Nanoliposomes décorés d'anticorps monoclonaux PD-L1 chargés de paclitaxel et d'inhibiteur de transport P-gp pour la chimiothérapie synergique contre les cancers gastriques multirésistants

Introduction

Les traitements chimiothérapeutiques actuels basés sur un régime médicamenteux unique sont loin d'être parfaits et souffrent d'effets indésirables graves à des doses plus élevées et conduisent simultanément au développement d'une résistance aux médicaments [1]. La dernière décennie a été témoin de la grande efficacité thérapeutique du schéma thérapeutique combiné dans le traitement du cancer [2]. Il a été démontré que la combinaison de deux médicaments ou plus produit une efficacité anticancéreuse synergique en raison de l'action pharmacologique différente des médicaments combinés [3, 4]. Cependant, le choix d'une bonne combinaison de médicaments dépend de plusieurs facteurs, notamment le type de cellules cancéreuses, les médicaments hydrophiles/hydrophobes, les activités biochimiques et les profils pharmacocinétiques des médicaments. Parmi tous, la combinaison de médicaments est sélective pour certains types de cancers [5].

Le cancer gastrique est un fardeau pour la santé mondiale et la deuxième cause de décès par cancer dans le monde. La prévalence du cancer gastrique est élevée en Asie de l'Est comme le Japon, la Corée et la Chine, cette dernière affichant le taux de mortalité le plus élevé au monde [6]. En moyenne, 400 000 nouveaux cas sont enregistrés chaque année en Chine et la plupart des cas sont diagnostiqués à des stades avancés/ultérieurs [7, 8]. Des progrès énormes ont été réalisés dans les stratégies de traitement; cependant, il n'a pas amélioré le taux de survie et a entraîné un échec du traitement. L'échec du traitement est principalement attribué au développement d'une chimiorésistance et à une toxicité sévère de la dose de chimiothérapie et à la réapparition d'un épisode de cancer gastrique [9]. Par conséquent, il est urgent d'améliorer l'efficacité thérapeutique et de surmonter les métastases et la réapparition du cancer gastrique.

Le paclitaxel (PTX) est l'un des médicaments importants indiqués dans le traitement des cancers gastriques [10]. La PTX inhibe la réplication cellulaire en interférant avec la dégradation des microtubules, ce qui conduit à l'arrêt du cycle cellulaire. Cependant, l'acquisition d'une multirésistance (MDR) est un obstacle majeur entre le succès de la chimiothérapie [11, 12]. L'efflux ATP-dépendant médié par les transporteurs transmembranaires de la famille des cassettes de liaison à l'ATP (ABC) dans laquelle la glycoprotéine p (p-gp) est considérée comme le facteur d'affluence est surexprimé chez les cancers gastriques [13]. D'une autre manière, la PTX sert de substrat pour les récepteurs p-gp dans lesquels l'efflux de médicament réduira la concentration intracellulaire de médicament, entraînant une faible efficacité et une résistance élevée [14]. À cet égard, Tariquidar (TQD) est un puissant inhibiteur de la p-gp de troisième génération et il a été rapporté qu'il renverse la surexpression des récepteurs de la p-gp dans plusieurs cellules cancéreuses [15, 16]. Cependant, des rapports suggèrent que l'administration de TQD doit être interrompue tôt car elle entrave la fonction p-gp du système physiologique normal. L'expression de la P-gp est nécessaire pour maintenir la barrière hémato-encéphalique (BHE) et éliminer les toxines des tissus normaux [17]. Étant donné que la p-gp est présente dans les tissus normaux et agit comme une barrière contre les toxines cellulaires, une inhibition non spécifique de la PTX ou de la TQD pourrait potentiellement interférer avec les fonctions physiologiques normales et entraîner une toxicité indésirable. En outre, PTX et TQD sont des médicaments hautement lipophiles avec une solubilité limitée dans les solutions aqueuses et le sang systémique, ce qui nécessite la nécessité d'un système d'administration de médicament stable qui cible les cancers gastriques dans le corps [18].

Le système d'administration de médicament (DDS) a considérablement augmenté la concentration de médicaments encapsulés dans les tissus cancéreux et a offert une libération prolongée de médicament pendant une période de temps prolongée [19]. À cet égard, le liposome est l'un des vecteurs de médicaments largement utilisés pour améliorer l'efficacité thérapeutique dans les cancers. Les liposomes ont pris une importance croissante en raison de leur biocompatibilité, de leurs modifications structurelles de surface, de leur charge de médicament hydrophile/lipophile et de leur capacité de charge de médicament élevée [20]. Les médicaments pourraient être incorporés de manière stable dans la bicouche lipidique du liposome et facilement dotés d'une capacité de circulation longue (PEGylation) grâce à un effet de perméation et de rétention (EPR) amélioré [21]. Récemment, il a été rapporté que les liposomes pouvaient conserver les ratios de plusieurs médicaments après administration intraveineuse [22]. Cette idée a été démontrée en 2017 après l'approbation de la FDA, Vyxeos® (formulation liposomale) contenant des ratios cytarabine:daunorubicine dans le traitement de la leucémie [23]. Par rapport aux formulations non ciblées, les formulations ciblées par ligand étaient très attrayantes et prospectives. À cet égard, PD-1 est un récepteur de surface cellulaire connu pour la régulation négative du système immunitaire et supprime l'activité inflammatoire des cellules T. L'expression de PD-L1 a été rapportée chez 50 % des patients atteints de cancer gastrique faisant de PD-L1 un récepteur de ciblage pour l'internalisation des nanoparticules [24, 25]. L'anticorps monoclonal (mAb) PD-L1 pourrait se lier spécifiquement au domaine extracellulaire de la protéine PD-L1 et pourrait être une excellente stratégie thérapeutique pour améliorer l'efficacité anticancéreuse [26].

L'objectif principal de la présente étude était d'améliorer l'administration de médicaments combinés, PTX et TQD pour améliorer l'efficacité anticancéreuse contre les cancers gastriques. À cette fin, le PD-L1/nanoliposome chargé de PTX et de TQD a été formulé et évalué pour son efficacité anticancéreuse dans des conditions in vitro et in vivo. L'efficacité in vivo a été évaluée dans un modèle de xénogreffe à base de cellules de cancer gastrique et une immunohistochimie (IHC) a été réalisée.

Conclusion

En conclusion, notre travail a réalisé une thérapie combinée contre la tumeur MDR par stratégie d'administration programmée. Nous avons démontré le potentiel de la combinaison de la PTX et de l'inhibiteur de la p-gp (TQD) pour inhiber la charge tumorale des tumeurs xénogreffes multirésistantes SGC7901/ADR. La co-administration de PTX et de TQD dans un nanosupport multifonctionnel a permis le contrôle ratiométrique de médicaments anticancéreux co-chargés, a inhibé la pompe d'efflux de la p-gp et a montré une efficacité anticancéreuse synergique. Nous pensons que la combinaison d'un médicament anticancéreux avec un inhibiteur de la p-gp pourrait fournir une orientation potentielle vers le traitement des tumeurs résistantes aux médicaments.

Matériaux et méthodes

Formulation de nanoliposomes chargés de PTX/TQD conjugués à l'Acm PD-L1

L'œuf phosphatidylcholine (EPC), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] ( DSPE-PEG) et DSPE-PEG2000-maléimide (DSPE-PEG2000-Mal) mélangés dans une solution de chloroforme à un rapport molaire de 3/2/0,5/0,25 avec PTX et TQD, puis le solvant organique a été évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif suivi d'une lyophilisation pendant 3 h. Le film lipidique a été hydraté avec une solution de sulfate d'ammonium 250 mM maintenue à pH 7,0. Les grands liposomes multilamellaires ont été soniqués pendant 30 min dans un sonicateur de type bain (Branson ultrasonicbath, USA) maintenu à 65 °C. Les liposomes ont été dialysés contre un grand volume d'eau distillée pendant strictement 1 h pour échanger le médicament libre et les composants initiaux. Les liposomes ont été redispersés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4). Le mAb PD-L1 a été conjugué au liposome par mélange dans un rapport de 8:1 (liposome:mAb) et incubé à 4°C pendant 4 h. Le mAb PD-L1 sera conjugué au DSPE-PEG2000-Mal en interagissant entre les résidus sulfhydryle sur les anticorps dirigés contre les groupes maléimide C-terminaux des liposomes. Les liposomes conjugués à PD-L1 ont été centrifugés à 10 000 tr/min pendant 10 min et le surnageant a été retiré et redispersé dans un tampon PBS et conservé à 4 °C jusqu'à une analyse plus approfondie. La quantité de PTX et de TQD encapsulée dans le liposome a été évaluée par la méthode HPLC. Le modèle de système HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity équipé d'un échantillonneur automatique Agilent Technologies et d'un détecteur à barrette de diodes G1315D a été utilisé dans l'étude. La phase mobile est constituée d'un mélange acétonitrile/eau (70:30 v/v) maintenu à un débit de 1 ml/min. Une colonne C18 (5 µm, 150 × 60 mm, ODS-3) a été utilisée pour éluer les échantillons et détectée à 227 nm. Avant , le liposome chargé de PTX/TQD a été dissous dans un acétonitrile et vortexé pendant 15 min, filtré à travers un filtre de 0,45 µm, et 10 µl d'aliquote ont été injectés dans la colonne HPLC.

Analyse de la distribution des tailles et de la morphologie des particules

La distribution de taille et le potentiel zêta des formulations chargées de médicament ont été déterminés par Malvern zetasizer (Royaume-Uni) à 25 °C. Avant l'expérience proprement dite, les dispersions de nanoparticules ont été diluées 10 fois avec de l'eau distillée et l'expérience a été réalisée à un angle de détection de 90° en triple. La morphologie des nanoparticules a été évaluée au microscope électronique à transmission (MET). Les dispersions de nanoparticules ont été diluées 10x avec de l'eau distillée et placées dans une grille de cuivre recouverte de carbone et séchées à l'aide d'une lampe IR puis l'échantillon a été évalué par MET (CM 30, Philips (Eindhoven, Pays-Bas)) après coloration à l'acétate d'uranyle (1% p/v).

Analyse du profil de version

Le profil de libération de PTX et de TQD à partir de nanoliposomes a été évalué par la méthode de dialyse. À cette fin, 15 mg de poudre lyophilisée de PTX conjugué à l'Acm PD-L1 et de nanoliposomes chargés de TQD (PD-PTLP) ont été dissous dans 1 ml d'eau distillée et scellés dans une membrane de dialyse (MWCO 3,5 kDa) et immergés dans un 30 ml de tampon de libération respectif maintenu à 37 °C. A un moment prédéterminé, des aliquotes d'échantillons ont été prélevées et remplacées par une quantité égale de tampon de libération. L'étude a été poursuivie pendant 72 h. Les échantillons ont été filtrés à travers un filtre seringue de 0,22 m et injectés dans la colonne HPLC et évalués par la méthode mentionnée ci-dessus.

Études d'absorption cellulaire

Les cellules SGC7901/ADR ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété avec 10 % de FBS et 100 UI/ml de pénicilline et 100 g/ml de streptomycine dans des conditions de 5 % de CO₂ atmosphère à 37°C. Un microscope confocal à balayage laser (BX61WI; Olympus, Tokyo, Japon) a été utilisé pour évaluer la distribution cellulaire et l'absorption cellulaire de PTLP et PD-PTLP dans les cellules SGC7901/ADR. Pour atteindre cet objectif, 1 × 10 ⁵ les cellules ont été ensemencées dans chaque puits d'une plaque à 12 puits et incubées pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été exposées avec du PTLP et du PD-PTLP et incubées pendant 3 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 10 min. Les cellules ont été à nouveau lavées avec du PBS et colorées avec du 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min. Enfin, les cellules ont été soigneusement lavées et observées sous CLSM. L'expérience compétitive sur l'absorption de PD-PTLP a été réalisée en prétraitant les cellules étaient libres de mAb PD-L1 pendant 30 min et lavées. Les cellules ont été divisées en deux groupes, l'un traité avec l'Acm PD-L1 libre et l'autre non traité avec l'Acm PD-L1 libre. Les cellules ont été incubées avec du PD-PTLP et incubées pendant 3 h et la même méthode a été suivie pour l'évaluation de l'analyse de l'absorption cellulaire.

Expression des protéines par test Western blot

Les cellules SGC7901/ADR ont été ensemencées en plaque 6 puits à une densité d'ensemencement de 3 × 10 ⁵ cellules/puits et incubés pendant 18 h. Les cellules ont été traitées avec différentes formulations (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) et incubées pendant 24 h. Les cellules ont été lavées et extraites avec un tampon de stripping et lysées en utilisant un tampon de lyse standard (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Les cellules ont été centrifugées à une vitesse de 12 000 tr/min pendant 15 min et le surnageant a été collecté et la quantification des protéines a été réalisée en utilisant le dosage des protéines BCA (Beyotime). Une quantité égale de protéines a été chargée dans un gel SDS-PAGE à 8 % puis transférée sur une membrane de nitrocellulose (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 h pour inhiber les sites de liaison non spécifiques. La membrane a été incubée avec des anticorps primaires (p-gp et GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, USA) à 4°C pendant une nuit. La membrane a été lavée avec du TBST et de nouveau incubée avec des anticorps secondaires d'anticorps de chèvre anti-lapin ou de souris marqués à la peroxydase de raifort (lapin ou souris, 1:10 000, Abcam, MA, USA) à température ambiante. Les membranes ont été à nouveau lavées avec du TBST. Les transferts ont été visualisés par une méthode de chimiluminescence améliorée (EMD Millipore).

Analyse de cytotoxicité in vitro

L'effet cytotoxique de médicaments et de formulations individuels a été évalué par dosage MTT. En bref, les cellules cancéreuses ont été stratifiées à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules/puits dans une plaque à 96 puits et incubés pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec du PTX libre, du TQD, du PTLP et du PD-PTLP, respectivement pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été soigneusement lavées et additionnées de 15 µl de solution de MTT à 5 mg/ml et soumises pendant 3 h d'incubation supplémentaire, puis 100 µl de DMSO ont été ajoutés pour extraire le cristal de formazan. L'absorbance résultante a été mesurée à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaque automatisé. La viabilité cellulaire est calculée par DO du groupe de test/DO du contrôle × 100 %. L'indice de combinaison a été évalué par Calcusyn ^TM Logiciel. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Analyse in vitro de l'apoptose et des espèces réactives de l'oxygène

Pour le test d'apoptose, les cellules cancéreuses ont été stratifiées à une densité de 2 × 10 ⁵ cellules/puits dans une plaque de 12 puits et incubés pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec du PTX libre, du TQD, du PTLP et du PD-PTLP, respectivement pendant 24 h. Les cellules ont été extraites par stripping et centrifugées et les culots ont été redispersés dans 100 µl de tampon de liaison. Les cellules ont été co-colorées avec un combo de 5 l d'Annexine-V/FITC et 2,5 l de solution de travail PI et incubées pendant 15 min. Les cellules colorées ont été analysées par cytomètre en flux en utilisant un BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, USA). L'annexine-V et le PI représentent l'indicateur d'apoptose précoce et l'indicateur d'apoptose tardive basés sur les composants structurels des cellules vivantes et mortes, respectivement.

Le diacétate de 2,7-dichlorofluorescine (DCFH-DA) a été utilisé comme sonde pour l'analyse des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Pour l'analyse quantitative, 1 × 10 ⁴ les cellules/puits ont été ensemencées dans une plaque à fond noir à 96 puits et incubées pendant 18 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec du PTX libre, du TQD, du PTLP et du PD-PTLP, respectivement pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec du tampon PBS puis incubées avec 1 ml de solution de DCFH-DA selon les directives du fabricant pendant 30 min. Suivi des cellules lysées et centrifugées à 10 000 rpm pendant 15 min. Le surnageant résultant a été transféré dans une nouvelle plaque à 96 puits et la fluorescence a été mesurée à 485 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque automatisé. Simultanément, des ensembles séparés de cellules ont été traités de la même manière et des images ont été observées à l'aide d'un microscope à fluorescence (Nikon A1, Japon).

Efficacité antitumorale du PD-PTLP dans le modèle de xénogreffe

L'étude d'efficacité antitumorale a été réalisée sur des souris nudes BALB/c et a été obtenue auprès du Laboratory Animal Center, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin. Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux normes nationales de qualité des animaux de laboratoire. Les expériences ont été strictement réalisées conformément aux directives du Comité du Règlement sur les animaux expérimentaux du quatrième hôpital affilié de l'Université médicale de Harbin, à Harbin. Les animaux ont reçu une injection sous-cutanée de 1 × 10 ⁶ Cellules SGC7901/ADR dans 150 µl de milieu de culture dans le flanc droit des souris. Les tumeurs ont pu croître jusqu'à 100 mm ³ avant l'expérience proprement dite. Les souris ont été divisées également en cinq groupes avec huit souris dans chaque groupe. La dose individuelle de PTX et de TQD a été fixée à 5 mg/kg, alors que la combinaison a utilisé une dose totale de 5 mg/kg. L'injection dans la veine caudale a eu lieu tous les trois jours, au total, trois injections ont été effectuées. A des jours prédéterminés, le volume tumoral et le poids corporel ont été mesurés. Le volume tumoral a été calculé en mesurant le diamètre le plus long et le diamètre le plus court des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse numérique. Volume tumoral (V ) =½ × longueur × largeur (mm) ² . Les souris ont été sacrifiées à la fin de l'étude et la tumeur a été extraite et pesée. La tumeur a été soumise à une analyse immunohistochimique (IHC). Les tumeurs ont été extraites, tranchées en un morceau mince et fixées dans une solution de formol à 10 %. Les tumeurs ont été incluses dans une cire de paraffine, puis ont effectué le test TUNEL conformément aux directives du fabricant.

Analyse biochimique du sérum

Les souris ont reçu les formulations respectives; 24 h plus tard, les souris ont été sacrifiées et des échantillons de sang ont été prélevés sur les groupes d'animaux témoins et traités. Le sérum est séparé du sang total et conservé à - 80 °C jusqu'à une analyse plus approfondie. Une analyse biochimique du sérum a été réalisée pour évaluer la performance du foie. L'aspartate transaminase (AST) et l'alanine transaminase (ALT) ont été mesurées pour évaluer la fonction hépatique. Toutes les mesures ont été effectuées conformément aux procédures du test du kit biochimique.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation de nanoliposomes conjugués PD-L1 chargés PTX/TQD

Le PTX a été largement utilisé dans les cliniques et principalement indiqué dans le traitement des cancers gastriques. Cependant, la majorité des patients souffre apparemment d'une mauvaise réponse thérapeutique en raison de la multirésistance aux médicaments (MDR) des cancers gastriques. Une augmentation de la dose de PTX a entraîné une toxicité systémique accrue, de sorte que la MDR est devenue un obstacle majeur au succès du traitement du cancer. Parmi la pléthore de mécanismes MDR, l'efflux de médicament médié par la p-gp est considéré comme étant principalement responsable de la résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses [27]. Par conséquent, dans cette étude, nous avons utilisé un deuxième médicament (TQD) comme inhibiteur de la p-gp pour surmonter le phénomène MDR dans les cellules cancéreuses et améliorer l'efficacité anticancéreuse de la PTX. Nous avons soigneusement étudié la fraction pondérale de deux médicaments dans laquelle ils présentent l'effet synergique. Afin de maximiser l'effet anticancéreux, il est important de co-administrer les multiples médicaments dans un seul système de nanoparticules. L'administration simultanée de deux médicaments (PTX et inhibiteur de la p-gp) permettra la suppression efficace du mécanisme d'efflux de médicament et augmentera la perspective d'une augmentation des concentrations intracellulaires dans les cellules cancéreuses [28]. À cette fin, dans cette étude, nous avons chargé deux médicaments dans la bicouche lipidique de nanoliposomes qui sont considérés comme extrêmement stables dans les circulations systémiques (Fig. 1). Pour obtenir un ciblage spécifique à la tumeur amélioré, des nanoliposomes ont été conjugués en surface avec du mAb PD-L1. Le groupe maléimide présent dans le nanoliposome se liera au groupe thiol du mAb PD-L1 et formera une liaison covalente stable. Mais une limitation possible de la conjugaison du maléimide est que la réaction est réversible :le produit peut subir des réactions d'addition rétro-Michael avec des thiols biologiques dans le plasma qui peuvent conduire à la libération du maléimide. Cependant, nous avons surmonté une telle réaction par une conjugaison maximale de surface de l'anticorps sur le maléimide-liposome. Il a été rapporté que le ligand ciblant la tumeur délivrera spécifiquement la charge thérapeutique dans les tissus tumoraux et évitera les effets secondaires inutiles dans les tissus normaux. Auparavant, Patel et al. ont rapporté que l'incorporation d'un inhibiteur de la p-gp avec la PTX pouvait surmonter la MDR dans la cellule cancéreuse de l'ovaire dans des conditions in vitro [11]. De même, Zou et al. et Zhang et al. ont rapporté que la cytotoxicité de la PTX contre les cellules multirésistantes SKOV-3TR et A2780-Adr augmentait significativement en présence de Tariquidar. Cependant, dans ces études, soit une combinaison physique de PTX + TQD a été utilisée, soit un transporteur non ciblé a été développé [29, 30]. Il est important de noter que toutes ces études ont été réalisées uniquement dans des conditions in vitro. La présente étude s'est concentrée sur la conception du nanocarrier ciblé à l'aide d'une classe relativement nouvelle d'agents de ciblage, l'anticorps PDL1. En outre, la présente étude a démontré l'efficacité de PTX + TQD dans le modèle de tumeur de xénogreffe et a également évalué les paramètres sanguins liés à la toxicité systémique.

Illustrations schématiques du chargement de paclitaxel et de tariquidar dans des nanoliposomes conjugués à la surface de l'anticorps monoclonal (mAb) PD-L1. Le liposome a été préparé par hydratation d'un film lipidique mince et soniqué pour former les nanoliposomes chargés de médicament

La taille moyenne des particules de PTLP était de 135,6 ± 1,26 nm alors qu'elle augmentait à 168,59 ± 1,34 nm après conjugaison avec l'Acm PD-L1 (PD-PTLP). La taille des particules a augmenté en raison du poids moléculaire élevé du mAb PD-L1 ; néanmoins, la taille globale inférieure à 200 nm et la forme sphérique étaient le point à noter (Fig. 2a). Une taille de nanoparticules inférieure à 200 nm permettra une accumulation plus élevée dans les tissus tumoraux en raison de l'effet amélioré de perméation et de rétention (EPR). De plus, la présence de PEG permettra de prolonger le temps de circulation sanguine dans la circulation systémique. Le potentiel zêta du PD-PTLP était de 22,1 ± 1,21 mV, ce qui ne permettra aucune liaison non spécifique aux composants sanguins. Le PD-PTLP a présenté une efficacité de piégeage élevée d'environ ~ 95 % pour les deux médicaments (PTX et TQD). Le PD-PTLP a également présenté une charge médicamenteuse élevée de 12 à 14 % p/p pour la PTX et la TQD, respectivement (Fig. 2b).

Caractérisation physico-chimique du nanoliposome conjugué à PD-L1 chargé de PTX/TQD. un Analyse morphologique du PD-PTLP au microscope électronique à transmission (MET). b Capacité de charge médicamenteuse du PD-PTLP. c Libération in vitro de PTX et de TQD à partir de PD-PTLP dans des conditions de tampon pH 7,4 et de tampon pH 5,0 à 37 °C. **p <0,01 est la différence statistique de libération de médicament entre les tampons pH 7,4 et pH 5,0

Libération de médicaments in vitro

Le comportement de libération de PTX et de TQD à partir de PD-PTLP a été étudié dans des conditions de pH 7,4 et de pH 5,0 à 37 °C. Comme le montre la figure 2c, une libération contrôlée de médicaments (PTX et TQD) a été observée à partir du PD-PTLP tout au long de la période d'étude (72 h). La libération de médicament de la bicouche épaisse de nanoliposome pourrait être responsable de la libération lente et prolongée de deux médicaments du PD-PTLP. Il faut noter qu'aucune différence significative n'a été observée dans le schéma de libération de PTX et de TQD à pH 7,4 et pH 5,0. À un moment plus long, une différence significative de libération a été observée dans différentes conditions de pH. Il convient de noter qu'aucun élément sensible au pH n'a été ajouté dans le nanoliposome et qu'une libération plus élevée de médicament dans des conditions acides pourrait être attribuée à la diffusion plus élevée à un pH inférieur. Par exemple, ~ 85% de PTX libéré dans des conditions de pH 5,0 par rapport à ~ 55% de libération de médicament dans un environnement de pH physiologique. Un schéma similaire de libération rapide de petites molécules dans des conditions acides et de libération plus lente dans des conditions de pH basique a été démontré par d'autres chercheurs. Néanmoins, une libération de médicament relativement faible dans des conditions de pH 7,4 pourrait réduire les effets secondaires systémiques inutiles et prolonger la circulation systémique, tandis qu'une libération de médicament plus élevée à pH 5,0 pourrait bénéficier d'une efficacité thérapeutique plus élevée dans les tissus tumoraux.

Analyse de l'absorption cellulaire in vitro

L'efficacité de livraison de nanoliposomes ciblés (PD-PTLP) et non ciblés (PTLP) a été testée dans SGC7901/ADR. L'absorption cellulaire a été évaluée en utilisant la rhodamine-B comme traqueur de fluorescence. La rhodamine-B est le fluorophore couramment utilisé sans interactions biologiques cellulaires. Le noyau a été coloré avec du DAPI bleu et la couleur rouge provenait des nanoparticules. Les données du CLSM révèlent clairement que le PD-PTLP présentait une forte fluorescence rouge dans les cellules cancéreuses par rapport à celle du PTLP non ciblé. Une fluorescence rouge plus élevée dans les cellules cancéreuses traitées par PD-PTLP attribuée à l'internalisation plus élevée des nanoparticules (Fig. 3a). Le résultat des données CLSM indique que le récepteur PD-L1 exprimé sur la membrane cellulaire a été reconnu par l'Acm PD-L1 conjugué à la surface des nanoliposomes. Un mécanisme d'absorption non spécifique ou passif était évident dans les cellules cancéreuses traitées par PTLP. La spécificité de la cible PD-L1 a été confirmée par l'expérience de prétraitement avec mAb PD-L1. Les cellules SGC7901/ADR ont été prétraitées avec du mAb PD-L1 et incubées pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été exposées avec du PD-PTLP et du PTLP et incubées pendant 3 h. Comme indiqué (Fig. 3b), les cellules prétraitées avec l'Acm PD-L1 ont montré une fluorescence rouge significativement inférieure à celle des cellules non traitées, ce qui indique que l'Acm PD-L1 a été consommé par les récepteurs exprimés en surface et qu'aucun récepteur supplémentaire n'était disponible pour la liaison. et l'internalisation entraînant moins d'absorption de nanoparticules et moins d'internalisation. Ces CLSM ont clairement révélé la spécificité de ciblage de PD-PTLP dans les cellules cancéreuses SGC7901/ADR.

un Images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) de cellules SGC7901/ADR après incubation avec PTLP et PD-PTLP pendant 3 h ; Images CLSM de cellules SGC7901/ADR prétraitées avec/sans mAb PD-L1 après incubation avec PD-PTLP pendant 3 h. La rhodamine B a été utilisée comme traceur fluorescent et le DAPI a été utilisé pour colorer le noyau des cellules cancéreuses

Les nanoliposomes à double dose de médicament améliorent l'effet antiprolifératif

Pour la thérapie combinée, différents ratios de deux médicaments (PTX et TQD) ont été utilisés pour établir l'étendue de l'effet synergique ou additif sur les cellules cancéreuses gastriques résistantes. Pour calculer l'isobologramme et l'indice de combinaison (IC), le logiciel CalcuSyn (Biosoft, Version 2.1) a été utilisé. Le tracé de l'isobologramme pourrait être expliqué sur la base de l'équation de Chou-Talalay. Les valeurs d'IC ​​sont caractérisées par une synergie (CI < 0,9), une addition (CI =1) et une antagonisme (CI> 1). Comme indiqué, tous les rapports de combinaison de PTX et de TQD ont révélé une valeur d'IC ​​< 1 signifiant un mécanisme d'action synergique (Fig. 4a). Pour être précis, la synergie la plus élevée a été observée à une fraction pondérale de 1/0,5 (P/T) tandis que le niveau de synergie diminuait avec l'augmentation de la fraction pondérale TQD indiquant l'importance de la présence de deux médicaments dans la fraction pondérale spécifique. Une concentration trop faible et trop élevée de TQD dans un régime combiné n'a pas donné le meilleur effet synergique. Pour toutes les expériences in vitro, nous avons utilisé le rapport P/T =1/0,5 dans l'étude.

un Indice de combinaison (IC) de différentes fractions pondérales de PTX et TQD dans les cellules SGC7901/ADR. L'indice de combinaison a été évalué par Calcusyn ^TM Logiciel. b Viabilités cellulaires in vitro des cellules SGC7901/ADR après traitement avec diverses concentrations de PTX, TQD, PTLP et PD-PTLP libres pendant une période d'incubation de 24 h. c Analyse par transfert Western de l'expression de la p-gp dans les cellules SGC7901/ADR après traitement avec les formulations respectives. **p <0,01 et ****p <0,001 est la différence statistique entre le groupe PTX libre et le groupe traité PD-PTLP

L'effet cytotoxique in vitro des médicaments individuels ainsi que des médicaments combinés a été déterminé par le protocole MTT après 24 h d'incubation. Comme le montre la figure 4b, le NP vierge n'a eu aucun effet sur la viabilité de la cellule, ce qui exclut la possibilité d'une interférence dans les résultats finaux. La monothérapie avec PTX et TQD a cependant montré un effet cytotoxique dépendant de la concentration dans les cellules cancéreuses gastriques résistantes; il n'a pas atteint une efficacité thérapeutique appréciable. L'effet anti-prolifératif de l'agent unique a été remarquablement amélioré lorsqu'il est combiné avec le deuxième médicament encapsulé dans un nanoliposome. La combinaison de PTX et de TQD a entraîné un effet synergique évident par rapport à celui de médicaments individuels seuls. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

un Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. b Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. ***p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0,001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ , and ~ 650 mm ³ , respectivement. Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0,001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; un tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. *p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; un mice body weight analysis; b , c blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. *p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

Abréviations

EPR :

Enhanced permeation and retention effect

PD-PTLP:

PD-L1 mAb-conjugated PTX and TQD-loaded nanoliposomes

P-gp:

P-glycoprotein

PTLP:

PTX and TQD-loaded nanoliposomes

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar