Amélioration de la thérapie HIFU du cancer par des microbulles sonodynamiques N₂O

Résumé

Les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) sont une méthode non invasive représentative de thérapie du cancer, mais leur faible efficacité thérapeutique et le risque de dommages aux tissus sains environnants freinent leur développement clinique. La thérapie sonodynamique (SDT) tue les cellules tumorales via les espèces réactives de l'oxygène (ROS) produites par les sonosensibilisateurs sous ultrasons. La SDT peut améliorer l'efficacité du HIFU, comme les microbulles. Dans ce travail, nous avons développé des microbulles N₂O à l'échelle nanométrique (N₂O-mbs) par une méthode d'oscillation mécanique améliorée. Ces microbulles montrent une bonne biocompatibilité et une liaison aux cellules tumorales. La sonosensibilité des N₂O-mbs a été détectée extra- et intracellulairement par détection de génération de ROS. Les effets toxiques de ces microbulles sonodynamiques sur les cellules tumorales et leur effet synergique sur le traitement HIFU ont été évalués. Une apoptose significative est causée par les ROS produites par les N₂O-mbs sous irradiation ultrasonore. Les N₂O-mbs combinées au HIFU augmentent la nécrose et l'apoptose des cellules tumorales in vitro et le volume nécrotique coagulatif et l'intensité d'écho dans la zone cible du foie bovin ex vivo. Ces microbulles sonodynamiques inhibent aussi efficacement la croissance tumorale in vivo. Les N₂O-mbs ont un impact significatif sur le traitement et l'effet d'ablation du HIFU grâce aux avantages des microbulles et à leur sonosensibilité extraordinaire. Cette découverte suggère que les N₂O-mbs pourraient être un nouvel agent auxiliaire pour les ultrasons, utilisable pour promouvoir l'ablation thermique tumorale par HIFU.

Introduction

Les tumeurs malignes sont l'une des maladies majeures menaçant la vie et la santé humaines [1]. Le HIFU est une nouvelle technique d'ablation locale non invasive des tumeurs. Il a été utilisé avec succès pour traiter tumeurs solides bénignes et malignes du foie, rein, pancréas, prostate, sein, os et utérus [2, 3]. Cependant, les limitations inhérentes du HIFU, telles que la décroissance de l'énergie ultrasonore pendant le traitement, l'affaiblissement de l'accumulation d'énergie dans la zone cible et les dommages aux tissus sains non ciblés, réduisent son effet thérapeutique [4, 5]. Le champ focal formé par l'irradiation HIFU est petit (ordres de millimètre). L'ablation de grosses tumeurs prend beaucoup de temps. L'allongement du temps d'irradiation HIFU augmente la température corporelle, pouvant atteindre 39,2 °C. Plus la tumeur est profonde, plus l'énergie d'ablation HIFU doit augmenter [6]. Cela augmente le risque de dommages physiques au patient et réduit l'efficacité et la sécurité du traitement HIFU. Par conséquent, les chercheurs s'efforcent de trouver des moyens d'augmenter l'efficacité thérapeutique du HIFU ces dernières années [7-9]. Les microbulles peuvent améliorer synergiquement l'efficacité thérapeutique du HIFU [7, 10]. Le gaz dans la microbulle appartient aux matériaux à haute impédance acoustique. Les microbulles augmentent la diffusion et la réflexion de l'onde ultrasonore dans la zone cible lors de l'irradiation HIFU du tissu tumoral [11, 12]. Elles augmentent la température de la zone cible tumorale et renforcent l'effet thermique du HIFU en augmentant l'accumulation d'énergie HIFU dans la zone cible [13]. De plus, les microbulles comme noyaux de cavitation exogènes abaissent le seuil de cavitation tissulaire et renforcent l'effet de cavitation du HIFU en passant par la circulation sanguine dans le tissu tumoral [14]. Ces dernières années, des études indiquent que la thérapie sonodynamique (SDT) peut améliorer synergiquement l'efficacité du HIFU [15, 16]. Les interactions entre sonosensibilisateurs et ultrasons produisent des espèces réactives de l'oxygène (ROS), dont l'oxygène singulet et les radicaux hydroxyles, qui tuent les cellules tumorales et inhibent la croissance tumorale par apoptose et nécrose [17]. La SDT a fait de grands progrès dans le traitement non invasif des tumeurs. Elle permet de réduire la dose de médicament et la puissance d'irradiation HIFU par rapport aux monothérapies conventionnelles. Pour exploiter pleinement les avantages des deux, cette étude combine microbulles et effet sonodynamique pour améliorer davantage l'efficacité du HIFU. Les sonosensibilisateurs sont une partie importante de la SDT [18, 19]. La plupart des sonosensibilisateurs traditionnels étudiés dérivent de photosensibilisateurs. Le N₂O est un photosensibilisateur [20, 21], produisant des substances toxiques sous irradiation UV. Dans cette étude, la sonosensibilité du N₂O a été explorée initialement. Nous avons précédemment trouvé que l'application d'anesthésie par inhalation de N₂O lors d'opérations HIFU aggravait le degré de lésion tissulaire, incluant l'augmentation de l'épaisseur de la congestion abdominale et cutanée [22]. L'utilisation combinée de N₂O et HIFU jouait un effet synergique sur la lésion tissulaire. Mais l'effet biologique du N₂O dans le traitement HIFU reste flou. Le N₂O est un gaz moléculaire petit relativement stable, sans biotransformation ni spécificité tissulaire dans les cellules. Il peut être largement utilisé dans les tissus et n'a pas d'effet toxique sur l'organisme [23, 24]. C'est donc une perspective attrayante comme sonosensibilisateur. Dans cette étude, des microbulles à l'échelle nanométrique (N₂O-mbs) ont été préparées en enveloppant N₂O et C₃F₈ dans des lipides. La dose de N₂O a été réduite et son champ d'action in vivo efficacement limité à la zone tumorale. L'effet sonodynamique du N₂O et son effet synergique sur l'efficacité du HIFU ont été examinés.

Matériels et méthodes

Matériaux

1,2-Dihexadécanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine (DPPC) et 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-mPEG2000) achetés chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Glycérine et agarose de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). N₂O et C₃F₈ de Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (Chine). 4′,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI), 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), 2′,7′-dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA), 3-amino,4-aminométhyl-2′,7′-difluorescéine, diacétate (DAF-FM DA) et CCK-8 de Beyotime Biotechnology (Chongqing, Chine). Calcein-AM (CAM) et iodure de propidium (PI) de Santa Cruz Biotechnology (TX, USA). Annexin V-FITC/PI de Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, Chine). Singlet oxygen sensor green (SOSG) d'Invitrogen (NY, USA).

Préparation des N₂O-mbs et C₃F₈-mbs

N₂O-mbs préparées par méthode de film rotatif combinée à oscillation mécanique. DPPC et DSPE-PEG2000 comme matériaux de coque, N₂O comme cœur. Brièvement : 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000, 10 mL chloroforme versés dans ballon à fond rond, mélangés et dissous par ultrasons. Formation films lipidiques par évaporateur rotatif (60 min, 55 °C, 100 tr/min). Ajout 2 mL glycérol 10% pour hydrater films lipidiques et préparer suspension. 500 μL ajoutés dans tube à capsule. Tube bouché avec bouchon caoutchouc. Air dans tube remplacé par N₂O et C₃F₈ par dispositif de déplacement gazeux. Suspension oscillée mécaniquement par mélangeur capsule argent-mercure (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., Chine) 150 s. Suspension résultante soumise à centrifugation différentielle pour obtenir N₂O-mbs cibles : centrifugation 300 tr/min 5 min, puis 800 tr/min 5 min. N₂O-mbs resuspendues dans PBS, stockées 4 °C.

C₃F₈-mbs fabriquées par même méthode oscillation mécanique [25]. N₂O-mbs marquées DiI préparées en ajoutant DiI lors formation film. Noter que N₂O a faible poids moléculaire et est instable. Le N₂O dans la microbulle s'échappe facilement, réduisant la demi-vie. C₃F₈ est un gaz inerte macromoléculaire largement utilisé dans les agents de contraste ultrasonores par microbulles. C₃F₈ augmente la stabilité des microbulles. Donc, dans cette étude, N₂O et C₃F₈ (2:1) mélangés comme cœur des N₂O-mbs pour augmenter leur stabilité.

Fabrication et détection performance N₂O-mbs

Morphologie et distribution taille N₂O-mbs observées au microscope optique en champ clair. Concentrations N₂O-mbs et C₃F₈-mbs calculées par globulimètre selon directives. Taille moyenne et potentiel zêta N₂O-mbs déterminés par diffusion laser dynamique (Malvern Instruments, Malvern, UK). Structure et morphologie N₂O-mbs caractérisées par MET (Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japon). N₂O-mbs préparées stockées 4 °C. Pour observer stabilité, morphologie et concentration enregistrées jours 1, 2, 3. Taille moyenne et potentiel zêta déterminés en parallèle.

Culture cellulaire et modèle animal

Cellules cancéreuses mammaires humaines (MDA-MB-231 ; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, Chine) passagées au labo <3 mois après résuscitation. Milieu DMEM 10% sérum fœtal bovin, 50 μg/L streptomycine, 50 μg/L pénicilline, 37 °C, 5% CO₂. À 80% confluence, utilisées pour expériences.

Expériences animales selon directives Comité d'éthique animal Université médicale Chongqing. Souris nues femelles (4-6 semaines, 15-20 g) du Centre Expérimentation Animale Université médicale Chongqing. Pour tumeur solide : cellules MDA-MB-231 (1×10⁶ cellules/mL) en saline normale (100 μL) injectées sous-cutanéement dans flanc droit de chaque souris. Souris porteuses tumeur utilisées pour expériences thérapeutiques quand volume tumeur ~150 mm³.

Internalisation cellulaire et évaluation biocompatibilité N₂O-mb

Cellules MDA-MB-231 phase croissance ensemencées densité ~1×10⁵ cellules/flacon microscopie laser confocal (CLSM) 24 h. Ajout 100 μL (1×10⁵ bulles/mL) dilution N₂O-mbs marquées DiI dans milieu complet. Flacon scellé par film microplaques, stocké inversé en incubateur, maintenant N₂O-mbs en contact cellules. Après 2 h et 4 h co-incubation, lavage doux 3× PBS, fixation PFA 4% 20 min, coloration DAPI 20 min. Comportement ciblage cellules par N₂O-mbs observé par CLSM (Nikon A1, Japon).

Cytotoxicité N₂O-mbs évaluée par test CCK-8 standard. Cellules MDA-MB-231 ensemencées plaque 96 puits (5×10⁴ cellules/puits) 24 h. Ajout 100 μL différentes concentrations (1×10⁴/mL, 1×10⁵/mL, 1×10⁶/mL) N₂O-mb. Incubation 24 h, ajout solution CCK-8 (10 μL/puits). Culture 37 °C 2 h. Absorbance mesurée 450 nm lecteur microplaques Bio-Tek (Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA).

Dix souris nues femelles saines ~20 g divisées aléatoirement deux groupes (n=5). Groupe N₂O-mbs : injection IV N₂O-mbs (200 μL, 1×10⁵/mL). Groupe contrôle : saline (200 μL). Après 21 jours, organes majeurs (cœur, foie, rate, poumon, rein) prélevés, coloration hématoxyline-éosine (H&E).

Efficacité SDT in vitro des N₂O-mbs

Détection radicaux oxygène basée sur rapport antérieur [26]. 10 μL SOSG (500 μM) mélangés avec 2 mL solution échantillon. Groupes : C (témoin) : PBS seul ; N₂O-mbs : 100 μL N₂O-mbs (1×10⁵/mL) dans 2 mL PBS ; C₃F₈-mbs : 100 μL C₃F₈-mbs (1×10⁵/mL) dans 2 mL PBS ; LIFU : PBS irradié ultrasons (2 W/cm² ; Institut Imagerie Ultrasons Chongqing Medical Sciences, Chongqing, Chine) 100 s ; LIFU-N₂O-mbs : PBS + N₂O-mbs irradié ultrasons ; LIFU-C₃F₈-mbs : PBS + C₃F₈-mbs irradié ultrasons. Paramètres traitement : 2 W/cm², 100 s (analyse résultats et littérature [27, 28]). Paramètres ultrasons : fréquence 650 kHz ; distance focale 12,5 mm ; mode onde pulsée, cycle 50% ; durée impulsion 1 s. Génération oxygène singulet (¹O₂) par spectrométrie fluorescence (Cary Eclipse, Agilent Technologies) mesure intensité fluorescence (λ excitation/émission = 504/525 nm). Intensité et durée ultrasons cohérentes avec expériences cellulaires in vitro.

Après détection ROS extracellulaires par SOSG, production ROS intracellulaires par kit DCFH-DA. Cellules MDA-MB-231 ensemencées ~1×10⁵/flacon CLSM. Six groupes aléatoires : contrôle (sans traitement), N₂O-mbs seul (100 μL, 1×10⁵ bulles/mL), C₃F₈-mbs seul, LIFU seul (2 W/cm² 100 s), LIFU-C₃F₈-mbs, LIFU-N₂O-mbs. Après incubation 24 h adhésion, interventions expérimentales. Ajout même quantité DCFH-DA (30 μM) chaque flacon, incubation 20 min obscurité. Lavage doux 3× PBS pour sonde DCFH non internalisée. Génération ROS intracellulaires déterminée par CLSM. Pour vérifier efficacité SDT N₂O-mbs, cellules ensemencées plaques 6 puits, 24 h, six groupes comme ci-dessus. Traitements correspondants. Cellules digérées, suspensions préparées concentrations appropriées, flacon CLSM. Coloration CAM/PI : cellules mortes (rouge), vivantes (vert). Apoptose par cytométrie flux et coloration Annexin V-FITC/PI. Après 1 h traitement, centrifugation, collecte cellules. Coloration Annexin V-FITC/PI, cytométrie flux (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Effet sonodynamique in vitro des N₂O-mbs améliore efficacité traitement HIFU sur cellules cancéreuses

Système HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, Chine) : unité ultrasons diagnostique, unité ultrasons thérapeutique, système traitement central [29]. Paramètres HIFU : fréquence travail 0,94 MHz ; distance focale 140 mm ; diamètre 220 mm ; transducteur diagnostique temps réel 3,5 MHz. Transducteurs intégrés immergés eau dégazée. Pour évaluer effet renforcement N₂O-mbs sur HIFU, cellules MDA-MB-231 centrifugées 5×10⁵/mL, quatre groupes : contrôle (sans traitement), HIFU seul (125 W, 5 s), HIFU-N₂O-mbs seul, HIFU-C₃F₈-mbs seul. Traitements respectifs. Cellules traitées centrifugées, lavées PBS, double coloration Annexin V-FITC/PI, cytométrie flux. Sonde NO DAF-FM pour détecter NO surnageant chaque groupe. Expériences répétées 3 fois. MET pour morphologie ultrastructurale cellules traitées. Après chaque traitement, fixation immédiate 2% OsO₄, déshydratation alcool gradué, inclusion plate Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Coupes ultraminces (100 nm), coloration acétate d'uranyle/citrate de plomb, observation microscope électronique.

Effet sonodynamique ex vivo et in vivo des N₂O-mbs améliore efficacité ablation HIFU

Foie bovin frais acheté abattoir local, utilisé <12 h post-abattage. Foie ex vivo frais, peu tissu conjonctif, peu vaisseaux, découpé 10×5×5 cm, dégazé 1 h à 37 °C. Foies divisés trois groupes : C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, PBS. Foie placé conteneur eau déaérée. Injection directe 200 μL (1×10⁵ bulles/mL) microbulles dans foie selon Figure 6a. Guidage transducteur diagnostique ultrasons, point focal HIFU positionné site injection. Transducteur thérapeutique : ablation 5 s puissances différentes (100 W, 125 W, 150 W) sur site injection foie. Volume nécrotique coagulatif zone cible calculé selon longueur, largeur, profondeur max (mm) mesurées : V (mm³) = π/6 × longueur × largeur × profondeur. De plus, valeur niveau gris zone cible avant/après ablation HIFU chaque groupe enregistrée sur images ultrasons diagnostiques.

Vingt souris porteuses tumeur divisées aléatoirement quatre groupes (n=5) : contrôle (sans traitement), HIFU-PBS, HIFU-C₃F₈-mbs, HIFU-N₂O-mbs. HIFU (125 W, 5 s) ablation tumeur après injection IV 200 μL C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, PBS. Procédure ablation tumeurs solides similaire foie bovin ex vivo. Anesthésie souris pentobarbital 1% (8 mL/kg). Site tumeur souris mis dans conteneur eau déaérée. Guidage transducteur diagnostique, point focal HIFU positionné tissu tumoral. Poids corporel et volume tumeur enregistrés intervalle 3 jours. À 21 jours post-traitement, toutes souris euthanasiées, tissus tumoraux prélevés, coloration H&E, PCNA (antigène nucléaire proliférant), TUNEL.

Analyse statistique

Données présentées et analysées GraphPad Prism (version 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Données : moyenne ± EC. Chaque expérience répétée ≥3 fois. Analyses : ANOVA à un facteur avec test post-hoc Bonferroni (comparaison tous groupes) ou Dunnett (comparaison tous groupes vs contrôle). p < 0,05 significatif.

Résultats

Caractérisation N₂O-mbs

Préparation N₂O-mbs par oscillation mécanique modifiée → suspension laiteuse blanche hautement stable (Figure 1a). N₂O-mbs ne changent pas significativement taille et morphologie après 72 h stockage température ambiante. Microscope optique : taille uniforme, bonne dispersion, haute stabilité (Figure 1b). Concentration N₂O-mbs : 5,12 ± 0,45 × 10⁸ bulles/mL. Images MET (Figure 1c) : taille uniformément distribuée, taille moyenne ~450 nm. Diffusion lumière dynamique : diamètres hydrodynamiques 458,1 ± 17,26 nm (indice polydispersité = 0,368 ; Figure 1d), cohérent MET. Potentiel N₂O-mbs : -16,2 ± 0,35 mV (Figure 1e) (Fichier supplémentaire 1: Figure S1).

Internalisation cellulaire et biocompatibilité N₂O-mbs

Cytotoxicité in vitro par CCK-8. Viabilité groupe contrôle = 100%. Après 24 h incubation, aucune cytotoxicité significative sur MDA-MB-231. Même à hautes concentrations N₂O-mb, viabilité >95% (Figure 2a). Cytotoxicité in vivo sur souris nues saines : Figure 2b, analyse histopathologique organes majeurs (cœur, foie, rate, poumon, rein) montre absence dommage toxique significatif. N₂O-mbs haute biocompatibilité.

Internalisation cellulaire N₂O-mbs temps incubation prolongés (2 h, 4 h) visualisée CLSM. Incubation cellules avec N₂O-mbs DiI → accumulation grand nombre N₂O-mbs membrane et cytoplasme cellules cancéreuses. Figure 2c : bonne colocalisation fluorescence rouge N₂O-mbs avec fluorescence bleue cellules. N₂O-mbs internalisées efficacement dans cellules MDA-MB-231.

Effet sonodynamique N₂O-mbs in vitro

SOSG sonde détection oxygène singulet courante, haute sensibilité/fiabilité pour génération radicaux libres oxygène. Explorer potentiel N₂O-mbs comme sonosensibilisateur : SOSG détecte ROS in vitro [30, 31]. SOSG + ¹O₂ → SOSG-EP, augmentation intensité fluorescence. Figure 3a : après irradiation ultrasonore solution SOSG contenant N₂O-mbs, intensité fluorescence augmente significativement ; vs autres groupes, production radicaux libres oxygène significativement augmentée (p < 0,01).

Détection ROS intracellulaires par kit DCFH-DA. Figure 3b : groupe contrôle positif fluorescence la plus forte. Fluorescence verte suivante apparue seulement groupe LIFU-N₂O-mbs, révélant production ROS conséquente en présence simultanée N₂O-mbs et irradiation LIFU. Autres groupes : fluorescence non évidente (Figure 3c). Viabilité groupe contrôle = 100%. CCK-8 : ~46% mort cellulaire groupe LIFU-N₂O-mbs (Figure 3d). Cytotoxicité N₂O-mbs + LIFU évaluée CLSM mort cellulaire post-traitement. CAM : cellules vivantes fluorescence verte. PI : cellules mortes fluorescence rouge. Figure 4a : nombreuses cellules mortes groupe LIFU-N₂O-mbs. Cytométrie flux : taux apoptose groupe MDA-MB-231 significativement plus élevé autres groupes (p < 0,05) après traitement combiné N₂O-mbs + LIFU (Figure 4b). Traitement combiné C₃F₈-mbs + LIFU ne cause pas mort/apoptose évidente. Résultats indiquent apoptose et nécrose étendues par SDT. Cytométrie flux cohérente CLSM. N₂O-mbs + LIFU induisent apoptose cellules tumorales in vitro (Fichiers supplémentaires 2, 3: Figures S2, S3).

Évaluation effet synergique HIFU in vitro sur cellules cancéreuses

Cytométrie flux Figure 5a. N₂O-mbs et C₃F₈-mbs augmentent mortalité MDA-MB-231 après ablation HIFU. De plus, vs HIFU-C₃F₈-mbs, N₂O-mbs augmentent significativement apoptose MDA-MB-231 (p < 0,05 ; Figure 5b). Test NO : intensité fluorescence surnageant groupe HIFU-N₂O-mbs significativement plus élevée autres groupes (p < 0,05) (Figure 5c). Changements cytoplasme/organelles observés MET (Figure 5d). Cellule contrôle : morphologie complète. Groupe HIFU : grandes quantités substances vacuolaires cytoplasme, mais membranes cellulaire et nucléaire intactes. Groupes HIFU-N₂O-mbs et HIFU-C₃F₈-mbs : perte intégrité membrane cellulaire, désintégration complète structure cellulaire. Noter observations MET = instantané processus mort/apoptose post-traitement chaque groupe. N₂O-mbs comme microbulles exogènes ont effet synergique évident sur traitement HIFU. Dans groupe HIFU-N₂O-mbs, effet sonodynamique N₂O-mbs pourrait promouvoir plus d'apoptose. Résultats validés cytométrie flux et expérience in vivo (Fichiers supplémentaires 4, 5: Figures S4, S5).

N₂O-mbs comme synergiste thérapie HIFU

Après ablation HIFU foie bovin isolé, région nécrotique coagulatif gris-blanc apparue zone ciblée (Figure 6b). Changements intensité écho moyenne zone cible avant/après HIFU Figure 6c. Vs groupe PBS, valeurs intensité écho cible groupes C₃F₈-mbs et N₂O-mbs significativement augmentées après HIFU (p < 0,05) et augmentent avec puissance ablation HIFU. Volume nécrotique coagulatif et intensité écho images ultrasons B-mode zone cible augmentent tous deux avec puissance HIFU (Figure 6d, e).

Effet synergique N₂O-mbs sur thérapie HIFU vérifié in vivo. Figure 7a : photos numériques souris et tissus tumoraux correspondants 21 jours post-traitements. Croissance tumeur plus efficacement inhibée après N₂O-mbs + HIFU. Effet synergique évalué par H&E, PCNA, TUNEL (Figure 7b) : N₂O-mbs + HIFU cause nécrose cellules tumorales à plus grande échelle vs HIFU-C₃F₈-mbs. Changements morphologie cellulaires HIFU-N₂O-mbs plus évidents autres groupes : karyopyknose, karyorrhexis, karyolysis, indiquant nécrose substantielle cellules cancéreuses.

De plus, volume tumeur HIFU-N₂O-mbs tendance inhibition plus significative vs HIFU-C₃F₈-mbs sur 21 jours (Figure 7c, d).

Discussion

HIFU, nouvelle méthode oncothérapie, reconnue cliniquement, progrès notables traitement tumeurs solides [32]. Effets thermiques, cavitation, mécaniques, chimiques acoustiques jouent rôles significatifs mort cellules tumorales et dommages irréversibles tissu cible ablation HIFU [33]. HIFU impact limité tissus sains environnants, essentiellement non invasif. Cependant, énergie ultrasons atténuée par distance transmission, absorption flux sanguin zone cible, blocage os/gaz corps pendant traitement HIFU, réduisant énergie transférée zone cible. Prolonger temps ablation et augmenter puissance augmente risque dommages tissus normaux (brûlures cutanées, lésions neurovasculaires, complications) [34]. Nécessaire augmenter efficacité HIFU. Nombreuses études confirment microbulles et SDT améliorent efficacité HIFU [15, 16, 35]. N₂O-mbs préparées dans cette étude : taille particule plus petite, caractéristiques similaires agents contraste microbulles ultrasonores. Études montrent nano/microbulles même capacité imagerie in vitro que microbulles, mais capacité supérieure in vivo [36]. Donc N₂O-mbs non seulement guidance/localisation ultrasons pour HIFU, mais aussi microbulles exogènes renforcent efficacité HIFU (Fichier supplémentaire 6: Figure S6). Simultanément, effet sonodynamique N₂O-mbs améliore efficacement efficacité HIFU. Génération ROS après excitation ultrasonore = facteur clé sonosensibilisateurs [16]. Vérifier sonosensibilité N₂O-mbs : production ROS environnements extracellulaire et intracellulaire détectée. Résultats cohérents : N₂O-mbs génèrent ROS solution aqueuse et intracellulairement. Études montrent gaz (N₂, O₂) piégés noyaux cavitation solution peuvent subir réactions clivage produisant radicaux N et O [37, 38] : N₂O → N₂ + O₂ ; O₂ → 2•O ; N₂ → 2N· + HO· → NO + H· ; NO + HO· → HNO. Effet cavitation et avantage empaquetage microbulle réduisent difficulté réaction N₂O [39]. Incubation cellules : N₂O-mbs bonne biocompatibilité. Haute sélectivité, affinité, charge médicament nanoparticules [40], phagocytose active cellules → liaison efficace N₂O-mbs cellules cancéreuses. Nanobulles : pénétration, stabilité, entrée/agrégation autour cellules accrues [36]. De plus, effet sonoporation ultrasons favorise transfert microbulles dans cellules [41].

Vs microbulles contraste traditionnelles C₃F₈-mbs, N₂O-mbs ont effet inhibiteur croissance cellulaire plus grand après irradiation ultrasonore : ROS intracellulaires augmentées, viabilité cellulaire diminuée, apoptose/nécrose. Résultats suggèrent préliminairement effet toxique sonodynamique N₂O-mbs.

Expérience synergie HIFU : paramètres groupe expérimental 125 W, 5 s (analyse résultats et littérature), validant faible puissance HIFU induit ablation suffisante et réduit effets indésirables. Résultats : N₂O-mbs augmentent nécrose et apoptose avancée plus cellules tumorales. N₂O-mbs agissent comme synergiste microbulle nanoscopique et leur effet sonodynamique en réponse HIFU pourrait expliquer résultats différents. Comme microbulle, N₂O-mbs augmentent dépôt énergie HIFU zone cible, augmentent température zone cible, renforcent effet thermique HIFU [11]. Génération effet cavitation liée seuil cavitation et concentration noyaux cavitation [42]. N₂O-mbs = noyaux cavitation réduisant seuil cavitation HIFU, facilitant effet cavitation. Donc N₂O-mbs favorisent efficacement nécrose cellulaire. Comme synergiste microbulle nanoscopique, N₂O-mbs lysées génèrent radicaux libres et oxydes azote en réponse ultrasons. Études confirment ROS facteurs importants induction apoptose [43]. Noter : nombreux radicaux libres endommagent cellules. Outre radicaux oxygène, N₂O génère autres radicaux par clivage, ex. radicaux azote, contribuant mort cellules tumorales. Faible production NO détectée surnageant cellules après HIFU, indiquant réaction clivage N₂O. An et al. [44] : NO fonction anti-tumorale possible, mécanisme : NO attaque enzymes fer suspectées causant échec croissance/division cellules piégées. NO instable interagit O₂ → radicaux hydroxyles (HO·) et NO₂. Radicaux hydroxyles cytotoxiques extrêmes, favorisent apoptose cellules tumorales. NO aussi facteur relaxant dérivé endothélium. Génération NO pourrait expliquer hyperémie et gonflement anormal patients pendant opération HIFU. Expérience foie bovin ex vivo : comparaison attentive intensité écho images ultrasons B-mode, changements pathologiques, volume nécrotique coagulatif zone cible après ablation HIFU avec N₂O-mbs, C₃F₈-mbs, PBS. Tous résultats cohérents. Vs PBS, N₂O-mbs améliorent efficacement effet ablation HIFU. Effet synergique aussi mieux démontré ablation tumeur solide in vivo : apoptose cellules tumorales augmentée, volume tumeur réduit, croissance inhibée. Cette découverte indique N₂O-mbs comme nouvel agent auxiliaire ultrasons pour promouvoir ablation thermique tumorale HIFU. Effet synergique et mécanisme fournissent nouvelles idées et pratique théorique recherche synergistes HIFU. Mais autres mécanismes synergie à explorer. Effet ablation tumeur HIFU + N₂O-mbs à approfondir.

Conclusion

En résumé, nous avons développé des nanoparticules N₂O-mb. Caractérisation et biocompatibilité N₂O-mbs déterminées. Sonosensibilité N₂O-mbs examinée par détection production ROS solution aqueuse et intracellulaire. Vs C₃F₈-mbs, N₂O-mbs génèrent ROS, favorisent apoptose/nécrose cellules tumorales, sonosensibilité extraordinaire. Expériences synergie HIFU : effets sonodynamiques N₂O-mbs augmentent significativement apoptose/nécrose cellules tumorales in vitro, augmentent volume nécrotique coagulatif et intensité écho zone cible foie bovin ex vivo, inhibent efficacement croissance tumorale in vivo. Résultats suggèrent N₂O-mbs nouveau type sonosensibilisateur et nouvel agent auxiliaire thérapie ultrasons pour ablation tumeurs par HIFU.

Disponibilité des données et matériaux

Les conclusions de ce manuscrit sont basées sur les données toutes présentées et montrées dans cet article.

Abréviations

N₂O-mbs :

Microbulles N₂O

C₃F₈-mbs :

Microbulles C₃F₈

HIFU :

Ultrasons focalisés de haute intensité

LIFU :

Ultrasons focalisés de basse intensité

SOSG :

Capteur vert oxygène singulet

SDT :

Thérapie sonodynamique

DPPC :

1,2-dihexadécanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000 :

1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000]

DAPI :

4′,6-diamidino-2-phénylindole

DiI :

1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA :

2′,7′-dichlorofluorescéine diacétate

DAF-FM :

3-amino,4-aminométhyl-2′,7′-difluorescéine, diacétate

CAM :

Calcein-AM

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

CLSM :

Microscopie laser à balayage confocal

TEM :

Microscope électronique à transmission

DMEM :

Milieu modifié Eagle de Dulbecco

FBS :

Sérum fœtal bovin

PBS :

Tampon phosphate salin

DI :

Eau déionisée

ROI :

Régions d'intérêt

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

NO :

Oxyde nitrique