Nanoparticules d'oxyde de gadolinium fonctionnalisées par l'acide hyaluronique pour la radiothérapie des tumeurs guidée par imagerie par résonance magnétique

Introduction

La radiothérapie a été largement appliquée dans le cancer, ce qui implique des rayons X à haute énergie et le dépôt de doses d'irradiation sur les sites tumoraux en provoquant des dommages des radicaux libres ou des dommages à l'ADN [1,2,3,4]. Cependant, une mauvaise radiosensibilité, une imprécision de localisation tumorale et une mauvaise discrimination entre les lésions et les tissus normaux provoquant des effets secondaires d'irradiation limitent la mise en œuvre clinique de la radiothérapie [5]. Par conséquent, il est important de développer des méthodes pour améliorer la radiosensibilité tumorale tout en minimisant les effets secondaires systémiques. Une combinaison de nanotechnologie et de radiothérapie est une priorité bien établie pour la radiosensibilisation.

Ces dernières années, la nanotechnologie a été considérée comme une stratégie attrayante pour le diagnostic et le traitement du cancer [6,7,8,9,10,11]. L'une des principales fonctions des nanoparticules (NP) est un ciblage précis de la tumeur basé sur l'accumulation sélective de NP dans les tissus tumoraux via un ciblage passif, l'effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR), le ciblage actif et le temps de circulation prolongé [12, 13,14]. Nos travaux antérieurs ont démontré que le dopage des NP de carbone avec des hétéroatomes ajuste efficacement leurs propriétés intrinsèques et introduit des caractéristiques bénéfiques [15,16,17]. Fait intéressant, les NP peuvent être utilisées comme radiosensibilisateurs [18]. Les NP de métaux lourds (avec des éléments Z élevés) (p. Lorsque les rayons X interagissent avec des nanoparticules à Z élevé, des électrons Auger et des photoélectrons, la libération d'électrons secondaires endommage les cellules cancéreuses, augmentant la dose pendant la radiothérapie [20]. À ce jour, les NP à base de gadolinium (GdNP) se sont révélées être des agents de contraste (AC) IRM efficaces [21, 22] et différencient le tissu normal du tissu malade et des lésions de manière non invasive et en temps réel. Ces agents raccourcissent le temps de relaxation longitudinale pour affecter la relaxivité longitudinale r ₁ [23], et leur ciblage inexact entraîne fréquemment des effets secondaires. Il est bien connu que l'acide hyaluronique (HA) est un ligand majeur et un vecteur d'administration de médicaments pour cibler des sites avec des récepteurs HA tels que le déterminant de cluster 44 (CD44) [24,25,26].

Sur la base des résultats d'études précédentes, nous avons utilisé HA comme ligand de ciblage pour fonctionnaliser Gd₂ O₃ NPs à double fonction :IRM efficaces ciblant les tumeurs et radiosensibilisateurs pour surmonter la radiorésistance inhérente et l'imprécision de la localisation tumorale. De plus, HA-Gd₂ O₃ Les NP présentent une relaxivité longitudinale élevée (r ₁ ) en tant qu'agents d'imagerie IRM prometteurs avec une meilleure qualité d'imagerie IRM. Par rapport aux AC actuellement disponibles [27, 28], le résultat HA-Gd₂ O₃ Les NP présentent trois avantages significatifs :tout d'abord, le HA-Gd₂ O₃ Les NP présentent une biocompatibilité favorable en raison de l'utilisation de la matrice extracellulaire naturelle comme précurseurs. Deuxièmement, la fonctionnalisation HA améliore significativement le ciblage tumoral et réduit les effets secondaires. Enfin, le HA-Gd₂ O₃ Les NP possèdent une capacité bifonctionnelle dans le diagnostic et la thérapie. Afin de vérifier l'efficacité et d'explorer le mécanisme d'amélioration de la radiosensibilisation, nous avons évalué l'effet radiosensibilisant de HA-Gd₂ O₃ NPs sur la viabilité des cellules tumorales, le cycle cellulaire et l'apoptose.

Résultats et discussion

Préparation et Caractérisation de HA-Gd₂ O₃ NP

Dans cette étude, HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été préparées avec succès à l'aide d'un processus hydrothermique simple, comme le montre le schéma 1. Les tailles des particules ont été analysées par diffusion dynamique de la lumière, tandis que l'examen morphologique a été réalisé par microscopie électronique à transmission. Comme le montre la figure 1a, HA-Gd₂ O₃ Les NP présentaient une dispersion uniforme et des formes quasi-sphériques discrètes sans agrégation apparente. Les diamètres moyens du HA-Gd₂ O₃ Les NP étaient de 105  nm. Par rapport aux tissus normaux, la perméabilité endothéliale capillaire des tissus tumoraux était augmentée et l'écart endothélial était de 100 à 600  nm [29]. Par conséquent, les NP avec des tailles souhaitables ont été facilement immergées dans les tissus tumoraux, et elles peuvent augmenter considérablement l'efficacité de l'administration passive de médicaments à ciblage.

Synthèse schématique de HA-Gd₂ O₃ NPs de la méthode hydrothermale (A) et des applications biomédicales suivantes (B)

Caractérisation de HA-Gd₂ O₃ NPs. Faible (a ) et élevé (b ) grossissement des images MET. La distribution des diamètres (c ) et des modèles XRD (d ) de HA-Gd₂ O₃ NP

La structure de phase de HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été étudiées par XRD en utilisant la puissance d'oxyde de graphite (GO) comme contrôle. Comme le montre la figure 1d, un pic de diffraction principal (2θ =12,04°) et deux pics mineurs (2θ =29,6°, 42,1°) ont été observés dans le HA-Gd₂ O₃ Diagramme de diffraction NP, qui correspond aux pics caractéristiques du GO (plan 100) et du graphite (plan 002), respectivement. L'espacement du réseau principal de HA-Gd₂ O₃ Les NP ont montré un espacement plus petit (0,73  nm calculé par la formule de Bragg) que l'espacement GO de d ₀₀₁ =0.85 nm, où le décalage vers le haut de la position de crête peut être attribué à la diminution de l'espacement entre les sp ³ couches. Tous les pics de diffraction large ont démontré que HA-Gd₂ O₃ Les NP avaient une structure amorphe, ce qui peut être attribué au carbone hautement désordonné et à la diminution de sp ² (C–C) espacement des couches pendant le processus de carbonisation. Le résultat indiquait en outre HA-Gd₂ O₃ Les NP à faible nature cristalline possédaient une structure multicouche hétérogène, ce qui était cohérent avec nos précédents rapports concernant les points de carbone [30, 31].

Structure chimique et composition de surface de HA-Gd₂ O₃ NP

Groupes fonctionnels de surface et composition de HA-Gd₂ O₃ Les nanoparticules ont été étudiées à l'aide du spectre infrarouge à transformée de Fourier et de la spectroscopie photoélectronique aux rayons X. Comme le montre la figure 2a, le spectre XPS a montré quatre pics typiques à 284,0, 400,0, 530,6 et 1188,5  eV, indiquant que HA-Gd₂ O₃ Les NP étaient principalement composées d'éléments gadolinium, carbone, oxygène et hydrogène. Le spectre haute résolution de Gd_3d (Fig. 2b) a révélé la présence de deux pics forts à 1187,5 eV et 1221 eV, correspondant à un dédoublement spin-orbite de 32 eV, correspondant respectivement au 3d _5/2 et 3d _3/2 niveaux d'énergie de Gd. Ces observations étaient en bon accord avec les rapports précédents de HA-Gd₂ O₃ NPs. Les O (1s ) représenté sur la figure 2c était dominé par un pic majeur positionné à 531,4  eV, qui correspondait à la liaison entre O ²⁻ et Gd ³⁺ . La spectroscopie FITR a été réalisée pour le nu et le HA-Gd₂ O₃ Échantillons NP (Fig. 2d). Pour les échantillons nus, comme le montre la figure 2a, les bandes d'absorption caractéristiques de v _comme O–C–O à 1580 et 1380 cm ⁻¹ a révélé la présence d'un groupe carbonate. Les larges pics à 3340 et 2900 cm ⁻¹ ont été attribuées aux vibrations d'étirement O–H et C–H, respectivement, qui correspondaient à l'eau adsorbée en surface. Pour HA-Gd₂ O₃ NPs, les vibrations d'étirement de COO ⁻ à 1580 et 1380 cm ⁻¹ ont été renforcées, indiquant l'introduction du groupe carboxylique de l'acide hyaluronique. Ces résultats ont révélé que les groupes fonctionnels de HA-Gd₂ O₃ Les NP contenaient principalement de nombreux groupes carbonyle, carboxylate et hydroxyle. La présence de ces groupements fonctionnels localisés à la surface dotée de HA-Gd₂ O₃ NPs avec une excellente dispersibilité dans l'eau. Il est important de noter que l'ion Gd intégré à la surface des NP peut être utile pour l'imagerie par résonance magnétique et la radiosensibilisation, ce qui a considérablement empêché l'ion Gd de fuir dans les environnements environnants.

La structure chimique et la composition du HA-Gd₂ O₃ NPs. un Le spectre XPS à balayage complet de HA-Gd₂ O₃ NPs. b Gd_3d spectre. c O_1S spectre. d Le spectre FTIR de HA-Gd₂ O₃ NP

Biocompatibilité de HA-Gd₂ O₃ NP

Biocompatibilité de HA-Gd₂ O₃ Les NP, en tant qu'agents biomédicaux potentiels, sont essentielles pour leur application biomédicale. Premièrement, la cytotoxicité inhérente du HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été évaluées dans les cellules HepG2 et VSMC à l'aide du test CCK-8. Comme le montrent les Fig. 3a et S. Fig. 1, le HA-Gd₂ O₃ Les NP n'ont pas présenté de cytotoxicité évidente jusqu'à 3 jours et demi. Même à une concentration de 200  μg/mL après un temps d'exposition de 24  h, la viabilité cellulaire était d'environ 90 %. Deuxièmement, l'hémocompatibilité de HA-Gd₂ O₃ Les NP in vivo ont été estimées à l'aide d'un test d'hémolyse. Comme le montre la figure 3b, nous avons observé une hémolyse des globules rouges dans l'eau (contrôle positif). En revanche, aucune hémolyse évidente n'a été observée après HA-Gd₂ O₃ Incubation de NP à différentes concentrations de 0 à 200 μg/mL pendant 2 h, ce qui était similaire aux résultats pour la solution PBS (contrôle négatif). Par rapport au contrôle négatif, le pourcentage d'hémolyse à différentes concentrations de HA-Gd₂ O₃ Les NPs ont été légèrement évaluées sur la base de l'absorbance du surnageant à 541  nm. Les résultats ont montré que les pourcentages d'hémolyse de HA-Gd₂ O₃ Les NP étaient toutes inférieures à 3% dans la concentration étudiée, vérifiant leur hémocompatibilité favorable. Afin d'examiner la toxicité potentielle, HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été injectées par voie intraveineuse à des souris Balb/c (comme on le voit dans S. Fig. 2). Après 1 semaine, ces souris ont été exécutées et la vessie, les reins et la rate ont été récoltés pour une analyse de section pathologique. Comme le montre S. Fig. 2, le résultat des coupes pathologiques a montré qu'il n'y avait pas de lésion observable ou de réponse inflammatoire dans les organes de HA-Gd₂ O₃ Souris traitées au NP. Ces résultats ont clairement indiqué que le HA-Gd₂ tel que synthétisé O₃ Les NP avaient une cytocompatibilité favorable et une bonne hémocompatibilité.

un Effet de HA-Gd₂ O₃ NPs sur la viabilité des cellules HepG2 et VSMC en utilisant le test CCK-8. b Activité hémolytique du HA-Gd₂ O₃ NPs à différentes concentrations (50, 100, 200, 300 et 400  μg/mL). Du PBS et de l'eau ont été utilisés comme contrôle négatif et positif, respectivement

Étude fantôme IRM

Le longitudinal (T ₁ ) temps de relaxation de HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été étudiées in vitro avec le produit de contraste commercial Magnevist (Gd-DTPA) comme contrôle en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate (pH =7,4, 0,2 M). Avec des concentrations croissantes de Gd, l'intensité du signal de T ₁ -le poids des images fantômes a clairement augmenté, indiquant que tous les échantillons pouvaient générer une amélioration du contraste IRM sur T ₁ - séquences pondérées (Fig. 4a). De plus, les tracés de l'intensité du signal en fonction du temps d'inversion ont donné T ₁ -des temps de relaxation de chaque agent de contraste à des concentrations spécifiques. Comme le montre la figure 4b, le r ₁ valeur de HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été mesurés à 6,0 mM ⁻¹ S ⁻¹ , qui était significativement plus élevée que celle de Magnevist (3,86 mM ⁻¹ S ⁻¹ ) dans les mêmes conditions. Le r amélioré ₁ peut être attribué au rayon hydrodynamique et à la surface beaucoup plus élevés de HA-Gd₂ O₃ les IP ; par conséquent, davantage d'atomes de Gd dopés dans le réseau des NP sont devenus accessibles aux molécules d'eau, raccourcissant la relaxation longitudinale et améliorant le r ₁ valeur.

un T₁ images fantômes du HA-Gd₂ O₃ NPs avec différentes concentrations d'ions Gd totaux. b Les tracés correspondants de 1/T₁ contre les concentrations d'ions Gd totaux. c In vivo T₁ Imagerie IRM et analyse de souris après injection intraveineuse de HA-Gd₂ O₃ NPs comme agents de contraste. d Quantification des changements de signal (rapport SNR) dans la vessie et les reins à différents moments après l'administration (n =3). *p <0,05

Imagerie IRM in vivo

Afin de déterminer les applications potentielles in vivo, les performances d'imagerie par résonance magnétique et le devenir circulatoire de HA-Gd₂ O₃ Les NP (10 mg/kg) ont été étudiées à l'aide d'un scanner IRM avec des souris BALB/c normales comme modèle. Par rapport aux images pré-injection (Fig. 4c), les régions les plus claires du rein et de la vessie, comme indiqué par les cercles en pointillés, ont été clairement observées 10 min après l'injection, démontrant que HA-Gd₂ O₃ Les NP pourraient être utilisées en tant que CA pour améliorer le T ₁ relaxation dans ces organes majeurs in vivo. Surtout, l'amélioration du contraste de HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été maintenues à 60  min après l'injection, ce qui était beaucoup plus long que celui des petites molécules du complexe Gd (demi-vie d'environ plusieurs minutes chez les petits animaux) [27], indiquant que HA-Gd₂ O₃ Les NP possédaient des temps de rétention plus longs in vivo que le contraste commercial. Pour analyser quantitativement l'effet de contraste IRM, nous avons calculé le rapport signal sur bruit (SNR) en analysant finement les régions d'intérêt des images IRM et calculé les valeurs de SNR_post /SNR_pré pour représenter le rehaussement relatif du signal (RSE) (Fig. 4d). Les valeurs RSE de HA-Gd₂ O₃ Les NP dans le rein étaient de 1,35, 1,99 et 1,86. De même, les valeurs RSE de HA-Gd₂ O₃ Les NP de la vessie étaient plus élevées que celles du rein (1,29, 3,59 et 2,26). HA-Gd₂ O₃ Les NP de grande taille (plus de 100  nm) présentent des temps de circulation longs, puis peuvent être éliminées par voie biliaire-intestinale selon les résultats précédents [32]. De plus, le temps de circulation prolongé in vivo peut avoir augmenté le ciblage passif dans les tumeurs en améliorant l'effet EPR.

Imagerie des tumeurs

HA-Gd₂ O₃ Les NP avec d'excellentes performances d'imagerie par résonance magnétique et un temps de circulation long offrent une excellente opportunité pour l'imagerie des tumeurs grâce à un effet EPR. Nous avons ainsi établi des modèles de tumeurs hépatiques sous-cutanées pour étudier si les carcinomes hépatocellulaires (CHC) peuvent être détectés par HA-Gd₂ O₃ IRM rehaussée par NP. Après injection intraveineuse du HA-Gd₂ O₃ NPs, nous avons observé que la région tumorale sous-cutanée devient plus brillante que le tissu environnant comme on le voit à la fois par balayage coronal et transversal (Fig. 5a). Le RES de la tumeur sous-cutanée a atteint de façon spectaculaire 1,54 et 1,83 avec une scintigraphie transversale et coronale, respectivement, indiquant l'accumulation effective de l'HA-Gd₂ O₃ NPs dans la région tumorale par l'effet EPR. Ces résultats démontrent que HA-Gd₂ O₃ Les NP sont très sensibles pour la visualisation IRM des tumeurs. De nombreuses études ont montré que le long temps de circulation pourrait favoriser l'efficacité du ciblage passif par le biais de fuites vasculaires des tumeurs solides [33].

T ₁ -IRM pondérée (a ) et l'analyse quantification correspondante (b ) de tumeurs xénogreffes de cancer du foie de souris Heps après injection intraveineuse de HA-Gd₂ O₃ NP

Amélioration de la radiosensibilisation de HA-Gd₂ O₃ NP

Les excellentes performances de HA-Gd₂ O₃ NP en tant que T ₁ agent de contraste nous a incités à déterminer avec précision sa localisation dans la radiosensibilisation des tumeurs. Tout d'abord, si l'augmentation de la dose s'est produite avec ce traitement combiné a été explorée à l'aide d'un test CCK-8. Comme le montre la figure 6a, un seul HA-Gd₂ O₃ Les NP (concentration de 0 à 200  μg/mL) n'ont pas influencé de manière significative la viabilité de HepG-2, mais l'irradiation aux rayons X (plage de 0 à 9 Gy) a réduit la viabilité des cellules de HepG-2 à moins de 70 % à 9 Gy. Surtout, une combinaison d'irradiation aux rayons X avec HA-Gd₂ O₃ Les NP ont considérablement réduit la viabilité des cellules HepG-2 à moins de 50 %, en particulier à une concentration de 200  μg/mL à 9 Gy. Ensuite, un essai clonogénique a été réalisé pour évaluer la viabilité cellulaire des cellules HepG-2 après une combinaison d'irradiation aux rayons X et de HA-Gd₂ O₃ NPs. Comme le montre la figure 6b, un seul HA-Gd₂ O₃ Les NP n'ont eu aucune influence dramatique sur la formation de colonies de cellules HepG-2, mais l'irradiation aux rayons X a diminué la formation de colonies de cellules HepG-2 à 46,7%. Cependant, le traitement par irradiation aux rayons X et HA-Gd₂ O₃ Les NP ont notamment inhibé la viabilité de la formation de colonies cellulaires à 29,8 %. Les images correspondantes ont en outre vérifié la radiosensibilisation de HA-Gd₂ O₃ NPs contre les cellules HepG-2.

L'effet radiosensibilisant du HA-Gd₂ O₃ NP in vitro. un L'effet synergique de HA-Gd₂ O₃ NPs (0 g/mL, 12,5  μg/mL, 25 g/mL, 50 g/mL, 100 g/mL et 200  μg/mL) et rayonnement X (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy et 9 Gy) sur la viabilité des cellules HepG2 en utilisant le test CCK-8. *p <0,05, ***i>p <0,01, la différence était statistiquement significative. b Les tests de survie des colonies de cellules HepG2 traitées par HA-Gd₂ O₃ NPs et rayonnement X et c l'analyse quantitative correspondante des capacités de clonage. d Courbes de croissance du volume tumoral de différents groupes de souris après différents traitements. Groupes :a contrôle, b rayonnement, c HA-Gd₂ O₃ NPs, et d rayonnement + HA-Gd₂ O₃ NPs. e Photos de tumeurs prélevées sur différents groupes de souris en fin de traitement

L'efficacité de la radiothérapie in vitro nous a incités à appliquer HA-Gd₂ O₃ NPs combinées avec l'irradiation pour contrôler la croissance tumorale chez les souris porteuses de tumeurs. Les volumes de tumeurs dans le contrôle et le seul HA-Gd₂ O₃ Les traitements NP ont augmenté rapidement et les deux ont augmenté de 180 %. Par rapport aux traitements d'irradiation unique 58%, HA-Gd₂ O₃ Les NP combinées à l'irradiation ont montré une inhibition tumorale efficace de 38 % après 10 jours d'irradiation (Fig. 6d). La tumeur a été photographiée et les volumes tumoraux moyens dans chaque groupe ont montré que le volume tumoral moyen dans le groupe (a) était le plus élevé tandis que celui du groupe (d) était le plus faible parmi tous les groupes (Fig. 6e). Ces résultats révèlent que le HA-Gd₂ tel que préparé O₃ Les NP sont prometteuses pour l'inhibition de la croissance des tumeurs sous irradiation aux rayons X.

Un test de cytométrie en flux et un test de coloration vivant/mort ont été effectués pour mieux comprendre le mécanisme de radiosensibilisation dans le traitement combiné de HA-Gd₂ O₃ NPs et rayonnement X. Comme le montre la figure 7a, une fluorescence verte intense sans rouge a été observée dans les cellules HepG-2 traitées avec un seul HA-Gd₂ O₃ NPs, qui ont vérifié la viabilité cellulaire élevée. Une petite quantité de fluorescence rouge a été observée après les traitements aux rayons X, indiquant un faible niveau d'apoptose cellulaire. Cependant, une forte fluorescence rouge a été observée après un traitement combiné de HA-Gd₂ O₃ NPs (200 μg/mL) et rayonnement, démontrant que HA-Gd₂ O₃ Les NP pourraient améliorer considérablement l'apoptose cellulaire induite par l'irradiation aux rayons X. Le mécanisme de radiosensibilisation de HA-Gd₂ O₃ Les NPs ont été étudiées plus avant en utilisant la cytométrie en flux. Comme le montre la figure 7b, rayonnement unique et HA-Gd₂ O₃ Les NP ont induit respectivement 27,55 % et 19,12 % d'arrêt de phase G2/M. Cependant, le traitement combiné de HA-Gd₂ O₃ Les NP et les radiations ont notamment augmenté l'arrêt de phase G2/M, allant de 30,89 à 33,27 % de manière dose-dépendante. Pendant ce temps, le traitement combiné a induit la mort cellulaire par apoptose de 10,63 à 22,67 %, comme en témoignent les proportions sous-G1 lorsque le seul HA-Gd₂ O₃ NPs et rayonnement induit 3,02 % et 13,87 %. Pour étudier plus avant le mécanisme possible de la mort cellulaire, une méthode Annexine V-EGFP/PI a été menée par cytométrie en flux. Le signal d'émission d'annexine V-EGFP a été tracé sur le x -axis, tandis que le signal d'émission PI a été tracé sur le y -axe (Fig. 8). Les quantités de cellules nécrosées, de cellules à apoptose précoce, de cellules à apoptose tardive et de cellules vivantes ont été déterminées par le pourcentage d'Annexine V ⁻ /PI ⁺ (Q3), Annexine V ⁺ /PI ⁺ (Q2), et Annexine V ⁻ /PI ⁻ (Q4), respectivement. Le pourcentage d'apoptose des cellules du groupe témoin et du HA-Gd₂ unique O₃ Le groupe NP (100  μg/mL) était inférieur à 5 %, ce qui a entraîné une influence subtile. Par rapport aux groupes de traitement par radiothérapie unique (8,8%), le taux d'apoptose de l'association HA-Gd₂ O₃ Les NP et le rayonnement augmentaient avec la concentration allant de 50 à 200  μg/mL. En particulier, le taux d'apoptose précoce des cellules a évidemment augmenté à 33,2 %, et l'apoptose précoce et tardive a atteint 44,3 % lorsque la concentration est de 200 µg/mL. Généralement, la combinaison de HA-Gd₂ O₃ Les NP et l'irradiation aux rayons X ont eu un effet synergique sur la formation de colonies cellulaires, la viabilité cellulaire d'une manière dose-dépendante et l'effet d'amélioration de la radiosensibilisation. Sur la base de ces résultats, HA-Gd₂ O₃ Les NP peuvent être une alternative efficace pour améliorer la radiosensibilisation en radiothérapie.

Augmentation de la dose de rayonnement de HA-Gd₂ O₃ NPs. un Coloration mort-vivant des cellules HepG2. Vert (coloration au diacétate de fluorescéine) =cellules vivantes, rouge (coloration à l'iodure de propidium) =cellules mortes. Barres d'échelle =200 mm. b La distribution du cycle cellulaire après différents traitements a été analysée en quantifiant la teneur en ADN à l'aide d'un test de cytométrie en flux

Les analyses d'apoptose de HA-Gd₂ O₃ NPs. un Les niveaux d'apoptose des cellules HepG-2 à 24h après le traitement des rayons X. b L'analyse quantitative correspondante

Conclusions

En conclusion, nous avons développé un HA-Gd₂ bifonctionnel O₃ NPs pour une imagerie par résonance magnétique efficace et une radiosensibilisation des tumeurs dans un processus hydrothermal en un seul pot. Après revêtement avec HA, le HA-Gd₂ tel que synthétisé O₃ Les NP présentaient une dispersibilité favorable dans l'eau, une excellente biocompatibilité. Le résultat HA-Gd₂ O₃ Les NP encapsulant les atomes de Gd ont non seulement présenté efficacement une relaxivité longitudinale élevée (r ₁ ) pour l'IRM en tant que T ₁ agent de contraste, mais également amélioré la radiosensibilité des tumeurs en induisant l'apoptose cellulaire et en bloquant le cycle cellulaire en tant que radiosensibilisateur. Ainsi, le roman HA-Gd₂ O₃ Les IP présentent un potentiel prometteur pour le diagnostic des tumeurs et la radiothérapie.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Le diacétate de fluorescéine (FDA) et l'iodure de propidium (PI) ont été acquis auprès de Sigma (New York, NY, USA). GdCl₃ ·6H₂ O, éthylène glycol (99 %) ont été achetés auprès de Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, République populaire de Chine). Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été acheté chez Dojindo (Kumamoto, Japon). NaH₂ Bon de commande₄ , Na₂ HPO₄ , et H₂ SO₄ ont été obtenus auprès du Guangfu Fine Chemical Research Institute (Nankai, Tianjin, République populaire de Chine). Le sérum bovin fœtal et le milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) ont été achetés auprès d'Invitrogen China Limited (Shanghai, République populaire de Chine). Tous les produits chimiques étaient de qualité analytique et ont été utilisés sans autre purification.

Synthèse de HA-Gd₂ O₃ NP

Le HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été préparées à l'aide d'une approche hydrothermale en un seul pot comme suit :Tout d'abord, 0,1 µg de HA a été dissous dans 20 µmL d'eau sous agitation vigoureuse à température ambiante pendant la nuit. Par la suite, 0,1 g de GdCl₃ ·6H₂ O et 0,5 mL de NaOH (1 M) ont été ajoutés, respectivement. Ensuite, le mélange a été agité pendant 5 min supplémentaires pour former une solution transparente homogène et transféré dans un autoclave de 50 ml, scellé et traité hydrothermiquement à 120 °C pendant 6 h. Après avoir été naturellement refroidie à température ambiante, la suspension transparente a été filtrée avec une membrane de 0,22 µm pour éliminer toute agglomération de grande taille. La solution préparée a ensuite été dialysée contre de l'eau pendant 3 jours et demi dans un sac de dialyse avec un poids moléculaire de coupure de 14 kDa. La solution de dialyse a été collectée et lyophilisée en utilisant un lyophilisateur sous vide. Le HA-Gd₂ O₃ Des poudres NP ont ainsi été obtenues et conservées pour une caractérisation ultérieure.

Instrumentation et caractérisations

Les morphologies des HA-Gd₂ O₃ Les nanoparticules ont été examinées par microscopie électronique à transmission à haute résolution sur un microscope JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Japon) sous une tension d'accélération de 200 kV. La composition élémentaire de HA-Gd₂ O₃ Les NP ont été déterminées par des mesures XPS dans un spectromètre photoélectronique MK II, en utilisant Al-Ka (1486,6  eV) comme source de rayons X et un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, États-Unis). La structure cristalline du HA-Gd₂ O₃ Les NPs ont été caractérisées via des diagrammes de diffraction des rayons X (XRD) sur un diffractomètre Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Japon) équipé de Cu Kα (λ =0,15405 nm) de rayonnement à une vitesse de balayage de 4°/min dans la plage de 5 à 80°.

Test de viabilité cellulaire

L'influence de HA-Gd₂ O₃ Les NP sur la viabilité cellulaire ont été étudiées via le test Cell Counting Kit CCK-8 (test CCK-8). HepG2 (hépatocarcinome humain, numéro ATCC :HB-8065) ​​et les CMLV (cellules musculaires lisses vasculaires) ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits à une densité de 3 × 10 ³ cellules/puits et cultivé à 37 °C dans 5% CO₂ incubateur pendant 24 h, puis en utilisant du DMEM contenant différentes concentrations de HA-Gd₂ O₃ NPs (0 g/mL, 25 g/mL, 50 g/mL, 100 g/mL et 200  μg/mL) remplaçant le milieu de croissance. Après incubation pendant encore 4 h, en ajoutant 10 L de solution de CCK-8 dans chaque puits, les cellules ont été incubées pendant 4 h dans un endroit sombre. L'absorbance a été mesurée à 490  nm en utilisant le lecteur de microplaques multimode Synergy HT (Bio Tek, Winooski, VT, USA). Les cellules non traitées (en DMEM) ont été utilisées comme contrôle, et la viabilité cellulaire relative (moyenne SD, n =5) a été exprimé sous la forme Abssamp/Abscontrol × 100 %.

Test d'hémolyse

En bref, 19 à 21 g, âges de souris femelles BALB/c de 6 semaines, ont été aimablement préparés par les règles de gestion des animaux du ministère de la Santé de la République populaire de Chine. Trois millilitres de sang stabilisé avec de l'héparine sodique ont été obtenus en enlevant les globes oculaires. Ensuite, il a été centrifugé pour éliminer le surnageant à 1200 rpm, 15 min selon la littérature. Après cela, lavage de la sédimentation avec du PBS cinq fois pour obtenir les globules rouges de souris (MRBC), puis prélèvement d'environ 3 ml de sang en retirant le globe oculaire, stabilisé avec de l'héparine sodique, centrifugé (1, 200 rpm, 15 min) éliminer le surnageant selon la littérature [27], lavé cinq fois avec du PBS pour obtenir les globules rouges de souris (MRBC). Dilué dix fois avec du PBS, des MRBC de 0,1 mL ont été transférés dans des tubes de 1,5 mL préremplis avec 0,9 mL de PBS contenant différentes concentrations de particules (50-200  μg/mL) de HA-Gd₂ O₃ NPs, 0,9 mL d'eau (comme contrôle positif) et 0,9 mL de PBS (comme contrôle négatif), respectivement. Le mélange a été incubé pendant 2 h à température ambiante après une légère agitation, puis centrifugé à 12 000 rpm pendant 1 min. Enfin, les photographies de tous les échantillons ont été prises et l'absorbance du surnageant (hémoglobine) a été mesurée par un spectrophotomètre UV-2450 UV-Vis. Les pourcentages d'hémolyse de différents échantillons ont été calculés en divisant la différence d'absorbance entre l'échantillon, le contrôle positif et négatif à 541  nm.

MR Phantom Study In Vitro and In Vivo

In vitro and in vivo MR images were acquired on 3 Tesla MRI scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Germany). To study the T ₁ phantom images in vitro, the solution of HA-Gd₂ O₃ NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4). Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd₂ O₃ NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.

Radiosensitization Effect In Vitro

CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd₂ O₃ NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10 ³ cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO₂ incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd₂ O₃ NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.

Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10 ⁴ cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd₂ O₃ NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.

Live-Dead Staining Assay and Flow Cytometry

To study the radiosensitization effect of HA-Gd₂ O₃ NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10 ⁴ cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd₂ O₃ NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd₂ O₃ NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.

Radiosensitization Effect In Vivo

Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10 ⁶ HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm ³ , subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.

Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd₂ O₃ NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b ² , where V (mm ³ ) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0.05, **p <0.001).

Disponibilité des données et des matériaux

The data sets supporting the results of this article are included within the article.