Approche facile pour préparer des microsphères rGO@Fe3O4 pour la thérapie combinée chimio-photothermique ciblée magnétiquement et sensible au NIR

Introduction

Le cancer est l'une des maladies les plus malignes au monde et l'une des principales causes de décès chez l'homme [1, 2]. Bien que la chimiothérapie soit couramment utilisée dans le traitement du cancer en clinique, plusieurs problèmes clés, notamment une faible efficacité thérapeutique et des effets secondaires importants, limitent sérieusement son application [3]. Les systèmes d'administration de médicaments (DDS) ont montré de grands avantages dans l'amélioration de la solubilité, de la biodisponibilité et de l'accumulation tumorale des médicaments, qui devraient améliorer considérablement leur efficacité antitumorale [4]. Récemment, les microsphères creuses utilisées comme systèmes d'administration de médicaments ont attiré une attention croissante en raison de leur grande surface et de leurs structures poreuses abondantes [5,6,7,8], et plusieurs matériaux de microsphères creuses ont été conçus avec des technologies innovantes [9,10,11 ,12,13].

L'oxyde de graphène (GO), un nouveau type de matériau inorganique libre-métallique, a été largement étudié dans l'administration de médicaments en raison de ses caractéristiques uniques, telles qu'une bonne biocompatibilité, un faible coût et une préparation simple [14,15,16,17]. Notamment, l'oxyde de graphène peut transformer efficacement la lumière en chaleur lorsqu'il est déclenché par une irradiation NIR [18,19,20], devenant une stratégie prometteuse pour améliorer l'effet de la thérapie photothermique du cancer. Le groupe Chen a rapporté que GO pourrait délivrer les médicaments anticancéreux par interaction non covalente telle que l'empilement π-π, la liaison hydrogène et l'adsorption électrostatique [21]. Cependant, la nanofeuillet d'oxyde de graphène 2D a tendance à s'agglomérer en raison de la grande surface spécifique ainsi que des liaisons de van der Waals entre les couches de graphène [17, 22], entraînant une faible solubilité dans l'eau et une diminution de la capacité de chargement du médicament. Certaines stratégies ont été explorées pour pallier ces lacunes. Le groupe Tsukruk a développé des capsules creuses de graphène en utilisant la technologie d'assemblage couche par couche [23], qui a montré une charge de médicament extrêmement élevée par rapport aux autres matériaux GO. Cela pourrait être dû à la surface spécifique élevée et au grand volume de pores de la capsule creuse stabilisée par GO. Cependant, peu de rapports ont fait référence à l'étude de GO avec une structure de pores connectés en trois dimensions pour l'administration de médicaments.

Bien que de nombreux systèmes d'administration de médicaments aient présenté une capacité de charge médicamenteuse supérieure et un comportement de libération contrôlée de médicament, leurs recherches précliniques et leurs applications sont également limitées en raison d'une spécificité insuffisante pour cibler les tissus tumoraux [24]. Parmi les divers systèmes d'administration de cibles médicamenteuses, Fe₃ O₄ , un matériau à cible magnétique est largement utilisé dans le traitement du cancer pour ses réponses magnétiques élevées, sa qualité stable et sa facilité de réalisation [25,26,27,28,29]. Le groupe Ni a développé un Fe₃ O₄ @SiO₂ nanoparticules à structure noyau-enveloppe avec propriété superparamagnétique pour le ciblage magnétique des tumeurs [30]. De plus, Fe₃ O₄ Les nanoparticules GO ancrées ont été bien étudiées en association avec la délivrance de cibles magnétiques et la thérapie photothermique [31,32,33,34].

Dans la présente étude, nous rapportons une stratégie avancée pour développer une plate-forme DDS comprenant des microsphères creuses rGO décorées d'oxyde de fer (rGO@Fe₃ O₄ ) pour la thérapie photothermique (PTT) ciblée magnétiquement et déclenchée par NIR. Comme illustré dans le schéma 1, rGO@Fe₃ O₄ des microsphères creuses ont été préparées en trois étapes. Premièrement, rGO-SiO₂ est synthétisé par la méthode de séchage par pulvérisation en utilisant SiO₂ comme modèle puis des microsphères creuses rGO ont été obtenues en enlevant SiO₂ avec gravure HF. Ensuite, Fe₃ O₄ les nanoparticules ont été ancrées sur des microsphères creuses rGO pour construire rGO@Fe₃ O₄ microsphères. Dans ce système, rGO sert d'agent PTT déclenché par NIR et Fe₃ O₄ peut offrir la propriété de ciblage magnétique vers la cellule Hela. Doxorubicine (DOX), microsphères encapsulées (rGO@Fe₃ O₄ /DOX) basé sur l'adsorption des pores et l'empilement π-π, devrait présenter une capacité de charge de médicament ultra-élevée et un comportement de libération de médicament sensible au pH, et peut considérablement améliorer l'effet anticancéreux pour la combinaison de la chimiothérapie photothermique.

Illustration schématique de rGO@Fe₃ O₄ /Microsphères DOX et la combinaison photothermique-chimiothérapie pour l'inhibition tumorale

Matériaux et méthodes

Matériaux

Chlorure de fer hexahydraté (FeCl₃ ·H₂ O), hydroxyde de sodium (NaOH) et sulfate ferreux heptahydraté (FeSO₄ ·7H₂ O) ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Les cellules Hela proviennent du Tianjin Cancer Hospital. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)_, Le chlorhydrate de doxorubicine (DOX·HCl), le milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM), le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) ont été achetés auprès de Solarbio Science and Technology Co. , Ltd. SiO₂ (~ 300  nm) a été acheté auprès de Shanghai Yuanjiang Chemical Company. La solution d'eau déionisée d'oxyde de graphène (2 mg/ml) était un produit disponible dans le commerce de la société Nanjing Xianfeng.

Préparations de rGO@Fe₃ O₄ Microsphères

Des microsphères creuses de graphène ont été préparées via une méthode de séchage par atomisation en utilisant SiO₂ (300 nm) comme modèle. En bref, 100 mL de SiO₂ suspension liquide (50 mg mL ⁻¹ ) a été lentement déposé dans 300 mL de solution aqueuse GO (2 mg mL ⁻¹ ) sous agitation drastique, la solution mélangée a été séchée par pulvérisation à 200°C dans une unité de séchage par pulvérisation. Par la suite, le produit a été maintenu à 300 °C sous protection Ar pendant 2 h et rGO-SiO₂ a été obtenu. Pour supprimer SiO₂ , rGO-SiO₂ a été placé dans une solution HF (10%) pendant 48h à 60°C. Le produit solide a été lavé plusieurs fois et séché dans une étuve de séchage sous vide à 60°C pendant 12 h, rGO a finalement été obtenu avec un rendement de 75%.

Le rGO@Fe₃ O₄ des nanoparticules ont été préparées par la méthode de coprécipitation. Dans un processus typique pour la synthèse de rGO@Fe₃ O₄ nanoparticules, 0,27 g FeCl₃ ·H₂ O, 0,28 g FeSO₄ ·7H₂ O et 0,1 g de microsphères creuses de rGO ont été dissous dans 10 mL d'eau déminéralisée et agités pendant 30 min à 50°C. Ensuite, 60 mL de NaOH (0,15 mol L ⁻¹ ) a été ajouté lentement sous agitation continue à 50 °C pendant 12 h. Les produits ont finalement été séparés magnétiquement et lavés à plusieurs reprises avec de l'eau déminéralisée et de l'éthanol plusieurs fois suivi d'un séchage à 60 °C sous vide pendant 12 h.

Caractérisation structurelle

La taille et la morphologie de l'échantillon ont été analysées en utilisant une microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM, Hitachi, S-4800) et une microscopie électronique à transmission (TEM, JEM2100F, JEOL). La composition des produits a été analysée via un système de diffraction des rayons X (XRD, D8 Focus, rayonnement Cu Ka, Bruker, Allemagne) à une vitesse de balayage de 12°/min allant de 10 à 80°. De plus, une spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) a été réalisée sur un spectromètre XPS (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, America). Les FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) ont été enregistrés de 500 à 4000 cm ⁻¹ à une résolution de 4 cm ⁻¹ . Les mesures magnétiques ont été effectuées à l'aide d'un magnétomètre supraconducteur à interférence quantique (SQUID, Quantum Design MPMS) à température ambiante (300 K). Les spectres Raman ont été collectés à l'aide d'un spectroscope Raman (Renishaw, inVia Reflex, Angleterre) avec un laser de longueur d'onde de 532 nm. La teneur en rGO a été évaluée à l'aide d'un analyseur thermogravimétrique (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). La surface spécifique a été mesurée en utilisant la technique de Brunauer-Emmett-Teller (BET). Les spectres UV-Vis ont été enregistrés à l'aide d'un analyseur d'acide nucléique/protéine Beckman DU 800 (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).

Chargement et libération DOX

La DOX, un médicament chimiothérapeutique modèle, la doxorubicine, a été encapsulée dans les noyaux de rGO@Fe₃ O₄ pour évaluer les comportements de chargement et de libération des médicaments anticancéreux in vitro. rGO@Fe₃ O₄ /DOX a été préparé selon la référence précédente. En bref, 10 mL (0,2 mg mL ⁻¹ ) de solution aqueuse de DOX a été ajouté à 10 mg de rGO@Fe₃ O₄ solution, le mélange a été homogénéisé par ultrasons pour assurer l'absence de précipitation significative. Ensuite, le mélange a été équilibré sur un agitateur alternatif (SK-O180-Pro) à une vitesse de 150 rpm pendant 24 h. Après centrifugation à 6000 rpm pendant 10 min, la DOX non chargée a été retirée, le surnageant de rGO@Fe₃ O₄ La /DOX a été mesurée via un spectrophotomètre UV-Vis pour déterminer la quantité de DOX chargée. La DO du DOX a été enregistrée à 490 nm, les équations suivantes ont été utilisées pour calculer l'efficacité de chargement (LE) et la capacité de chargement (LC) du DOX :

Les études de libération in vitro de la DOX ont été réalisées en mettant rGO@Fe₃ O₄ /DOX (10 mg) dans un sac de dialyse (MWCO =1000) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 30 mL) à pH  5,4, 6,5 ou 7,4, en le plaçant dans un bain-marie à 37 °C et en agitant à 80 rpm. À des intervalles prédéterminés, 3 mL du milieu de libération ont été collectés et la quantité de DOX libérée a été calculée en mesurant l'UV-Vis à 480 nm.

Effet photothermique déclenché par NIR de rGO@Fe₃ O₄ Microsphères

Pour surveiller l'influence de rGO@Fe₃ O₄ dose sur l'effet photothermique déclenché par le NIR, le rGO@Fe₃ O₄ solutions avec différentes concentrations (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 mg mL ⁻¹ ) ont été irradiés avec un laser NIR à 2 W cm ⁻² pendant 5 min, respectivement. De plus, l'influence de l'énergie NIR sur l'effet photothermique a été évaluée en irradiant rGO@Fe₃ O₄ (0,25 mg mL ⁻¹ ) avec des puissances différentes (1 W cm ⁻² , 1,5 W cm ⁻² , 2 W cm ⁻² ) pendant 5 min. La température en temps réel a été mesurée à l'aide d'une caméra thermique infrarouge FLIR I5.

Captation in vitro

Les cellules Hela ont été ensemencées dans 35 mm ² plats confocaux à une densité de 1 × 10 ⁵ cellules/puits. Après incubation pendant 24 h dans un incubateur (5% CO₂ , 37 °C), le milieu a été retiré, et le milieu frais contenant rGO@Fe₃ O₄ /Microsphères DOX et rGO@Fe₃ O₄ /DOX avec aimant ont été ajoutés et cultivés pendant 5  h supplémentaires. Le rGO@Fe₃ O₄ /La concentration de DOX était de 0,1 mg mL ⁻¹ . Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS froid (pH =7,4) et fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Allemagne).

Tests de viabilité cellulaire

La cytotoxicité de ces microsphères a été évaluée par un dosage CCK-8 après traitement NIR. Les cellules HeLa ont été ensemencées sur des plaques 96 puits (5 × 10 ³ cellules/puits) dans 100 μL de milieu et cultivé dans 5% CO₂ à 37 °C pendant 24 h. Pour l'évaluation de la biocompatibilité, rGO@Fe₃ O₄ ont été ajoutés au puits avec une plage de concentration de 0,01 à 0,2 mg mL ⁻¹ ; pour le groupe de thérapie photothermique unique, rGO@Fe₃ O₄ a été ajouté avec une plage de concentration de 0,01 à 0,2 mg mL ⁻¹ , et en appliquant une irradiation lumineuse NIR pendant 10 min (2 W cm ⁻² , 808  nm); pour le groupe combiné photothermo-chimiothérapie, rGO@Fe₃ O₄ /DOX a été ajouté avec une plage de concentration de rGO@Fe₃ O₄ /DOX de 0,01 à 0,2 mg mL ⁻¹ , et en appliquant un éclairage NIR pendant 10 min (2 W cm ⁻² ,808 nm). Les cellules ont été incubées pendant 24h ou 48h. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées dans 100 L de milieu DMEM contenant 10 L de solution de CCK-8 pendant 40 min supplémentaires. La viabilité a été détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 450  nm. Toutes les expériences ont été menées en triple.

Résultats et discussions

Synthèse et caractérisation de la morphologie

La préparation de rGO@Fe₃ O₄ microsphères a été réalisée en trois étapes. Premièrement, rGO-SiO₂ les microsphères ont été synthétisées par séchage par pulvérisation en utilisant SiO₂ comme modèle. La morphologie de rGO-SiO₂ microsphères a été caractérisée par SEM et TEM. Comme le montre la figure 1a, le rGO-SiO₂ les microsphères d'un diamètre de 3  μm présentaient une forme sphérique uniforme et étaient composées de nombreux SiO₂ encombrés nanoparticules (~ 300 nm). Les données MET et le diamètre hydrodynamique mesuré par diffusion dynamique de la lumière ont également confirmé les résultats. (Fig. 1d, g). Ensuite, des microsphères creuses de rGO ont été obtenues en éliminant SiO₂ de rGO-SiO₂ avec chauffage à 300°C et gravure HF. Des pores évidents avec une taille de pores d'environ 300  nm ont pu être observés en raison de SiO₂ dissolution (Fig. 1b, e). Enfin, Fe₃ O₄ en vertu de la capacité de ciblage magnétique a été décoré sur le rGO poreux par la méthode de coprécipitation. L'observation de SEM et MET a illustré que la diminution remarquable de la taille des pores après Fe₃ O₄ chargement a été obtenu, (Fig. 1c, f), fournissant la faisabilité de l'administration du médicament et la libération contrôlée du médicament. Notamment, la taille des particules et la distribution granulométrique hydrodynamique de rGO-SiO₂ , rGO, rGO@Fe₃ O₄ n'ont plus de changements visibles au cours de ces traitements (Fig. 1g, h, i).

Caractérisation morphologique des microsphères. Images SEM de (a ) rGO-SiO₂ , (b ) rGO, (c ) rGO@Fe₃ O₄; Images TEM de (d ) rGO-SiO₂ , (e ) rGO, (f ) rGO@Fe₃ O₄; distribution granulométrique hydrodynamique des échantillons correspondants (g ) rGO-SiO₂ , (h ) rGO, (i ) rGO@Fe₃ O₄

Caractérisation de la structure et de la composition

Pour confirmer davantage la préparation réussie de rGO@Fe₃ O₄ , SEM avec EDS a été utilisé pour étudier la structure et la composition des microsphères. Les images EDS de rGO@Fe₃ O₄ ont été caractérisés en visualisant les électrons dispersés de manière inélastique dans les fenêtres de perte d'énergie pour les éléments O, Fe et C, et les différentes zones de couleur représentent respectivement les emplacements enrichis en O, Fe et C dans des structures réelles. Comme le montrent les figures 2a et b, Fe et O étaient largement distribués dans rGO@Fe₃ O₄ microsphères à haute densité de chargement. La figure 2d a confirmé que le Fe₃ O₄ nanoparticules uniformément dispersées dans le rGO avec un diamètre d'environ 18  nm, entraînant une forte diminution de la taille des pores dans rGO@Fe₃ O₄ microsphères. Le modèle de diffraction électronique de zone sélectionnée (SAED) a en outre vérifié la présence de Fe₃ O₄ dans rGO (Fig. 2e), la résonance caractéristique dans les espacements de face de 2,98  nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm et 1,49  nm attribués aux plans 220, 311, 400, 511 et 440 du cubique à faces centrées phase de Fe₃ O₄ , respectivement. Les pics sont apparus à 220, 311, 400, 511 et 440 correspondant à Fe₃ O₄ ont également été détectés dans les spectres XRD, ce qui était cohérent avec les résultats de la SAED (Fig. 2c). Cependant, il est rapporté que Fe₃ O₄ et γ-Fe₂ O₃ n'a pas pu être distingué par le modèle XRD indépendamment pour le même emplacement de pics caractéristiques [35]. Le résultat XPS a montré que les pics prédominants à 725,9/724,5 eV et 714,1/711,0 eV, correspondant à Fe2p_1/2 et Fe 2p_3/2 du rGO@Fe₃ O₄ (Fig. 2g, h), respectivement, indiquant la coexistence de Fe ³⁺ et Fe ²⁺ en Fe₃ O₄ [36]. Une analyse thermogravimétrique (TGA) a été effectuée pour surveiller le comportement de dégradation thermique de rGO dans rGO@Fe₃ O₄ microsphères en chauffant l'échantillon à 800°C et en le refroidissant à 100°C dans une atmosphère d'air (Fig. 2f). La courbe de perte de masse a montré deux régions de perte de masse distinctes comprenant la région de déshydratation (40-300 °C) et la région de dévolatilisation (300-800 °C) de rGO dans rGO@Fe₃ O₄ , la teneur en carbone calculée à partir de l'échantillon était de 25,6 % en poids.

Caractérisation de la structure et de la composition de rGO@Fe3O4. (un , b ) SEM avec images cartographiques EDS de rGO@Fe₃ O₄ microsphères :éléments C, Fe et O; (c ) Modèles XRD de rGO-SiO₂ , rGO et rGO@Fe₃ O₄ microsphères; (d , e ) Images SEAD de rGO@Fe₃ O₄ microsphères; (f ) Courbes TG de rGO@Fe₃ O₄ microsphères; (g , h ) Spectres XPS de rGO@Fe₃ O₄ microsphères; (je ) Boucles d'hystérésis magnétique du Fe₃ O₄ et rGO@Fe₃ O₄ microsphères (l'encart du haut montre les valeurs de champ coercitif (Hc) des échantillons, et l'encart du bas montre leurs suspensions avant et après la séparation magnétique par un aimant externe)

Les propriétés magnétiques de rGO@Fe₃ O₄ les microsphères ont été étudiées à l'aide d'un dispositif d'interférence quantique supraconducteur. Le champ magnétique a été conduit avec une plage de balayage de -20 000 à 20 000  Oe à température ambiante. La figure 2i montre la valeur d'aimantation à saturation (Ms) et la valeur du champ coercitif (Hc) de Fe₃ O₄ sont 66.6 emu g ⁻¹ et 9,3 Oe. Après avoir chargé Fe₃ O₄ sur rGO, la valeur Ms et la valeur Hc du rGO@Fe₃ O₄ microsphères réduites à 33,9  emu g ⁻¹ et 7,44 Oe. La diminution remarquable de la saturation magnétique peut être due aux propriétés diamagnétiques de rGO dans rGO@Fe₃ O₄ microsphères. De plus, la capacité d'agglomération sélective de rGO@Fe₃ O₄ microsphères a été réalisée intuitivement par une expérience de séparation magnétique. Les suspensions du Fe₃ O₄ et rGO@Fe₃ O₄ les microsphères ont été placées dans le flacon avec un aimant externe pendant 2 min, les suspensions peuvent être concentrées du côté de l'aimant et la solution aqueuse est devenue transparente. Lorsque l'aimant a été retiré, le rGO@Fe₃ O₄ les microsphères ont été à nouveau dispersées uniformément après agitation lente, indiquant que rGO@Fe₃ O₄ des microsphères ayant le mérite d'une bonne capacité de dispersion dans l'eau. L'excellente capacité de dispersion dans l'eau et la propriété de réponse magnétique ont ouvert la voie à l'application magnétique ciblée de rGO@Fe₃ O₄ en tant que médicament dans le traitement du cancer.

Analyse des effets photothermiques

Compte tenu de la pénétration plus profonde dans les tissus et de moins de dommages aux tissus environnants du NIR, la thérapie photothermique sensible au NIR a souvent été utilisée pour le traitement des tumeurs. Par conséquent, le comportement de transformation photothermique de rGO@Fe₃ O₄ des solutions aqueuses à différentes concentrations et différentes densités de puissance ont été enregistrées sous irradiation laser NIR à 808  nm pendant 5 min. La figure 3a, b a montré que l'augmentation de température de rGO@Fe₃ O₄ dépend fortement de la concentration et de la densité de puissance laser. Lorsque la concentration des microsphères atteignait 1 mg mL ⁻¹ , la température est passée de 27,9 à 70,3 °C sous irradiation laser NIR pendant 5 min à 2 W cm ⁻² , tandis que la température du groupe PBS vient de passer de 31,7 à 36,2 °C. L'efficacité de conversion photothermique élevée de rGO@Fe₃ O₄ aura un grand potentiel pour la thérapie photothermique tumorale selon un rapport précédent selon lequel la dégénérescence des protéines et les dommages à l'ADN dans la cellule se produiront (se sont produits) lors d'une exposition à 50 ° C pendant 4 à 6 min [21, 37]. Pour afficher intuitivement le comportement de transformation photothermique de rGO@Fe₃ O₄ , une thermographie IR a été réalisée et les résultats ont été présentés sur la figure 4c. Le rGO@Fe₃ O₄ solution avec la concentration de 1 mg mL ⁻¹ a été rapidement augmenté à 70,3 °C après irradiation NIR pendant 5 min, tandis que le groupe eau n'a pas de changements évidents, ce qui est cohérent avec les résultats de la thermométrie. De plus, la stabilité photothermique du rGO@Fe₃ O₄ a été étudiée en effectuant une procédure d'activation/désactivation du laser avec un laser de 808 nm à 2 W cm ⁻² pendant six cycles (Fig. 3d). L'augmentation de température identique a été obtenue, indiquant la parfaite stabilité photothermique NIR de rGO@Fe₃ O₄ matériaux composites. Ces résultats ont démontré que rGO@Fe₃ O₄ microsphères très prometteuses en tant qu'agent photothermique pour la thérapie photothermique du cancer.

Effets photothermiques de rGO@Fe3O4. un Changement de température dépendant de la concentration de rGO@Fe₃ O₄ solutions à différentes concentrations (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 mg mL ⁻¹ ) sous irradiation de 808 nm à 2 W cm ⁻² pendant 5 min. b Réponse en température dépendante de la puissance de 0,25  mg mL ⁻¹ rGO@Fe₃ O₄ solution sous l'irradiation d'un laser NIR 808 nm pendant 5 min (1 W cm ⁻² , 1,5 W cm ⁻² , 2 W cm ⁻² ). c Images thermiques infrarouges de rGO@Fe₃ O₄ solution à 0, 1, 2, 3, 4 et 5 min d'intervalle stimulée à 808 nm (2 W cm ⁻² ). d Augmentations de température de rGO@Fe₃ O₄ (0,25 mg mL ⁻¹ ) solution pendant 6 cycles successifs d'activation/désactivation du laser sous irradiation de 808 nm à 2 W cm ⁻²

La surface et la taille des pores des microsphères rGO@Fe3O4, les comportements de chargement et de libération de DOX. un Isothermes d'adsorption-désorption d'azote de rGO@Fe₃ O₄ . b Distribution de la taille des pores de rGO@Fe₃ O₄ . c Spectres FTIR de rGO@Fe₃ O₄ et rGO@Fe₃ O₄ /DOX. d , e Images SEM et cartographie de N, Fe et O de rGO@Fe₃ O₄ /Microsphères DOX. f Courbes cinétiques de libération de médicament obtenues à différentes valeurs de pH de rGO@Fe₃ O₄ microsphères. g Courbes cinétiques de libération de DOX sensibles au NIR

Chargement et libération du médicament

La surface et la taille des pores de rGO@Fe₃ O₄ ont été évalués par des analyses BET et BJH (Fig. 2a, b). N₂ Le type de courbe d'adsorption-désorption était de type IV isotherme, et la surface et la taille des pores étaient de 120,7  m ² g ⁻¹ , 2-8 nm et 1.012 cm ³ g ⁻¹ , respectivement. Les résultats ont montré que rGO@Fe₃ O₄ possédaient des canaux mésoporeux et une distribution de taille de pores moyenne, présentant un grand potentiel pour le chargement de médicaments anti-tumoraux. Ensuite, le rGO@Fe₃ O₄ des microsphères à structure poreuse ont été utilisées pour charger un médicament chimiothérapeutique modèle doxorubicine par simple mélange et légère sonication. L'analyse ATR-FTIR a en outre vérifié l'incorporation stable de DOX dans rGO@Fe₃ O₄ en raison de la résonance caractéristique des groupes -COOH et benzène de DOX à 1726 cm ⁻¹ et 1618 cm ⁻¹ (Fig. 4c). L'observation en microscopie électronique à balayage (MEB) a montré que les nouveaux signaux de N éléments affectés à la DOX se répartissaient uniformément dans la microsphère après le chargement de la DOX (Fig. 4d, e). De plus, l'efficacité de chargement DOX (LE) et la capacité de chargement (LC) de rGO@Fe₃ O₄ /DOX étaient respectivement de 92,15 % et 18,43 %. Les LC remarquablement plus élevées de rGO@Fe₃ O₄ /DOX que de nombreux vecteurs de médicaments peut être à l'origine de surfaces et de tailles de pores extrêmement élevées [19]. Le LE élevé de rGO@Fe₃ O₄ /DOX peut être attribué à deux aspects, l'un est que rGO@Fe₃ O₄ peut interagir avec la DOX par un fort empilement π–π entre les liaisons hybridées sp2 de rGO@Fe₃ O₄ et la partie quinine de DOX [21], et une autre peut être qu'ils peuvent former une liaison hydrogène entre les groupes acide carboxylique (-COOH), hydroxyle (-OH) de rGO@Fe₃ O₄ et l'amine (–NH₂ ), les groupes hydroxyle (-OH) de la DOX. Ensuite, nous avons surveillé le comportement de libération de DOX dans du PBS à pH   7,4, 6,5 et 5,4, pour imiter les environnements extracellulaires des tissus tumoraux et normaux. Comme indiqué sur la figure 4f, la vitesse de libération de DOX a été accélérée lorsque le pH a été ajusté de 7,4 à 5,4, et la libération prolongée de DOX à pH 5,4 peut atteindre 73 % après 98 h de traitement. Par conséquent, le profil de libération cumulée de DOX de rGO@Fe₃ O₄ présentait une manière dépendante du pH. Cette libération accélérée dans des conditions acides pourrait être due à la protonation partielle des groupes hydroxyle et amine de la DOX, entraînant une solubilité plus élevée du médicament et un affaiblissement des liaisons hydrogène entre la DOX et le graphène [38]. En outre, nous avons également étudié le comportement de libération de DOX sensible au NIR in vitro. Comme indiqué sur la figure 4g, la libération de DOX a été accélérée par le rayonnement NIR et le taux de libération de DOX atteignait 85 %. Ce comportement de réponse aux stimuli pH et NIR joue un rôle important dans l'administration efficace du médicament vers le site tumoral.

Captation cellulaire in vitro

Pour vérifier la capacité de ciblage magnétique de Fe₃ O₄ dans rGO@Fe₃ O₄ microsphère, les expériences d'absorption cellulaire avec ou sans traitement par champ magnétique ont été étudiées qualitativement par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Les cellules Hela ont été incubées avec rGO@Fe₃ O₄ /DOX pendant 4 h et les noyaux de Hela ont été colorés par DAPI. Les résultats de la figure 5 ont montré que le point noir correspondant à rGO@Fe₃ O₄ des microsphères et des signaux de fluorescence rouge intracellulaire évidents attribués à la DOX ont été observés dans le rGO@Fe₃ O₄ groupe avec un traitement par champ magnétique. En revanche, il y avait moins de points noirs et une fluorescence DOX plus faible peut être trouvée lorsque rGO@Fe₃ O₄ groupe sans chargement de champ magnétique. L'explication peut être que le point noir attribué à rGO@Fe₃ L'O4 intériorisé dans la cellule pourrait être favorisé par l'aimant. Les résultats indiquent que Fe3O4 dans rGO@Fe₃ O4/DOX pourrait cibler spécifiquement les cellules Hela de manière efficace et améliorer considérablement l'internalisation cellulaire des microsphères, démontrant ainsi la capacité de ciblage magnétique favorable du système d'administration de médicament dans le traitement du cancer.

Évaluation de cibles magnétiques de microsphères rGO@Fe3O4-DOX. Images CLSM de rGO@Fe₃ O₄ /Cellules HeLa incubées par DOX avec et sans aimant (les encarts montrent l'image à fort grossissement)

Analyses de cytotoxicité in vitro

La biocompatibilité de rGO@Fe₃ O₄ a été évalué à l'aide du test CCK-8 sur des cellules Hela. Comme le montre la figure 6a, après incubation avec rGO@Fe₃ O₄ à une large gamme de concentrations différentes, la viabilité cellulaire était également supérieure à 90 %, même à des concentrations élevées allant jusqu'à 200  μg mL ⁻¹ , les résultats ont indiqué que rGO@Fe₃ O₄ présente une biocompatibilité élevée et pourrait servir de plate-forme efficace d'administration de médicaments. L'efficacité de la thérapie photothermique de rGO@Fe₃ O₄ a été étudiée plus avant après incubation avec des cellules Hela pendant 24h et 48h sous irradiation de lumière NIR (laser NIR 808  nm, 10 min). Comme le montre la figure 6b, la phototoxicité était clairement dose-dépendante lors de la stimulation NIR, et la viabilité cellulaire a diminué de 90,37 à 35,52 % à 24 h et de 93,77 à 31,75 % à 48 h, ce qui implique que rGO@Fe₃ O₄ ont une excellente phototoxicité et sont très prometteurs en thérapie photothermique. Estimer l'efficacité thérapeutique synergique de la chimiothérapie photothermique, la cytotoxicité de rGO@Fe₃ O₄ /DOX vers des cellules Hela avec et sans irradiation NIR ont été étudiées. Comme le montrent les figures 6c, d, la viabilité cellulaire a montré une manière dépendante de la concentration et contrôlée dans le temps. Environ 65% et 80% des cellules Hela ont été tuées par rGO@Fe₃ O₄ /DOX sans irradiation NIR et DOX à 24 h, la diminution de la capacité de destruction des tumeurs de rGO@Fe₃ O₄ /DOX par rapport au DOX gratuit peut être dû au comportement de libération retardée de DOX de rGO@Fe₃ O₄ /Microsphères DOX. Après irradiation laser NIR (laser NIR 808 nm, 10 min), rGO@Fe₃ O₄ /DOX avec le groupe laser a tué plus de 86 % des cellules à une dose équivalente de DOX (30  μg mL ⁻¹ ). Des résultats similaires ont pu être observés après le même traitement des cellules pendant 48 h, la diminution de la viabilité cellulaire de la DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX with NIR irradiation group was 80%, 76%, and 90%, respectively, indicating a synergistic effect of the combined photothermal therapy and chemotherapy.

The biocompatibility and the therapeutic efficacy of single photothermal therapy or combined photothermal-chemotherapy. un Cell viability of Hela cells cultured with rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. b Cell viability of Hela cells cultured with or without NIR irradiation at different concentrations of rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. (c , d ) Cell viability of Hela cells cultured with free DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX microspheres for 24 h and 48 h with and without NIR irradiation (808 nm, 2 W cm ⁻² ) (*p <0,05, ***i>p <0.01, ***p <0.001)

Conclusions

In summary, we explored a facile strategy to construct rGO-based drug delivery platform rGO@Fe₃ O₄ /DOX for synergistic photothermal-chemotherapy. rGO@Fe₃ O₄ /DOX microsphere exhibited excellent NIR-triggered PTT effect and perfect NIR photothermal stability. Le Fe₃ O₄ on the microspheres ensured excellent tumor cells targeting ability. DOX could be encapsulated into rGO@Fe₃ O₄ with an ultrahigh drug-loading capacity and a pH-responsive drug release behavior could be simultaneously achieved. In addition, an enhanced antitumor efficiency was achieved when a combination of chemotherapy and photothermal therapy. Therefore, this multifunctional drug delivery platform could be a promising candidate for tumor targeting and combinatorial cancer therapy in the future.

Disponibilité des données et des matériaux

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Abréviations

DDS:

Drug delivery system

NIR :

Proche infrarouge

GO :

Oxyde de graphène

DOX :

Doxorubicine

DMEM :

Dulbecco’s minimum essential medium

DAPI :

4',6-diamidino-2-phenylindole

CCK-8:

Cell counting kit-8

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TEM :

Microscope électronique à transmission

XRD :

X-ray diffraction system

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

TGA :

Thermogravimetric analyzer

LE:

Loading efficiency

LC:

Loading capacity