Synthèse de nano-points de carbone jaune-fluorescent par microplasma pour l'imagerie et l'inactivation photocatalytique de cellules cancéreuses

Introduction

Le cancer reste une cause majeure de décès dans le monde [1]. Les nanoparticules multifonctionnelles ayant à la fois des fonctions diagnostiques et thérapeutiques ont des applications prometteuses en nanomédecine. La thérapie simultanée guidée par l'image est un nouveau concept dans le traitement du cancer et est très prometteuse en ce qui concerne l'optimisation de l'efficacité thérapeutique. Il peut fournir des informations utiles concernant la taille et la localisation des tumeurs, la fenêtre temporelle optimale pour la photothérapie et l'efficacité thérapeutique [2,3,4]. La thérapie photodynamique (PDT) a été utilisée pour traiter de nombreux types de cancers et d'autres maladies en raison de sa sélectivité spatio-temporelle et de sa nature non invasive [5, 6]. Les photosensibilisateurs idéaux possèdent généralement les caractéristiques suivantes :(1) génération très efficace d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), (2) bonne biocompatibilité et (3) solubilité dans l'eau [7]. Cependant, les applications actuelles de la PDT sont limitées par la faible solubilité dans l'eau, l'instabilité et les longueurs d'onde d'excitation sous-optimales des photosensibilisateurs. Par conséquent, la génération de substituts de photosensibilisateurs avec une bonne solubilité dans l'eau et une bonne biocompatibilité par des méthodes respectueuses de l'environnement et peu coûteuses est nécessaire.

Les points quantiques de carbone (CQD) ont reçu une attention considérable en raison de leurs propriétés bénéfiques uniques, telles qu'une synthèse simple et respectueuse de l'environnement, une faible toxicité, une biocompatibilité remarquable, une excellente solubilité dans l'eau et une stabilité à la lumière [8]. Les CQD ont des utilisations potentielles dans l'imagerie cellulaire, la biodétection, l'administration ciblée de médicaments et d'autres applications biomédicales [9,10,11,12,13]. Il existe deux approches principales pour la synthèse des points de carbone, les approches ascendantes et descendantes. Les méthodes descendantes comprennent l'oxydation électrochimique, l'ablation au laser, l'oxydation chimique et les méthodes de synthèse par ultrasons. Les méthodes ascendantes consistent en un traitement hydrothermal, une synthèse par micro-ondes et une décomposition thermique [14,15,16,17]. Cependant, la température élevée, la pression élevée et les acides forts requis entraînent toujours une consommation d'énergie substantielle, des processus compliqués et des dommages inévitables à l'environnement. Par conséquent, de nouvelles méthodes de synthèse respectueuses de l'environnement émergent au fur et à mesure que le temps l'exige. Comme cela a été rapporté, les CQD peuvent être produits en quelques minutes à l'aide d'une méthode microplasma-liquide sans condition de température élevée, sans apport d'énergie important et sans procédures laborieuses [18,19,20]. Les microplasmes fournissent un environnement physico-chimique unique aux études fondamentales et aux applications impliquant des matériaux avancés. Les environnements chimiques et électroniques fournis par les microplasmes sont fortement déséquilibrés et peuvent stocker de l'énergie. Dans cet environnement, un grand nombre d'électrons, d'ions, de radicaux libres et d'autres substances actives ionisées excitées peuvent être produits [21, 22]. Bien que o -la phénylènediamine est une matière première pour la synthèse de nano-points de carbone, elle n'a pas été utilisée dans la synthèse de microplasma [23,24,25].

Dans cette étude, o -la phénylènediamine a été utilisée comme matière première pour synthétiser les CQD par traitement au microplasme. Les CQD générés par cette méthode étaient de taille uniforme (environ 3,2 nm de diamètre) et présentaient un pic d'émission à environ 550 nm. Nous avons démontré que les CQD nouvellement synthétisés pouvaient produire une grande quantité de ROS dans des conditions de luminosité. In vitro, les CQD pourraient être absorbés par les cellules tumorales HeLa et émettre de la lumière jaune sous une excitation de longueur d'onde bleue à 420-500 nm avec une faible toxicité. Nous avons également observé l'inactivation des cellules tumorales HeLa sous irradiation à 460 nm. Ces résultats suggèrent que les CQD nouvellement préparés pourraient être des matériaux prometteurs pour la bio-imagerie in vivo, la thérapie anticancéreuse guidée par imagerie ou ciblée.

Résultats et discussion

Caractérisation des CQD

Les CQD à émission jaune dans cette étude sont préparés d'une manière facile et respectueuse de l'environnement par une méthode de microplasma utilisant o -phénylènediamine comme précurseur de carbone. Bien que la méthode de traitement du microplasme ait été signalée comme étant utilisée pour la synthèse de nano-points de carbone, il existe de rares recherches relatives. La figure 1A montre des images au microscope électronique à transmission (MET) des particules CQD. Les particules produites par microplasma étaient cyclo-pointues ou de forme ovale avec un diamètre moyen de 3,2 nm. Comme le montre l'image haute résolution de la Fig. 1A (en médaillon), la distance du réseau dans les CQD est de 0,21 nm, appartenant au plan (1,1,0) du graphite. Le spectre Raman montre que le mode D, appelé mode induit par le trouble, se situe autour de 1342 cm ⁻¹ et le mode G est centré autour de 1 507 cm ⁻¹ , respectivement, en raison du résultat de sp ³ et sp ² -hybridation du carbone (Fig. 1E). On sait que l'intensité du mode D par rapport au mode G dépend de la taille des microcristaux de graphite dans l'échantillon. Le désordre plus élevé de l'échantillon conduit au rapport d'intensité plus élevé de ID/IG et au microcristal de graphite plus petit. De plus, les modes D et G des poudres CQD peuvent également être considérés comme de petits flocons de graphite avec un rapport d'intensité relativement élevé de ID/IG (0,77).

Caractérisations des CQD. Un Images MET de CQD (images MET haute résolution en médaillon) ; B Distributions de taille des CQD ; C Spectres d'absorption UV-vis des CQD ; D Le spectre FL des CQD avec des longueurs d'onde d'excitation de 400 à 500 nm par incréments de 20 nm ; E , F Spectre Raman des CQD et spectre FTIR des CQD

FTIR et XPS sont des outils puissants pour caractériser la composition chimique et la structure des matériaux à base de carbone. Les données FTIR pour les CQD ont été enregistrées dans la plage de 400 à 4000 cm ⁻¹ , comme le montre la figure 1F. Le spectre FTIR a révélé que les CQD contiennent principalement des amines (3052 et 3324 cm ⁻¹ ) ), OH (3 200 cm ⁻¹ ), C=O (1595 cm ⁻¹ ), C–N/C–O (1200 cm ⁻¹ ), C=C (1 500 cm ⁻¹ ) et CH (748 cm ⁻¹ ) des groupes fonctionnels ou des liaisons chimiques [26, 27]. Les composants de surface des CQD, tels que déterminés par XPS, étaient cohérents avec les résultats FTIR. Le spectre complet présenté sur la figure 2A montrait trois pics typiques :C 1s (285 eV), N 1s (400 eV) et O 1s (531 eV).

Spectres XPS des CQD. Un Spectres XPS à grande échelle des CQD ; B Haute résolution de C 1s spectre; C haute résolution de N 1s spectre; D Haute résolution de O 1s spectre

Comme le montre la Fig. 2B–D, un C 1s l'analyse a révélé la présence de sp ² /sp ³ carbones (C–C/C=C, 284,8 eV), carbones nitreux (C–O/C–N, 285,9 eV) et carbones carbonyle (C=O, 287,7 eV). Les N 1s La bande a été déconvoluée en trois pics à 399,3, 400,3 et 401,7 eV, qui correspondent respectivement au N pyrrolique, N graphitique et N aminé. Les O 1s bande contenait des pics à 531,6 et 533,1 eV pour C–O et C=O, respectivement [28, 29]. Il est important de noter que l'existence de ces groupes fonctionnels ci-dessus a doté les CQD d'une solubilité favorable. De plus, les propriétés optiques des CQD ont été étudiées en utilisant la spectroscopie de fluorescence et l'absorption UV-Vis. Les spectres d'émission de fluorescence des CQD sont présentés sur la figure 1C. Les CQD préparés présentent un comportement d'émission de fluorescence dépendant de l'excitation. Lorsqu'il est excité à des longueurs d'onde de 400 à 500 nm, le pic d'émission de fluorescence maximal est décalé vers le rouge de 473 à 519 nm et l'intensité de fluorescence diminue fortement [30]. Comme le montre la figure 1D, les spectres UV-vis de CQD présentaient un fort pic d'absorption dans la plage de longueurs d'onde de 400 à 490 nm. Les CQD présentaient deux pics d'absorption caractéristiques à 280 et 420 nm, qui faisaient respectivement référence aux transitions π–π* (aromatique C=C) et n–π* (carboxyle et/ou C–N) [31, 32]. Par conséquent, ces propriétés optiques des CQD ont permis de réaliser simultanément une imagerie biologique et une inactivation photodynamique.

Bioimagerie et cytotoxicité des CQD

Pour évaluer la capacité des CQD pour la bio-imagerie et le marquage cellulaire, l'imagerie cellulaire in vitro à l'aide de CQD a été étudiée sur des cellules HeLa par un microscope confocal à balayage laser (CLSM). Les cellules Hela ont été incubées avec 200 μg mL ⁻¹ CQDs pendant 6 h, puis préparés pour la détection CLSM. En conséquence, les cellules HeLa ont montré une fluorescence jaune vif uniformément répartie dans toute la cellule (Fig. 3A). Plus important encore, il convient de noter que la faible concentration de CQD de 200 μg mL ⁻¹ était suffisant pour marquer les cellules Hela avec une fluorescence jaune, ce qui a encore précisé la possibilité de CQD dans l'imagerie cellulaire. Comme cela a été rapporté, les nanoparticules de carbone présentaient toujours une forte émission uniquement dans la région de la lumière bleue, tandis que les émissions à grande longueur d'onde étaient généralement faibles. Sous excitation UV, les tissus biologiques présentaient fréquemment une autofluorescence bleue et étaient vulnérables aux dommages photoélectriques, ce qui entrave sérieusement les applications d'analyse d'imagerie biologique des nanoparticules de carbone avec des émissions à courte longueur d'onde [33]. Par conséquent, le développement de nanoparticules de carbone avec des émissions à grande longueur d'onde a été largement concerné. Dans la présente étude, les CQD tels que préparés ont montré une fluorescence jaune vif sous l'excitation d'une lumière de 400 à 450 nm. La fluorescence jaune excitée pourrait ainsi permettre d'utiliser les CQD pour la détection de tumeurs profondes. Cependant, il reste encore un long chemin à parcourir avant des applications pratiques en imagerie du cancer humain.

Application des CQD. Un Imagerie CLSM de cellules HeLa marquées avec des CQD ; B Test de cytotoxicité in vitro des CQD ; C Viabilité relative des cellules HeLa incubées avec une solution de contrôle ou des CQD (200 μg mL ⁻¹ ) et exposé à la lumière bleue (460 nm, 30 mW cm ⁻² ) pendant 5 min, 10 min et 15 min ; D L'IC50 des CQD excités sur les cellules Hela après exposition à la lumière bleue pendant 10 et 15 min (*P < 0,05)

Outre la caractéristique de luminescence, une biocompatibilité élevée et une faible toxicité sont toujours requises si les CQD sont destinés à être développés en tant que réactif potentiel de biomarquage. Pour les applications biomédicales, les matériaux doivent être hautement biocompatibles aux doses recommandées. Pour examiner la cytotoxicité, les cellules HeLa ont été traitées avec des CQD à des concentrations finales allant de 0 à 400 μg mL ⁻¹ pendant 24 h. Comme le montre la figure 3B, plus de 95 % des cellules ont survécu, comme déterminé par les tests MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), qui ont révélé que les CQD étaient pratiquement non- toxique.

Ces données suggèrent que les CQD nouvellement générés avec une fluorescence jaune excitée ont une faible cytotoxicité et une biocompatibilité élevée, ce qui facilite leur perspective prometteuse d'imagerie biologique.

Efficacité de la thérapie photodynamique

Inactivation des cellules cancéreuses

Comme le montre la figure 3C, la viabilité ne différait pas entre les cellules HeLa traitées avec des CQD ou la lumière bleue seule. Un traitement simultané avec des CQD et de la lumière bleue a considérablement réduit la viabilité cellulaire des cellules Hela, en fonction de la durée de la photo-exposition. Après irradiation à 460 nm pendant 15 min, les CQD ont affiché une activité antitumorale remarquable ; la viabilité des cellules HeLa a diminué d'environ 40 % à une concentration de 200 μg mL ⁻¹ . Pour détecter davantage les effets des CQD excités, des tests MTT ont été mis en œuvre pour évaluer la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) des CQD excités aux cellules Hela. En conséquence, l'IC50 des CQD après avoir été excités sur des cellules Hela était d'environ 427,5 μg mL ⁻¹ (IC à 95 % 366,7 à 498,7 μg mL ⁻¹ ) après une irradiation de 10 min et était d'environ 255,1 μg mL ⁻¹ (IC à 95 % 220,9–249,8 μg mL ⁻¹ ) après exposition à la lumière bleue pendant 15 min.

Ces résultats ont indiqué que les CQD excités pouvaient tuer efficacement les cellules tumorales comme certains médicaments anticancéreux cliniques, tels que Photofrin [34], ce qui a incité la valeur prometteuse des CQD dans la thérapie antitumorale guidée par imagerie.

Génération ROS de CQD

Au cours de la PDT, les cellules cancéreuses peuvent être tuées par les ROS cytotoxiques générées par le photosensibilisateur endocytosé dans des conditions d'irradiation appropriées [35, 36]. Les ROS peuvent inactiver les cellules cibles par apoptose ou nécrose avec peu d'effets secondaires via la PDT dans plusieurs maladies [37,38,39,40]. L'inspection de la figure 4A a montré que le réactif ROS émet une fluorescence rouge, indiquant la génération de ROS. De plus, le signal rouge des ROS chevauchait bien la fluorescence des CQD, ce qui signifie que la génération de ROS était étroitement associée à l'absorption des CQD par les cellules tumorales. Comme le montre la figure 4B, par rapport aux groupes témoins et sans irradiation laser, les groupes expérimentaux sous irradiation laser à 460 nm pendant 15 min ont montré une génération évidente de ROS. Nos résultats ont indiqué que les CQD pouvaient favoriser de manière significative la production de ROS intracellulaires sous l'irradiation d'un laser à 460 nm et avaient un grand potentiel d'application en PDT. En principe, les CQD peuvent être excités de l'état fondamental (S0 sur la figure 4C) à un état excité (Sn sur la figure 4C), et l'efficacité de ce processus est déterminée par l'intensité de la source lumineuse et le coefficient d'extinction. . Après relaxation médiée par le solvant, les CQD restent au niveau de vibration le plus bas du premier état excité du singulet. En raison de la relaxation vibrationnelle rapide suivant l'excitation, l'énergie du photon émis par le premier état excité singulet (S1 sur la figure 4C) est inférieure à l'énergie du photon d'excitation, ce qui entraîne une augmentation de la longueur d'onde. L'imagerie par fluorescence utilise la transition des CQD de S0 à Sn à S1 [41]. Les CQD ont été ingérés par les cellules tumorales HeLa et ont émis une fluorescence lorsqu'ils étaient illuminés par une source de longueur d'onde appropriée, permettant ainsi aux cellules d'être marquées. S1 peut revenir à l'état S0 par fluorescence ou par croisement intersystème vers un état excité triplet non fluorescent (T1 sur la Fig. 4C) [7, 42]. Le groupe fluorescent de T1 est particulièrement actif dans les réactions de transfert d'électrons, générant des radicaux libres superoxydes et entraînant par la suite une dégradation du groupe fluorescent. L'énergie de T1 transférée à l'oxygène moléculaire produirait un agent oxydant d'oxygène singulet excité qui est plus fort que l'oxygène moléculaire à l'état fondamental. Les radicaux superoxydes et l'oxygène singulet, ainsi que d'autres ROS, dont OH et H₂ O₂ , réagissent avec des molécules biologiques voisines pour exercer une phototoxicité, entraînant la mort cellulaire. Une fois que les CQD ont été absorbés par les cellules HeLa, l'illumination a entraîné le transfert de l'état singulet à l'état triplet à travers l'intersystème, et le processus de transfert d'énergie a produit des ROS et a finalement conduit à la mort cellulaire. Sous la source de longueur d'onde appropriée, les CQD subissent deux types de transfert d'énergie. Une fluorescence a été émise pour marquer les cellules tumorales HeLa, et les cellules HeLa ont été tuées par les ROS. Nos données expérimentales ont révélé la bonne biocompatibilité des CQD nouvellement produits dans l'obscurité et l'efficacité de destruction des tumeurs dans des conditions de lumière. Par conséquent, les CQD pourraient être utilisés comme photosensibilisateurs pour les cellules et les tissus tumoraux.

Génération de ROS intracellulaires. Un Images de fluorescence de HeLa, (a) Image de transmission de champ clair, (b) Image de fluorescence CQDs collectée dans la plage de 400 à 450 nm, (c) Image de fluorescence du réactif de détection ROS capturée dans la plage de 510 à 530 nm, et (d ) l'image fusionnée ; B La production intracellulaire de ROS pour diverses concentrations de CQD avec ou sans irradiation pendant 15 min ; C un diagramme simplifié des niveaux d'énergie montre les voies potentielles de transfert d'énergie de fluorescence et de mort cellulaire. (S0, état fondamental de la molécule de fluorophore ; S1, premier état excité singulet ; Sn (n> 1) ; T1, premier état excité du triplet ; Ex, excitation par absorption de photons; FL, fluorescence)

De plus, la façon dont les CQD peuvent cibler la tumeur avec précision et tuer les cellules tumorales plus efficacement reste un problème non résolu. L'abondance existante de groupes hydrophiles fonctionnels de surface (carboxyle, carbonyle, époxy, hydroxyle, hydroxyle, etc.) permet aux points de carbone de se conjuguer avec des anticorps spécifiques qui pourraient cibler précisément les tumeurs, ce qui nécessite que la tumeur ait des biomarqueurs spécifiques. Simultanément, les points de carbone pourraient également servir d'outil pour l'administration de médicaments et de gènes en raison de leur rapport surface / volume élevé [43]. Compte tenu de l'excellente biocompatibilité, de la petite taille pour l'internalisation par les cellules tumorales, de la richesse en fragments fonctionnels de surface et des potentiels de bio-imagerie, les points de carbone (y compris les CQD) sont censés devenir des candidats théranostiques prometteurs pour la thérapie tumorale. Cependant, il existe encore des défis et de nombreux problèmes non résolus pour les applications des points de carbone en nanomédecine et en bio-imagerie. Davantage d'efforts devraient être déployés pour promouvoir la traduction de la nanomédecine liée aux points de carbone du laboratoire au chevet du patient à l'avenir.

Conclusions

En résumé, nous avons synthétisé des CQD photoluminescents en utilisant o -phénylènediamine par la méthode plasma. Excités par un laser bleu, les CQD d'un diamètre d'environ 3,2 nm émettaient une fluorescence jaune. Les résultats Raman, UV-vis, FTIR et XPS ont montré que davantage d'atomes de carbone étaient impliqués dans sp ² hybridation, formant un nouveau groupe organique. Les CQD synthétisés par la méthode du plasma se sont avérés être une sonde efficace dans les expériences d'imagerie cellulaire, et la fluorescence jaune émise par les CQD peut clairement marquer les cellules HeLa. De plus, les CQD synthétisés ont montré une solubilité favorable, non toxiques et une biocompatibilité élevée, ce qui pourrait accélérer leur capacité de bio-imagerie. De plus, les CQD excités pourraient tuer efficacement les cellules Hela par génération de ROS, qui présentaient clairement une cytotoxicité photodynamique satisfaisante des CQD in vitro et soutenaient leurs applications en PDT.

Méthodes expérimentales

Synthèse de points quantiques de carbone

Le système de traitement des microplasmes est résumé dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1. Un tuyau creux en acier inoxydable d'un diamètre intérieur de 180 μm a été connecté à une source d'alimentation en courant continu haute tension (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, Chine) et a été maintenu à 2 mm au-dessus de la surface de la Solution. Une électrode en Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, Chine) a été connectée à la cathode de la source d'alimentation et immergée dans la solution. Ensuite, 400 mg de o -la phénylènediamine (Shanghai, Chine) a été dissoute dans 40 mL d'eau déminéralisée et 20 mL de o Une solution de phénylènediamine a été ajoutée à une boîte de Pétri et agitée à l'aide d'un agitateur magnétique. Pendant le traitement au microplasme, le gaz argon (Ar) a traversé le tuyau à un débit de 60 sccm et le courant continu a été maintenu à 17 mA. Après 10 min de traitement au plasma, le produit noir brunâtre a été dialysé à l'aide d'une membrane de dialyse (seuil de poids moléculaire, 500 Da) contre 2 L d'eau déminéralisée pendant 12 h, puis filtré à travers une membrane d'ultrafiltration de 0,22 μm. Enfin, des CQD purs ont été obtenus par lyophilisation.

Caractérisation de la structure, de la composition et des propriétés optiques des CQD

La taille et la morphologie des CQD ont été caractérisées par MET en utilisant un système JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japon). La spectroscopie de fluorescence a été réalisée en utilisant un spectromètre de luminescence Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, USA). Les spectres d'absorption UV/Vis ont été mesurés à l'aide du spectrophotomètre Varian Cary 50 UV-VIS (Palo Alto, CA, USA). Les spectres FTIR ont été obtenus en utilisant un spectroscope Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), et la spectroscopie Raman a été réalisée en utilisant le spectromètre 800 UV micro-Raman (Invia-reflex, UK). Les expériences XPS ont été réalisées à l'aide d'un système Axis Ultra DLD (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japon).

Culture cellulaire et test de cytotoxicité

Des cellules HeLa (ATCC, Manassas, VA, USA) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans un milieu humidifié à 5 % de CO₂ atmosphère. Pour les études de cytotoxicité des CQD, les cellules ont été comptées et ensemencées dans des plaques à 96 puits contenant 200 μL de milieu complet à une densité de 6000 cellules par puits. Après 24 h de culture, les cellules ont été incubées avec des CQD à des concentrations de 0, 25, 50, 100, 200 et 400 μg mL ⁻¹ pendant encore 24 h, puis les viabilités cellulaires ont été détectées à l'aide de tests MTT pour évaluer la cytotoxicité des CQD. Brièvement, ces solutions ont été remplacées par 100 L de solution de test MTT (0,5 mg mL ⁻¹ ) et incubé pendant 4 h dans un incubateur à l'obscurité. Le surnageant a été éliminé et les cristaux ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Enfin, l'absorbance de chaque puits a été mesurée à 490 nm. La densité optique était liée à la viabilité cellulaire en supposant une viabilité de 100 % pour l'échantillon de contrôle sans CQD.

Le test MTT a également été utilisé pour évaluer la CI50 des CQD excités sur les cellules Hela. En bref, des cellules Hela dans une plaque à 96 puits ont été incubées avec des CQD à des concentrations de 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 et 6400 μg mL ^-1 pendant 24 h dans l'incubateur, traité à la lumière à 460 nm pendant 10 min ou 15 min séparément, puis cultivé pendant 24 h supplémentaires. La viabilité cellulaire de chaque puits a été détectée à l'aide du test MTT et les données ont été utilisées pour l'évaluation de la CI50.

Imagerie cellulaire

Cellules à une concentration de 2 × 10 ⁴ ml ⁻¹ ont été ensemencées dans une boîte confocale (diamètre = 15 mm), cultivées pendant 24 h et lavées deux fois avec du PBS pour s'assurer qu'il n'y a pas de cellules mortes. Une solution CQD (200 μg mL ⁻¹ ; pH 7) a été ajouté et les cellules ont été incubées pendant 6 h. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS trois fois pour éliminer les CQD non liés et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, les échantillons ont été observés à l'aide d'un CLSM (LSM510, Zeiss, Allemagne) avec une excitation à des longueurs d'onde allant de 400 à 450 nm.

Thérapie photodynamique et mesure ROS

Pour étudier les effets antitumoraux, les cellules HeLa ont été incubées avec 200 μg mL ⁻¹ CQD pendant 24 h à 37 °C dans l'obscurité et traités à la lumière à 460 nm (30 mW cm ⁻² ) pendant 5, 10 et 15 min. Après 24 h d'incubation, un test MTT standard a été effectué pour déterminer la viabilité cellulaire relative. La génération intracellulaire de ROS a été détectée chimiquement en utilisant la méthode spectrophotométrique avec Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit (sigma, USA). Les cellules ont été cultivées dans une boîte confocale (diamètre   =15 mm) pendant la nuit pour la fixation des cellules. Ensuite, les cellules ont été incubées avec 200 μg mL ⁻¹ CQD pendant 4 h. Par la suite, 100 μL/puits de Master Reaction Mix ont été ajoutés. Après incubation pendant 1 h, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 10 min, et des images de fluorescence des cellules ont été observées par CLSM. En ce qui concerne la détection de la production de ROS, les cellules ont été cultivées dans des plaques à 96 puits avec 200 μL de milieu de culture. Après 24 h d'incubation, le milieu a été remplacé par 100 μL de solution de CQD aux concentrations de 0, 100, 200 μg mL ⁻¹ , et les cellules ont été incubées pendant encore 4 h. Par la suite, les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS, irradiés pendant 15 min ou non, et incubés avec 100 μL/puits de Master Reaction Mix pendant 1 h. Enfin, l'intensité de fluorescence a été détectée à l'aide d'un lecteur de fluorescence (excitation 520 nm, émission 605 nm).

Analyses statistiques

Les expériences impliquées dans cette étude ont été répétées trois fois et des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS19.0. Les différences entre les deux groupes ont été comparées à l'aide de Mann-Whitney U test. La CI50 des CQD excités sur les cellules Hela a été évaluée en utilisant une régression non linéaire. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données et les matériaux de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Abréviations

PDT :

Thérapie photodynamique

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

CQD :

Points quantiques de carbone

TEM :

Microscope électronique à transmission

CLSM :

Microscope confocal à balayage laser

DMEM :

Médium d'aigle modifié de Dulbecco

MTT :

Bromure de 3-(4,5-Diméthylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

IC50 :

Concentration inhibitrice demi-maximale