevaient un volume équivalent de venin de serpent et d'extrait d'EPC-PQC à des doses de 8,0, 4,0 et 2,0 mg/kg, respectivement. Les souris injectées intrapéritonéalement avec seulement du sérum physiologique (SP) servaient de témoins. Six souris de chaque groupe étaient sacrifiées 1, 3 et 12 h après l'administration de SP, venin de D. acutus et EPC-PQC selon l'horaire décrit ci-dessus, tandis que les souris sacrifiées aux jours 1, 2 et 5 étaient continuellement administrées avec SP, venin de serpent D. acutus et EPC-PQC deux fois par jour.

Analyse des concentrations de PUT et MALB

Après administration des traitements respectifs, les animaux dans les groupes contrôle, modèle et EPC-PQC- (4,0 mg/kg) traités étaient immédiatement placés dans des cages métaboliques appropriées pour la collecte d'urine jusqu'à la fin de la période d'incubation (24 h). Les concentrations de PUT et MALB étaient analysées en utilisant un analyseur biochimique automatique.

Analyse des biomarqueurs de la fonction rénale

La fonction rénale était évaluée en mesurant les niveaux de CRS et US. Avant que les souris ne soient euthanasiées, des échantillons de sang étaient prélevés du plexus rétro-orbital et ensuite placés dans des tubes en plastique pendant au moins 4 h à 4 °C. Le sérum était obtenu par centrifugation à 750×g pendant 15 min, et les niveaux d'US et CRS étaient analysés en utilisant un analyseur biochimique automatique.

Détection des niveaux de cytokines inflammatoires

Les reins droits des souris étaient retirés, rapidement congelés dans de la glace sèche et stockés à -80 °C jusqu'à utilisation dans les procédures suivantes. Des échantillons de tissu (100 mg) des différents groupes étaient homogénéisés avec du PBS sur glace puis centrifugés à 750×g pendant 15 min. Les surnageants étaient collectés pour déterminer les niveaux de MCP-1, IL-10 et IL-1β en utilisant les kits ELISA respectifs selon les instructions du fabricant.

Histologie rénale

Les échantillons de tissu rénal gauche des souris étaient fixés dans du formol neutre tamponné à 10% à 4 °C pendant plus de 48 h, déshydratés, inclus dans la paraffine, coupés en sections, puis colorés avec l'hématoxyline et l'éosine (H&E). Les changements morphologiques étaient comparés entre les groupes contrôle, modèle et EPC-PQC-traités.

Activité thrombopénique

Le PLT était réalisé sur le sang prélevé des souris du plexus rétro-orbital et détecté en utilisant un analyseur hématologique automatisé (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japon).

Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée en utilisant le Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, version 13.0). Les données normalement distribuées et les variances homogènes sont exprimées comme moyennes ± écart-type (ET). Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test de différence significative la plus faible (LSD) a été utilisée pour les comparaisons multiples. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Caractérisation des EPC-PQC

Le MET a été utilisé pour observer directement la morphologie et la distribution de taille des EPC-PQC (Fig. 2a, c et d). Les PQC préparés étaient sphériques et uniformes en taille, la plupart à 2,84 ± 0,89 nm sans agrégats distincts. L'image HRTEM montrait des franges de réseau (0,24 nm) des PQC, qui correspondaient au carbone graphitique comme montré dans la Fig. 2b.

Comme représenté dans la Fig. 3a, les PQC présentaient une fluorescence bleue distincte avec un pic maximum à 445 nm suite à une excitation à 370 nm. En conséquence, l'information optique sur les EPC-PQC affichée dans le spectre UV-Vis montrait un pic d'absorption fort à 265 nm correspondant à la transition π-π* de molécules organiques conjuguées sur les surfaces des PQC (Fig. 3b).

De plus, les groupes fonctionnels des PQC formulés ont été identifiés en détail sur la base du spectre FTIR, comme représenté dans la Fig. 3c. Le pic à 3433 cm⁻¹ était assigné aux bandes d'absorption des vibrations d'étirement O-H et N-H tandis que les vibrations d'étirement C-H apparaissaient à 2923 cm⁻¹ et 2853 cm⁻¹. En outre, le pic d'absorption à 1624 cm⁻¹ indiquait la présence de C=O. Les liaisons C-O-C étaient observées à 1109 cm⁻¹, et le pic à 1400 cm⁻¹ était attribué à l'étirement C-N. Ces résultats étaient cohérents avec ceux des rapports précédents.

Cytotoxicité in vitro

Pour évaluer la cytotoxicité, les cellules L02 et 293 T étaient exposées à diverses concentrations des EPC-PQC pendant 24 h et la viabilité était examinée en utilisant le test CCK-8. Comme illustré dans la Fig. 4a, la viabilité des cellules L02 traitées avec les EPC-PQC était > 85% par rapport à celle des cellules témoins, même à une concentration aussi élevée que 5 mg/mL. De même, les EPC-PQC n'affectaient pas la croissance des cellules 293 T à des concentrations allant jusqu'à environ 2500 μg/mL (Fig. 4b). Ces résultats indiquaient que les EPC-PQC montraient une faible cytotoxicité.

Effet des EPC-PQC sur les concentrations de PUT et MALB

Comparé au niveau de PUT dans le groupe contrôle (0,98 ± 0,38 mg/L), les niveaux de PUT augmentaient significativement dans le groupe traité au venin de D. acutus (3,08 ± 0,92 mg/L, P < 0,01) et le groupe EPC-PQC (2,36 ± 0,83 mg/L, P < 0,05) (Fig. 5a). De plus, le niveau de PUT diminuait après le traitement par EPC-PQC par rapport aux niveaux suivant l'administration de venin (P < 0,05). En outre, le niveau de MALB augmentait évidemment 24 h après l'injection intrapéritonéale de venin de D. acutus (17,78 ± 5,96 mg/L, P < 0,01) par rapport à celui du groupe contrôle (2,02 ± 0,91 mg/L). En contraste, les souris traitées par EPC-PQC montraient une tendance à la diminution du niveau de MALB (14,25 ± 4,16 mg/L, Fig. 5b).

Les EPC-PQC soulagent la dysfonction rénale dans l'IRA induite par le venin de D. acutus chez la souris

La fonction rénale a été évaluée en mesurant les niveaux d'US et CRS, qui sont montrés dans les Figs. 6 et 7. Les souris traitées avec le venin de D. acutus avaient des niveaux d'US (12,07 ± 1,00 mmol/L [1 jour], P < 0,01 ; 11,43 ± 1,37 mmol/L [2 jours], P < 0,01 ; 14,83 ± 2,53 mmol/L [5 jours], P < 0,01) et de CRS (12,83 ± 1,43 μmol/L [1 jour], P < 0,01 ; 13,48 ± 2,26 μmol/L [2 jours] ; P < 0,01. 13,80 ± 1,90 μmol/L [5 jours], P < 0,01) significativement plus élevés que les souris traitées au SP (US : 8,95 ± 1,04 [1 jour], 9,53 ± 1,40 [2 jours] et 9,07 ± 1,57 [5 jours] mmol/L ; CRS : 9,40 ± 0,89 [1 jour], 10,27 ± 2,04 [2 jours] et 9,85 ± 1,99 [5 jours] μmol/L) du jour 1 au 5 (Figs. 6a et 7a). Notamment, comparé au groupe modèle, le traitement par EPC-PQC à faible dose inhibait significativement l'augmentation des niveaux de CRS (9,77 ± 0,79 μmol/mL, P < 0,01) et d'US (10,50 ± 1,38 mmol/L, P < 0,05), tandis que les doses forte (9,62 ± 1,87 μmol/mL, P < 0,01) et moyenne (10,75 ± 1,48 μmol/mL, P < 0,05) inhibaient l'augmentation du CRS (Fig. 7b) mais pas de l'US (Fig. 6b) induite par le venin de D. acutus au jour 1. Les niveaux de CRS (Fig. 7c) des groupes traités par EPC-PQC à forte, moyenne et faible dose diminuaient (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 et 10,68 ± 1,41 μmol/mL, respectivement ; P < 0,05) par rapport au groupe modèle au jour 2. De plus, comparé au groupe modèle, les niveaux d'US diminuaient significativement dans les groupes EPC-PQC à forte dose (9,57 ± 0,52 mmol/L, P < 0,01) et faible dose (10,72 ± 2,04 mmol/L, P < 0,05) mais pas le groupe à dose moyenne (Fig. 6c) au jour 2. Comme montré dans les Figs. 6d et 7d, des effets inhibiteurs étaient observés sur les niveaux des deux indices à forte dose (12,28 ± 1,65 mmol/L, P < 0,01 (US) ; 11,38 ± 1,80 μmol/mL, P < 0,05 (CRS), respectivement) et dose moyenne (12,40 ± 1,33 mmol/L, P < 0,05 (US) ; 10,83 ± 2,57 μmol/mL, P < 0,05 (CRS), respectivement) d'EPC-PQC. De plus, aucune différence significative n'était observée entre les groupes contrôle et EPC-PQC-traités pour le CRS.

Les EPC-PQC inhibent la sécrétion de cytokines

Les effets de trois concentrations d'EPC-PQC sur la production de chémoattractant (MCP-1) et de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β) et anti-inflammatoires (IL-10) en réponse aux injections de venin de D. acutus ont été investigués. La Figure 8 a montré que l'injection de venin augmentait l'IL-1β libérée dans le modèle murin (1 h : 58,19 ± 5,35 ng/mL, P < 0,01 ; 3 h : 56,57 ± 3,54 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h : 49,48 ± 7,74 ng/mL, P < 0,05 ; jour 1 : 41,09 ± 4,82 ng/mL, P < 0,05 ; jour 2 : 47,96 ± 8,33 ng/mL, P < 0,05 ; jour 5 : 45,11 ± 6,95 ng/mL, P < 0,05) comparé aux niveaux dans la souris traitée au SP (1 h : 35,96 ± 4,72 ng/mL, 3 h : 34,94 ± 2,58 ng/mL, 12 h : 36,42 ± 5,25 ng/mL, jour 1 : 34,47 ± 3,67 ng/mL, jour 2 : 39,84 ± 3,71 ng/mL, jour 5 : 36,82 ± 8,27 ng/mL). Comme montré dans la Fig. 8b-d, la comparaison avec le groupe induit par le venin de D. acutus a montré que l'exposition de 1, 3 et 12 h aux EPC-PQC à forte dose (50,09 ± 7,68 ng/mL, P < 0,05 [1 h] ; 40,36 ± 8,51 ng/mL, P < 0,01 [3 h] ; 39,87 ± 4,64 ng/mL, P < 0,05 [12 h], respectivement) et faible dose (46,64 ± 3,83 ng/mL, P < 0,01 [1 h] ; 37,65 ± 9,61 ng/mL, P < 0,01 [3 h] ; 38,75 ± 6,64 ng/mL, P < 0,05 [12 h], respectivement) diminuaient significativement les niveaux d'IL-1β. De plus, les EPC-PQC à dose moyenne réduisaient significativement le niveau d'IL-1β (41,50 ± 11,08 ng/mL, P < 0,01) comparé à celui des souris traitées au venin à 3 h mais pas aux autres points temporels.

Les niveaux de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 augmentaient dramatiquement dans le groupe traité au venin de D. acutus à différents points temporels (23,27 ± 0,72 ng/mL, P < 0,01 ; 22,03 ± 0,96 ng/mL, P < 0,05 ; 21,76 ± 1,99 ng/mL, P < 0,05 ; 26,31 ± 6,55 ng/mL, P < 0,01 ; 3 h, 12 h, jour 1 et jour 2, respectivement) comparé au groupe traité au SP (Fig. 9). En contraste net, le traitement avec les EPC-PQC à forte et moyenne dose (17,17 ± 4,04 et 17,25 ± 5,64 ng/mL, respectivement, tous deux P < 0,05) inhibait la sécrétion d'IL-10 induite par le venin à 3 h tandis que les EPC-PQC à faible dose inhibaient les niveaux à 3 h, 12 h et jour 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 et 18,31 ± 2,14 ng/mL, respectivement, tous P < 0,05). Aucune différence significative n'était observée entre les groupes traités par EPC-PQC et le groupe SP.

En outre, la Fig. 10 montre que l'injection de venin de D. acutus augmentait significativement la libération de MCP-1 dans le groupe modèle (1 h : 197,45 ± 22,34 ng/mL, P < 0,01 ; 3 h : 182,42 ± 12,94 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h : 169,20 ± 26,74 ng/mL, P < 0,01 ; 24 h : 142,81 ± 25,85 ng/mL, P < 0,05) comparé au contrôle traité au SP (1 h : 115,82 ± 14,80 ng/mL ; 3 h : 106,46 ± 13,76 ng/mL ; 12 h : 120,35 ± 15,75 ng/mL ; et 24 h : 108,81 ± 25,60 ng/mL). Plus remarquable, le traitement des souris envenimées avec les trois doses d'EPC-PQC inhibait l'augmentation des niveaux de MCP-1. Les EPC-PQC à dose moyenne (3 h : 136,84 ± 39,94 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h : 127,48 ± 13,75 ng/mL, P < 0,01) et faible dose (1 h : 152,13 ± 18,89 ng/mL, P < 0,05 ; 3 h : 129,54 ± 30,85 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h : 118,75 ± 19,96 ng/mL, P < 0,01) inhibaient l'augmentation des niveaux de MCP-1 à 1, 3 et 12 h, sauf pour la dose moyenne à 1 h (178,20 ± 22,79 ng/mL). Le traitement avec les EPC-PQC à forte dose diminuait efficacement le niveau de MCP-1 seulement à 3 h (131,42 ± 24,62 ng/mL, P < 0,01).

En revanche, les niveaux d'IL-1β, IL-10 et MCP-1 des groupes traités par EPC-PQC à certains points temporels n'étaient pas significativement différents de ceux du groupe modèle, et montraient une tendance à la diminution.

Effet des EPC-PQC sur l'inhibition de la thrombopénie

Les PLT ont un rôle spécifique dans la pathogenèse de l'IRA ; par conséquent, le nombre de PLT a été investigué et les résultats sont montrés dans la Fig. 11 [26]. Comparé aux valeurs de PLT du groupe contrôle (1 h : [1228 ± 51] × 10⁹ ; 3 h : [1120 ± 36] × 10⁹ ; 12 h : [1245 ± 111] × 10⁹ ; jour 1 : [1177 ± 69] × 10⁹ ; jour 2 : [1195 ± 51] × 10⁹ ; et jour 5 : [1181 ± 46] × 10⁹), une réduction drastique survenait dès 1 h après l'administration de venin de D. acutus, avec un nadir se produisant à 3 h. Par la suite, les PLT augmentaient régulièrement jusqu'au jour 5 (1 h : [354 ± 70] × 10⁹, P < 0,01 ; 3 h : [315 ± 77] × 10⁹, P < 0,01 ; 12 h : [435 ± 91] × 10⁹, P < 0,01 ; jour 1 : [663 ± 226] × 10⁹, P < 0,01 ; jour 2 : [941 ± 248] × 10⁹, P < 0,05 ; jour 5 : [1083 ± 89] × 10⁹). Notamment, même à cet intervalle de temps, les valeurs de PLT étaient significativement plus basses que celles des souris témoins. En outre, l'administration d'EPC-PQC à une dose de 8 mg/kg inhibait markedly la thrombopénie induite par le venin à 1 h ([435 ± 91] × 10⁹, P < 0,05), 3 h ([599 ± 290] × 10⁹, P < 0,05), 12 h ([929 ± 92] × 10⁹, P < 0,01), jour 1 ([1028 ± 248] × 10⁹, P < 0,01) et jour 2 ([1183 ± 89] × 10⁹, P < 0,01). Cet effet inhibiteur était également observé à une dose de 2 mg/kg d'EPC-PQC à 3 h et jour 2 et 4 mg/kg d'EPC-PQC au jour 2, en plus de l'augmentation des PLT. Bien qu'il n'y ait pas de différence significative entre les groupes modèle et dose moyenne, une tendance à l'augmentation était observée aux autres points temporels différents.

Observations histopathologiques

La lésion rénale dans le groupe venin a été évaluée histologiquement. Comme montré dans la Fig. 12a, en contraste avec le groupe traité au SP, qui montrait des glomérules et une cellularité tubulaire normales, des changements marqués étaient observés dans le parenchyme rénal du groupe traité au venin de D. acutus. Ces changements incluent une hémorragie marquée, une dilatation des tubules rénaux et une dégénérescence. La co-administration d'EPC-PQC prévenait les dommages rénaux induits par le venin de D. acutus, et l'examen histopathologique de l'architecture des tissus rénaux était presque normal avec une hémostase légère, une dilatation des tubules rénaux et une dégénérescence.

Discussion

En tant que nanomatériau émergent, les PQC commencent à occuper une niche importante en tant que matériaux innovants pour les nanomédecines de prochaine génération. Comparés aux points quantiques traditionnels à base de métaux lourds, les PQC sont de bons candidats pour l'application biomédicale en raison de leurs caractéristiques uniques qui ont des avantages potentiels considérables dans le développement de nouveaux médicaments avec une toxicité relativement faible [27, 28].

Les particules d'EPC-PQC dérivées étaient quasi-sphériques et bien dispersées dans l'eau, avec des groupes fonctionnels abondants présents sur la surface. Cette observation est cohérente avec les résultats précédemment rapportés [23]. De plus, les PQC préparés montraient une faible toxicité contre les cellules L02 et 237 T, ce qui indiquait leur adéquation pour les applications biomédicales.

L'étude actuelle est la première, à notre connaissance, à démontrer les bioactivités remarquables des EPC-PQC sur l'IRA induite par la morsure de serpent D. acutus. D. acutus est largement appelé « cinq pas » ou « cent pas » dans la médecine populaire chinoise en raison de la description folklorique que les personnes ou animaux mordus par D. acutus ne pouvaient pas marcher plus de 100 pas. Plus de 90% de la population de D. acutus se trouve en Chine, et la fréquence des conditions critiques et même de la mort liées à la morsure de ce serpent est plus élevée que celle de nombreux autres serpents venimeux [29]. L'IRA est l'effet systémique le plus grave et la complication courante, qui mène à l'ischémie rénale secondaire et à l'insuffisance. Une connaissance accrue des informations pertinentes sur l'IRA induite par l'envenimation de D. acutus contribuerait au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Cependant, en contraste avec les connaissances considérables disponibles sur la néphrotoxicité du venin de serpent en général [30, 31], l'information sur l'IRA induite par le venin de D. acutus est rare, ce qui nous a menés à investiguer ce médicament potentiel qui est encore aux premiers stades de développement.

Dans cette étude, nous avons établi un modèle d'IRA en injectant intrapéritonéalement le venin de D. acutus dans des souris pour évaluer la pathogenèse complexe et multifactorielle de l'IRA induite par le venin. De plus, le modèle a fourni un outil pour investiguer les effets protecteurs des EPC-PQC contre l'IRA induite par le venin de D. acutus.

Les expériences actuelles ont montré le développement d'une IRA substantielle avec des changements distincts dans les cytokines inflammatoires et les index biochimiques sériques et urinaires, ainsi que des preuves histopathologiques de lésion rénale après injection intrapéritonéale de venin de serpent [31]. Ces résultats indiquaient les facteurs possibles qui peuvent principalement contribuer à la toxicité du venin sont [32] (1) cytotoxicité directe du venin contre le rein et (2) réactions inflammatoires rénales.

Plus spécifiquement, l'insuffisance rénale a été confirmée environ 24 h après l'injection de venin basée sur l'oligurie associée à la protéinurie et aux biomarqueurs sériques élevés (CRS et US). Nous avons affirmé davantage l'implication rénale dans le groupe traité au venin de D. acutus en utilisant l'analyse biochimique, qui a montré des niveaux d'PUT et MALB significativement élevés comparés à ceux du groupe contrôle. Ces résultats indiquaient la présence de dysfonctionnement glomérulaire et de réabsorption tubulaire dans le groupe traité au venin [33], ce qui était soutenu par des preuves de changement histopathologique. En contraste, une réduction significative des niveaux d'PUT et MALB était observée dans le groupe traité par EPC-PQC à dose moyenne envenimé. De plus, les indicateurs biochimiques sériques (CRS et US) sont d'autres paramètres vitaux utilisés pour déterminer l'élévation de la dysfonction rénale dans l'IRA et ils restent des indicateurs cliniques dans son diagnostic [34]. L'injection de venin de serpent du jour 1 au 5 augmentait également dramatiquement les niveaux de CRS et US, tandis que le traitement par EPC-PQC inversait ces effets, résultant en une récupération plus rapide que celle du groupe contrôle. Plus important encore, les changements distincts dans le tissu rénal, hémorragie marquée, dilatation des tubules rénaux et dégénérescence indiquaient davantage l'altération directe du rein par le venin. Les effets d'atténuation des EPC-PQC sur les changements histopathologiques ont été démontrés dans cette étude. Ces résultats suggéraient que les EPC-PQC inhibaient la manifestation anormale induite par l'IRA des marqueurs biochimiques urinaires et sériques associés à la dysfonction rénale ainsi que les dommages histologiques rénaux. De plus, ces effets peuvent être attribuables à l'amélioration de la néphrotoxicité directe du venin de D. acutus par les EPC-PQC [35]. Les effets protecteurs des EPC-PQC étaient evidencés par l'inhibition du dommage rénal direct induit par le venin de D. acutus.

Une réponse inflammatoire intense est une caractéristique commune induite par l'envenimation par des animaux venimeux tels que les serpents et les chenilles [35,36,37]. Les signes d'inflammation systémique avec infiltration de cellules mononucléaires, leucocytose neutrophile, dégénérescence des cellules épithéliales tubulaires et nécrose ont également été montrés dans l'altération rénale induite par l'injection de venin de serpent. Le MCP-1 est une petite protéine moléculaire qui joue un rôle vital dans le recrutement et l'activation des leucocytes pendant les réponses inflammatoires [38]. De plus, les phagocytes mononucléaires et les lymphocytes peuvent contribuer à la lésion rénale aiguë par différents mécanismes tels que la sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires, qui peuvent alors induire les cellules rénales résidentes à exprimer des chimiokines [39]. L'implication du MCP-1, des cytokines inflammatoires (IL-1β) et de la cytokine anti-inflammatoire (IL-10) dans la réponse inflammatoire dans la pathogenèse de l'IRA chez les souris injectées avec le venin de D. acutus seulement a été démontrée dans la présente étude. Cette observation indiquait que le mécanisme sous-jacent de l'IRA induite par le venin de D. acutus peut être associé à la réponse inflammatoire rénale. L'évidence que l'exposition aux EPC-PQC réduisait significativement les niveaux d'IL-1β, IL-10 et MCP-1 suggère que les PQC peuvent exhiber une néphroprotection en inhibant les réactions inflammatoires rénales.

De plus, les PLT jouent un rôle crucial dans les processus hémostatiques et inflammatoires aigus et sont associés à diverses pathologies inflammatoires [40, 41]. Elles sont hautement sensibles et répondent rapidement aux changements biologiques lorsqu'un organisme est blessé ou saigne, en tant que premières cellules à arriver sur le site de lésion aiguë pour interagir avec les cellules endothéliales et les leucocytes [42]. Les PLT sont impliquées dans la pathogenèse de l'IRA [43], et sont considérées comme un marqueur pronostique significativement associé à un résultat pire de l'IRA [44]. Cette étude a fourni la preuve que le venin de D. acutus diminuait conspicuement le nombre de PLT, ce qui était cohérent avec les résultats d'études rapportant que la thrombopénie peut être induite par le venin de serpent [34, 45]. Nous avons observé que l'exposition aux EPC-PQC augmentait significativement les comptes de PLT, ce qui était cohérent avec les résultats d'une étude précédente [23].

Les anomalies de l'IRA induite par le venin de D. acutus étaient, à notre connaissance, démontrées pour la première fois dans l'étude actuelle et incluaient principalement la dysfonction rénale associée à la protéinurie, l'oligurie, les niveaux élevés d'US et CRS, les dommages pathologiques du rein, les réponses inflammatoires et la thrombopénie.

Remarquablement, les EPC-PQC ont démontré une activité protectrice contre l'IRA induite par le venin de D. acutus en inhibant les altérations associées, comme evidencé dans cette étude pour la première fois. Cette étude était une évaluation préliminaire des effets bénéfiques des EPC-PQC sur l'IRA induite par le venin de D. acutus, et des investigations plus approfondies du mécanisme sous-jacent seraient l'objectif d'études futures.

Conclusion

Les effets protecteurs impressionnants des EPC-PQC sur l'IRA induite par le venin de D. acutus ont été démontrés dans cette étude, pour la première fois, à notre connaissance. Les effets liés à l'IRA se manifestaient principalement comme dysfonction rénale, dommages pathologiques du rein, réponses inflammatoires et thrombopénie. Ces résultats indiquaient que les EPC-PQC ont des perspectives d'application potentielles pour être utilisées comme médecine complémentaire pour le traitement des anomalies induites par l'IRA induite par le venin de D. acutus. De plus, cela fournit une nouvelle stratégie pour l'étude des ingrédients actifs des formulations de médecine traditionnelle chinoise, et élargit davantage les applications biomédicales des PQC.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

IRA :

Insuffisance rénale aiguë

US :

Urée sanguine

PQC :

Points quantiques de carbone

D. acutus :

Deinagkistrodon acutus

HE :

Hématoxyline et éosine

IL :

Interleukine

MALB :

Microalbuminurie

MCP-1 :

Protéine chimiotactique des monocytes 1

EPC :

Écorce de Phellodendron chinensis

EPC-PQC :

Points quantiques de carbone d'écorce de Phellodendron chinensis carbonisée

PLT :

Nombre de plaquettes

CRS :

Créatinine sérique

PUT :

Protéines urinaires totales