Fullerenol soluble dans l'eau avec dépendance au groupe hydroxyle pour une inactivation photodynamique efficace à deux photons excités des microbes infectieux

Introduction

Diverses molécules photosensibilisantes (PS) ont été synthétisées au cours des dernières décennies [1]. Cependant, les applications cliniques des PS existantes impliquent plusieurs problèmes. La plupart des molécules de PS sont hydrophobes et peuvent facilement s'agréger dans les milieux aqueux, réduisant ainsi leur rendement quantique (QY) [2]. De plus, les PS agrégées ne peuvent pas être simplement injectées par voie intraveineuse. L'accumulation sélective de molécules PS dans les tissus décédés est également nécessaire pour éviter d'endommager les cellules saines. En raison de ces problèmes, le développement d'un support PS efficace reste un défi majeur pour la thérapie photodynamique (PDT). En conséquence, l'intérêt pour l'utilisation de nanoparticules comme vecteurs de PS augmente.

Les progrès de la nanobiotechnologie ont stimulé l'intérêt pour les applications biomédicales d'une nouvelle classe de nanostructures [3,4,5,6,7,8,9,10,11] composées exclusivement d'atomes de carbone, à savoir le fullerène C₆₀ , qui sont des molécules sphéroïdales (0,72 nm de diamètre) non toxiques et possédant des propriétés physico-chimiques uniques. La petite taille du C₆₀ lipophile molécules est responsable de leur compatibilité stérique avec les molécules biologiques et favorise leur intégration dans les régions hydrophobes des membranes [12, 13]. En raison de l'extension π -système conjugué de ses orbitales moléculaires, fullerène C₆₀ absorbe la lumière ultraviolette-visible (UV-vis) et peut générer des espèces réactives de l'oxygène (ROS) avec un QY d'oxygène singulet de près de 100 % (Φ _Δ ). De plus, les propriétés physico-chimiques du fullerène C₆₀ lui permettre de générer des ROS et de servir de PS pour PDT. Les fullerènes peuvent également induire des effets prooxydants, et cela pourrait être dicté par le fullerène utilisé, le type de cellule étudié et la configuration expérimentale [14,15,16,17]. C₆₀ a une solubilité extrêmement faible dans les solutions polaires, ce qui limite considérablement ses applications en médecine. Cependant, en raison de la présence de doubles liaisons, C₆₀ peut être facilement modifié à l'aide de groupes chimiques pour augmenter sa solubilité dans l'eau. Par conséquent, le C₆₀ soluble dans l'eau les dérivés ont augmenté les opportunités pour les applications médicales, y compris la neuroprotection, l'administration de médicaments et de gènes, la photosensibilisation et la biodétection.

La microscopie laser multiphotonique (également connue sous le nom de microscopie laser à deux photons) implique l'utilisation d'une excitation « non linéaire » localisée pour exciter la fluorescence à l'intérieur d'un plan mince à balayage tramé. La microscopie laser à deux photons a été utilisée dans diverses études d'imagerie [18]. Il est généralement couplé à une excitation laser proche infrarouge (NIR) pour capitaliser sur la transmission tissulaire maximale inhérente pour la bio-imagerie ; cela est dû au fait que le NIR présente les avantages d'une légère diffusion, d'une absorption à faible énergie, d'une pénétration optimale de l'irradiation et d'un photoblanchiment réduit des échantillons. Le couplage de la microscopie laser à deux photons avec l'excitation laser NIR est devenu la technique préférée pour la microscopie à fluorescence dans les tissus épais et les échantillons biologiques plus profonds [19, 20] et a été largement appliqué dans d'autres thérapies de photoexcitation [21, 22]. De plus, en raison de sa très faible énergie et de sa courte photoexcitation, la microscopie laser à deux photons est considérée comme une approche alternative pour effectuer la PDT [23]. Bien que certains PS soient toxiques [24, 25], ceux avec un Φ élevé _Δ sont prioritaires pour la conduite de PDT. Un Φ élevé _Δ la valeur est particulièrement souhaitable lorsque des techniques à deux photons sont utilisées pour évaluer les activités moléculaires dans les propriétés photo et mener efficacement des études microscopiques non linéaires ; une telle valeur est souhaitable car le rapport entre l'énergie absorbée et le flux d'énergie d'entrée dans un échantillon est élevé, minimisant ainsi les dommages photoélectriques possibles sur l'échantillon [26]. Cependant, la littérature n'inclut pas les études qui ont envisagé l'utilisation de matériaux avec des propriétés à deux photons pour la PDT. Pour combler cette lacune dans la recherche, la présente étude a appliqué du fullerénol hydroxylé soluble dans l'eau avec une forte capacité de don d'électrons et un grand π -système conjugué pour augmenter l'efficacité du transfert de charge, améliorant ainsi les propriétés à deux photons. Plus précisément, le C₆₀ hydroxylé hydrosoluble (OH)₄₆ a été dérivé et appliqué en tant que PS à deux photons pour une élimination efficace des microbes en utilisant une irradiation laser femtoseconde à ultra basse énergie et seulement 800 balayages sous excitation à deux photons (TPE; longueur d'onde d'excitation, 760  nm). Pour l'irradiation laser femtoseconde à ultra basse énergie, l'énergie était de 211,2  nJ pixel ⁻¹ et la puissance était de 2.112 mW (en ce qui concerne le calcul de la puissance laser après l'objectif, voir la section « Matériaux et méthodes » et la figure 1a, où le x –y point focal et z -La résolution des axes du système laser est d'environ 0,37538 et 0,90159 μm, respectivement) ; de plus, pour le processus de numérisation, le temps d'exposition effectif total était d'environ 3,2621 s, la vitesse de numérisation était de 4,0776 ms scan ⁻¹ , et la zone de numérisation était de 200 × 200  μm ² (voir la section « Matériaux et méthodes » pour les détails concernant le calcul). Le C₆₀ hydroxylé hydrosoluble (OH)₄₆ atteint une élimination de près de 100 % des Escherichia coli (E. coli , une souche bactérienne à Gram négatif). De plus, le C₆₀ hydrosoluble (OH)₄₆ avec une composition plus élevée de groupes hydroxyle présentait des photopropriétés à deux photons supérieures par rapport à celle avec une composition plus faible de groupes hydroxyle sous TPE ; par conséquent, le C₆₀ soluble dans l'eau dérivé (OH)₄₆ peut être considéré comme ayant un potentiel considérable d'utilisation dans la PDT simultanée pour éliminer les microbes malins.

un Selon le z -balayage axial d'un film mince d'or utilisé pour mesurer le signal de génération de deuxième harmonique à différentes positions, le z -La résolution de l'axe du système laser (pleine largeur à mi-hauteur) est d'environ 0,90159 μm (ajustement à l'aide de la fonction gaussienne). b Dépendance de l'intensité TPL à la puissance d'excitation (logarithme) des matériaux et des fluorophores ; Exposition TPE de 704,0 à 2816.0 nJ pixel ⁻¹ pour la Rhodamine B et la fluorescéine, de 1408,0 à 2816.0 nJ pixel ⁻¹ pour C₆₀ soluble dans l'eau (OH)₂₁ fullerenol, et de 1760,0 à 2816.0 nJ pixel ⁻¹ pour C₆₀ soluble dans l'eau (OH)₄₆ fullerénol. Longueur d'onde d'excitation, 760 nm. Dose délivrée :OD₆₀₀ 0,05 de E. coli et 3 μg mL ⁻¹ matériaux. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =6)

Matériaux et méthodes

Préparation et caractérisation des fullerénols hydrosolubles, C₆₀ (OH)₂₁ et C₆₀ (OH)₄₆ [27]

Le fullerène brut a été obtenu commercialement (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), et le C₆₀ (OH)₁₂ précurseur a été produit, comme décrit précédemment. Tout d'abord, une solution de peroxyde d'hydrogène à 30 % (100  mL ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) a été ajoutée au matériau de départ, 0,5 à 1,0  g de C₆₀ (OH)₁₂ , et le mélange a été vigoureusement agité à 60°C sous air. Après refroidissement, un mélange de solvants comprenant du 2-propanol, de l'éther diéthylique et de l'hexane (100 à 200  mL pour chacun ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été ajouté à la solution, qui a ensuite été centrifugée et décantée. Le solide restant a été lavé deux fois avec 200 mL d'éther diéthylique par les procédures de centrifugation et de décantation. Enfin, les produits finaux de C₆₀ soluble dans l'eau (OH)₂₁ et C₆₀ (OH)₄₆ ont été obtenus en séchant le résidu sous vide à température ambiante pendant une nuit, respectivement. Le poids du produit final a été calibré par analyse thermogravimétrique. La morphologie du produit final a été observée en utilisant une microscopie électronique à transmission à haute résolution (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tokyo, Japon) à une résolution d'environ 1,11 ± 0,03 nm et 1,13 ± 0,04 nm pour C₆₀ (OH)₂₁ et C₆₀ (OH)₄₆ , respectivement. La diffusion dynamique de la lumière (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, West Midlands, Royaume-Uni) a également été utilisée pour déterminer la taille des matériaux. Les groupes fonctionnels exposés des matériaux tels que préparés ont d'abord été examinés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). La spectroscopie UV-vis des matériaux a été réalisée à l'aide d'un spectromètre (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tokyo, Japon). La chimie de surface du fullerénol a été examinée par spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS, spectromètre PHI 5000 (VersaProbe, Chanhassen, MN, USA)). Le poids moléculaire du fullerénol a été déterminé à l'aide d'un spectromètre de masse à désorption de champ (FD) (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tokyo, Japon), et le nombre de groupes hydroxyle a été confirmé à 21 et 46 sur la base des résultats, respectivement.

Cultures bactériennes [28]

E. coli , obtenus de notre propre laboratoire ont été cultivés dans de la gélose nutritive de LB (par litre :tryptone 10 g, extrait de levure 5 g, chlorure de sodium 8 g, gélose 15 g et pH réglé à 7,5) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et incubé à 37 °C.

Dosage de biocompatibilité avec la méthode de comptage des unités formatrices de colonies (CFU) [28]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) a été ajouté avec du matériel (0–9 μg mL ⁻¹ ), et incubée pendant 3 h à 37 °C (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S1). Après incubation, le mélange a été centrifugé et les culots de bactéries ont été dilués (DO₆₀₀ ~ 0,05). Un facteur de dilution de 10 ⁻⁵ à 10 ⁻⁸ a ensuite été menée dans les bactéries incubées et étalées sur des plaques de gélose. Les plaques restent dans un incubateur (à 37°C) pendant la nuit. Le nombre de bactéries survivantes a été déterminé et exprimé en pourcentage (%) qui correspondait à l'unité de CFU mL ⁻¹ après incubation. Les données sont des moyennes ± SD (n =6).

ψ _Δ Mesure [29, 30]

Selon l'étude précédente, ψ _Δ peut être obtenu. ψ _Δ les mesures ont été effectuées en D₂ O à 355 nm, en utilisant meso -tétra(4-sulfonatophényl)porphine dichlorhydrate (TSPP ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) comme référence (ψ _Δ =0,64).

Mesure QY de fluorescence [31, 32]

La photoluminescence relative (PL) QY de l'agent de contraste est généralement le rapport des photons émis aux photons absorbés et est donnée comme suit :

où QY_ref =0,28 est le QY de Cy5.5 dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) comme référence, η est l'indice de réfraction de ddH₂ O =1,33 (η _réf de DMSO =1,48), I est l'intensité de fluorescence intégrée et A est l'absorbance à la longueur d'onde d'excitation. L'excitation à un photon (OPE) ou le TPE donne le même QY.

Système optique laser femtoseconde pour les mesures d'absorption à deux photons (TPA) et de luminescence à deux photons (TPL) [23, 28, 33,34,35 ,36,37,38]

Le système optique laser femtoseconde titane-saphir (ti-sa) fait maison (un taux de répétition de 80 MHz ; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) a été utilisé selon les études précédentes.

Mesure TPA

Avec une vitesse de balayage galvanométrique de 2 m ms ⁻¹ , le spectre d'excitation a été mesuré à 720-820 nm avec une puissance d'excitation de 2,8  mW [c'est la puissance avant objectif ; la puissance après objectif (ou sur échantillon) est de 0.9856 mW ou 98.56 nJ pixel ⁻¹ ]. Par conséquent, les spectres relatifs de TPA en fonction de la longueur d'onde d'excitation pour les fullerénols ont été mesurés.

Mesure des spectres TPL

Le matériau a été exposé au TPE du laser femtoseconde à une longueur d'onde d'excitation de 760 nm, une zone de balayage de 200 × 200 μm ² , une fréquence de 10 kHz, un temps d'exposition de 1,638 s/(scan, pixel) =100 μs, 128 × 128 pixels scan ⁻¹ , et une zone de pixels de 1562,5 × 1562,5  nm ² . La zone focale a été calculée comme πd ² /4, où d =0,61 λ/ouverture numérique (NA ) est la pleine largeur à mi-hauteur de la taille de la poutre. Par exemple, au x –y foyer d'axe avec excitation de 760 nm et un objectif à immersion d'huile × 40 avec un NA de 1.3, d =0,61 × 800 nm/1,3 =375,38 nm =0,37538 μm, et le z La résolution de l'axe a été mesurée à 0,90159 μm. Pour une excitation de 760  nm, le temps d'exposition par balayage pour un nanomatériau individuel est exprimé sous la forme (zone focale/zone de pixel) × 100 =4,0776  ms, et le temps d'exposition total t =4,0776 ms × nombre de balayages. Un objectif × 40 à immersion d'huile (NA 1.3) a été utilisé pour collecter les signaux et la plage de détection du photomètre à spectre était de 300 à 695  nm.

De plus, les calculs de puissance laser (mW ou nJ pixel ⁻¹ ) utilisées sur l'échantillon étaient les suivantes. Pour l'objectif à immersion d'huile × 40 (NA 1.3), le taux de transmission à 760  nm en longueur d'onde est d'environ 88 % dans ce système optique, et la puissance laser est passée de la sortie à l'objectif avec seulement 40 % de la puissance de sortie d'origine en raison de la perte de puissance. En conséquence, l'énergie calculée après l'objectif (sur l'échantillon) est P _sortie (mW)*40%*88% =0,352 × P _sortie (mW). Par exemple, P _sortie =2,8 mW, l'énergie calculée après l'objectif (sur l'échantillon) est de 3,0 mW*40%*88% =0,9856 mW. Avec 10 kHz de taux de balayage (chaque impulsion reste 0,1 ms pixel ⁻¹ ), l'énergie calculée sur l'échantillon (J pixel ⁻¹ ) était autour de P _sortie (mW)*40%*88%*0,1 ms =0,0352*P _sortie (J pixel ⁻¹ ). Par exemple, P _sortie =2,8 mW, l'énergie (J pixel ⁻¹ ) sur échantillon =2,8 mW*40%*88%*0,1 ms =0,09856 μJ pixel ⁻¹ =98,56 nJ pixel ⁻¹ . La puissance après l'objectif (sur l'échantillon) a été utilisée et a marqué le débit de ce manuscrit.

Mesure de la section transversale absolue du TPE [24, 36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47, 48]

La section efficace absolue du TPE a été mesurée par le signal de luminescence via système optique laser femtoseconde selon des études antérieures. Le TPL de la fluorescéine et de la rhodamine B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a dû être vérifié. Les résultats sont présentés sur la figure 1b et ont été obtenus en mesurant la dépendance de l'intensité d'émission avec une plage de puissance d'excitation de 704 nJ pixel ⁻¹ (7,04 mW) à 2816 nJ pixel ⁻¹ (28,16 µmW). La dépendance quadratique avec les exposants de 2,03 pour la fluorescéine et de 2,02 pour la rhodamine B a été mesurée pour augmenter la puissance d'excitation afin de déterminer la luminescence du TPE. Selon des études précédentes, les sections efficaces d'action du TPE pour la fluorescéine et la rhodamine B sont de 36,4 et 68,0 GM (1 GM =10 ⁻⁵⁰ cm ⁴ photon ⁻¹ ), respectivement, pour une excitation de 760 nm. Nous avons également fait référence au site Web gratuit http://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, aimablement fourni par le professeur Chris Xu (Cornell University, NY, USA). Les sections efficaces d'action du TPE pour la fluorescéine et la rhodamine B ont été calculées à 36,5 et 66,1  GM, respectivement (tableau 1), ce qui indiquait une erreur de moins de 5 % par rapport à celles du laboratoire du professeur Xu. Dans cette étude, la rhodamine B a été choisie comme référence standard pour déterminer la section efficace et les sections efficaces calculées absolues de TPE pour le C₆₀ soluble dans l'eau. (OH)₂₁ et C₆₀ (OH)₄₆ les fullerénols étaient d'environ 1230,51 GM et 1037,21 GM, respectivement. Les paramètres mesurés pour le calcul des sections efficaces absolues de TPE des échantillons sont présentés dans le tableau 3. Aucune variation d'un lot à l'autre n'a été observée pour les matériaux dans les propriétés à deux photons et la capacité photodynamique à deux photons.

Système optique laser femtoseconde (pour Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) [39, 45]

Le système optique laser ti-sa femtoseconde fait maison (taux de répétition de 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) a été utilisé conformément aux études précédentes. Les données et les paramètres de durée de vie sont générés à l'aide de l'ajustement de l'équation triple exponentielle tout en surveillant l'émission sous TPE (Ex, 760 nm).

Calcul des taux de désintégration radiative et non radiative [46]

PL QY et la durée de vie sont deux paramètres majeurs lors de l'étude des caractéristiques d'émission de colorants fluorescents dans divers environnements. Le QY (Q ) peut être exprimé comme suit :

où Γ est le taux de décroissance radiative, et k est le taux de décroissance non radiative. La durée de vie de la fluorescence est généralement définie comme le temps moyen nécessaire à un électron dans l'état excité pour se désintégrer à l'état fondamental. La durée de vie TPL τ peut également être relatif aux taux de décroissance et est décrit comme suit :

Suite aux équations. (2) et (3), les taux de décroissance radiative et non radiative peuvent être calculés.

Lors de l'absorption d'un photon, l'un des électrons faiblement liés de la molécule fluorescente - un fluorophore - est promu à un niveau d'énergie plus élevé. Le fluorophore est alors dans un état excité, A* . Cet état est métastable; par conséquent, le fluorophore retournera à son état fondamental stable, A . Il peut le faire soit radiativement en émettant un photon de fluorescence hν

ou non radiativement en dissipant l'énergie de l'état excité sous forme de chaleur :

Le dépeuplement de l'état excité dépend des voies de désexcitation disponibles. La fluorescence est la désactivation radiative du niveau d'énergie vibratoire le plus bas du premier état singulet excité électroniquement, S ₁ , retour à l'état fondamental électronique, S ₀ . Les états singulets sont les niveaux d'énergie qui peuvent être peuplés par l'électron faiblement lié sans basculement de spin. Les processus d'absorption et d'émission sont illustrés par un diagramme de niveau d'énergie nommé d'après Aleksander Jablonski.

La durée de vie de fluorescence, τ , est la durée moyenne pendant laquelle un fluorophore reste dans l'état excité électroniquement S ₁ après excitation. τ est défini comme l'inverse de la somme des paramètres de vitesse pour tous les processus de dépeuplement à l'état excité :Eq. (3), où la constante de vitesse non radiative k est la somme de la constante de taux pour la conversion interne k _ic et la constante de vitesse pour le passage intersystème vers l'état triplet k _isc tel que k =k _ic + k _isc . L'émission de fluorescence se produit toujours à partir du niveau vibratoire le plus bas de S ₁ , une règle connue sous le nom de règle de Kasha, indiquant que le fluorophore n'a aucune mémoire de sa voie d'excitation; par exemple, OPE et TPE donnent le même spectre de fluorescence, QY et durée de vie.

Détermination des taux de viabilité des bactéries après exposition au laser [28]

Méthode de comptage des CFU

Bactéries (DO₆₀₀ ~ 0,05) a été ajouté avec du matériel (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) en incubant 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Après incubation, le mélange a été centrifugé et les culots de bactéries ont été dilués (DO₆₀₀ ~ 0,05) et exposé à une puissance TPE de 211,2 nJ pixel ⁻¹ avec 800 scans (environ 3,2621 s de temps d'exposition effectif total ; Ex, 760  nm). Ensuite, un facteur de dilution de 10 ⁻⁵ à 10 ⁻⁸ a ensuite été menée dans les bactéries incubées et étalées sur des plaques de gélose. Les plaques restent dans un incubateur (à 37°C) pendant la nuit. Le nombre de bactéries survivantes a été déterminé et exprimé en pourcentage (%) qui correspondait à l'unité de CFU mL ⁻¹ après incubation. Les données sont des moyennes ± SD (n =6).

Kit LIVE/DEAD

Bactéries (DO₆₀₀ ~ 0,05) a été ajouté avec du matériel (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) en incubant 3 h à 37 °C dans l'obscurité. Après incubation, le mélange a été centrifugé et les culots de bactéries ont été dilués (DO₆₀₀ ~ 0,05) et exposé à une puissance TPE de 211,2 nJ pixel ⁻¹ avec 800 scans (environ 3,2621 s de temps d'exposition effectif total ; Ex, 760  nm). Ensuite, les culots ont été colorés à l'aide d'un LIVE (SYTO 9, tel qu'affiché avec la fluorescence verte)/DEAD ( iodure de propidium, PI, tel qu'affiché avec fluorescence rouge) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) conformément aux instructions. La viabilité des bactéries a été quantifiée pour des tests antimicrobiens, qui ont montré que presque toutes les bactéries traitées aux nanomatériaux étaient mortes après le traitement. Une viabilité similaire a été quantifiée par la méthode de comptage des UFC pour déterminer les effets antibactériens efficaces des matériaux en PDT. Les données sont présentées en moyenne ± SD (n =6).

Détection ROS [23, 29, 34, 35, 49,50,51,52,53,54,55]

Singulet Oxygène ( ¹ O₂ )

(a) Matériel (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) a été traité avec des bactéries (DO₆₀₀ ~ 0,05), après quoi il a été soumis à 3 h d'incubation à 37 °C dans l'obscurité. Par la suite, le mélange a été exposé à une photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 numérisations ; Ex, 760 nm) et finalement mélangé avec le réactif Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) (1 M; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) (Ex/Em :488/525  nm). Un spectromètre à fluorescence a été utilisé pour les mesures. Pour la neutralisation des ROS, le mélange a été mélangé avec 30 ppm d'antioxydant α -tocophérol/linoléate de méthyle (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dans l'obscurité et exposé à une photoexcitation TPE avec le même traitement. (b) Matériel (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) a été traité avec des bactéries (DO₆₀₀ ~ 0,05), après quoi il a été soumis à 3 h d'incubation à 37 °C dans l'obscurité. Par la suite, le mélange a été exposé à une photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 numérisations ; Ex, 760 nm) et enfin mélangé avec 10 μM de trans-1-(2′-méthoxyvinyl)pyrène (t -MVP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)/0,10 M SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (Ex/Em :352/465 nm). Pour la neutralisation des ROS, le mélange a été mélangé avec 30 ppm d'antioxydant α -tocophérol/linoléate de méthyle (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dans l'obscurité. Réaction de t -MVP avec ¹ O₂ produit un intermédiaire dioxétane qui émet une fluorescence pendant qu'il se décompose en 1-pyrènecarboxaldéhyde. De plus, cette sonde fluorescente hautement sélective ne réagit pas avec d'autres espèces d'oxygène activées telles que les radicaux hydroxyle, le superoxyde ou le peroxyde d'hydrogène. Un spectromètre à fluorescence a été utilisé pour les mesures. La neutralisation des ROS a été réalisée avec le même traitement que celui décrit précédemment.

Anion radicalaire superoxyde (O₂ ^.− )

(a) Matériel (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) a été traité avec des bactéries (DO₆₀₀ ~ 0,05), après quoi il a été soumis à 3 h d'incubation à 37 °C dans l'obscurité. Par la suite, le mélange a été exposé à une photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 numérisations ; Ex, 760 nm) et finalement mélangé avec du 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT, 0.45 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , ETATS-UNIS). Le but de ce matériel était qu'il interagissait avec O₂ ^{. −} et produit XTT-formazan, résultant en une forte absorption (470  nm de longueur d'onde). Un spectromètre UV-vis a été utilisé pour surveiller cette absorption. Pour la neutralisation des ROS, le mélange a été mélangé avec 30 ppm d'antioxydant α -tocophérol/linoléate de méthyle (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dans l'obscurité et exposé à une photoexcitation TPE avec le même traitement. (b) Matériel (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) a été traité avec des bactéries (DO₆₀₀ ~ 0,05), après quoi il a été soumis à 3 h d'incubation à 37 °C dans l'obscurité. Par la suite, le mélange a été exposé à une photoexcitation TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 numérisations ; Ex, 760 nm) et enfin mélangé avec du tampon bicarbonate 50 mM (pH 8,60) et du glutathion (γ -l-glutamyl-l-cystéinyl-glycine, GSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)/0,80 mM de tampon bicarbonate (le dosage d'Ellman pour O₂ ^{. −} détection). Par la suite, les expériences suivantes ont été menées selon la procédure d'une étude précédente. La perte de GSH (%) a été calculée comme la différence d'absorbance entre l'échantillon et le contrôle négatif divisée par l'absorbance du contrôle négatif. Le signal du O₂ généré ^{. −} a été obtenu comme décrit dans le calcul précédent. Les données sont des moyennes ± SD (n =6).

Test d'absorption [35]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) ont été incubés avec 3 μg mL ⁻¹ Matériel. L'absorbance d'une quantité de 3 μg mL ⁻¹ matériel a été enregistré par spectroscopie UV-vis (Abs, environ 203  nm). Les matériaux ont été mélangés avec E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) à 37 °C de la 1ère heure à la 10ème heure, respectivement, et centrifugé (1200 rpm) pour éliminer les excès de matériaux et conserver le surnageant et mesurer son absorbance. La différence d'absorbance entre le surnageant collecté et les matériaux d'origine a été estimée, ce qui a donné le pourcentage d'absorption à chaque instant. Les données sont des moyennes ± SD (n =6).

Analyse statistique [56]

La signification statistique a été obtenue par l'analyse de la variance. Le p valeur a été considérée comme statistiquement significative pour tous les traitements.

Résultats et discussion

Caractérisation du fullerénol soluble dans l'eau

C₆₀ hydrosoluble (OH)₄₆ (fullerenol), qui a été déterminé comme circulaire et monodispersé, a été synthétisé conformément à une étude précédente [27]. La taille latérale moyenne du fullerénol était d'environ 1,13 ± 0,04  nm, telle que déterminée à l'aide d'images à faible grossissement (Fig. 2a) et HR-TEM (Fig. 2b). De plus, il a été noté que le fullerénol présentait une cristallinité favorable ainsi qu'un bon espacement de réseau, qui correspondait au d -espacement des franges du treillis du fullerenol {1\( \overline{1} \)00}. Cependant, ces particules pourraient former des agrégats par liaison hydrogène dans une solution aqueuse avec un pH de 7,0. La taille moyenne des agrégats formés était d'environ 130  nm, comme l'a révélé une analyse DLS. De plus, les agrégats sont restés très stables pendant 3 mois dans différents environnements physiologiques, tels qu'une solution aqueuse à pH 7,0, une solution saline tamponnée au phosphate 1 × et un milieu de culture (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S1). Dans le spectre d'absorption UV-vis du fullerénol, des pics d'absorbance ont été observés à environ 216 et 309  nm, et ces pics ont été attribués au π –π * transition des liaisons aromatiques C=C et des n –π * transitions de l'épaule C=O, respectivement. Le π -transition électronique dans le fullerenol contenant de l'oxygène (Fig. 2c), comme cela est typiquement observé pour les dispersions aqueuses, confirmant ainsi la présence du fullerenol. Des caractérisations supplémentaires ont été effectuées à l'aide du FTIR, du XPS et de la spectrométrie de masse pour confirmer les propriétés des matériaux préparés. Le FTIR a été utilisé pour analyser les groupes fonctionnels exposés des matériaux préparés. Les résultats de l'analyse ont révélé les bandes de matériau caractéristiques suivantes :une bande d'étirement C–O à environ 1109 cm ⁻¹ (bande 1), bande d'étirement phénolique C–OH à environ 1271 cm ⁻¹ (bande 2), bande d'étirement alcoolique tertiaire C=O à environ 1422 cm ⁻¹ (bande 3), bande d'étirement C=C à environ 1674 cm ⁻¹ (bande 4), bande d'étirement C=O à environ 1721 cm ⁻¹ (bande 5) et bande d'étirement C–H intermoléculaire à liaison hydrogène et carboxylate O–H à environ 3318 cm ⁻¹ (bande 6). De plus, une bande de CO₂ une interférence a été observée. Ces bandes ont révélé des groupes hydroxyle et carbonyle exposés ainsi que des liaisons aromatiques C=C (Fig. 2d). XPS a été réalisé pour examiner la chimie de surface du fullerénol, qui contient principalement des atomes de carbone en général. Les spectres C(1s) déconvolués du fullerénol ont révélé un cycle non oxygéné (C–C/C=C, 286,1 eV), une liaison C–O (286,9 eV) et une liaison C=O (288,0 eV). De plus, le rapport O(1s)/C(1s) était d'environ 35,8 % (Fig. 2e). Le poids moléculaire du fullerénol a également été déterminé en utilisant la spectrométrie de masse FD (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S2); the number of hydroxyl groups (C–OH) was confirmed to be 46, which was consistent with the atomic ratios and bonding compositions of the fullerenol summarized in Fig. 2. These characterization results confirm the successful synthesis of fullerenol.

Functional characterization of the synthesized water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ fullerenol. un Low-magnified TEM image and b HR-TEM image of a water-soluble fullerenol illustrating the materials {1\( \overline{1} \)00} lattice planes and the mean size of 1.11 ± 0.03 nm with a d -spacing of 0.213 nm. c UV–vis and d FTIR spectra of nanomaterial. e Deconvoluted C(1s) XPS spectra and fitted peaks obtained using Gaussian function:nonoxygenated ring (C–C/C=C), C–O bond, and C=O bond, respectively. The atomic ratio and bonding composition of fullerenol are shown as summarized in the table. The O(1s)/C(1s) atomic ratio is 35.8%

ROS Generation of Water-Soluble Fullerenol Under TPE

A PS absorbs and transfers light energy to other nonabsorbing molecules to generate ROS, which kill targeted cells, damage tumor vasculature, and activate an antitumor immune response. PSs have a particular arrangement of electrons in their molecular orbitals. Similar to nearly all molecules, at ground (singlet) state, PSs have couples of electrons with opposite spins in low-energy molecular orbitals. The absorption of light at an appropriate wavelength lifts an electron to a high-energy orbital without changing its spin. This is a short-lived (nanoseconds) excited singlet (S₁ ) state, and the PS can lose its energy and return to the ground state by emitting light (fluorescence) or heat. Alternatively, intersystem crossing, wherein the spin of the excited electron is inverted, can occur in the S₁ Etat. This electron spin inversion is responsible for the relatively long life (lasting microseconds) of the excited triplet (T₁ ) state. Radiative triplet-to-singlet transitions are inhibited because they require a change in electron spin, which is a slow process. From the T₁ state, the PS can return to the ground state by emitting light (phosphorescence) or transferring energy to another molecule. It can also lose energy through internal conversion or radiationless transitions when colliding with other molecules. The longer the life of the PS in the T₁ state is, the higher are its chances of colliding with another molecule, resulting in ROS production [57,58,59]. The photosensitization of water-soluble fullerenols results in their transition to a long-lived T₁ state and subsequent energy or electron transfer to molecular oxygen, yielding ROS such as ¹ O₂ et O₂ ^{. −} , which have major roles in PDT. Therefore, ¹ O₂ et O₂ ^{. −} produced by water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ must be detected directly using laser irradiation. To detect ¹ O₂ et O₂ ^{. −} formation during PDT, in this study, PDT was initiated by combining excited the triplet water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ , oxygen, and light configured to a suitable wavelength and energy as well as by introducing SOSG, t -MVP, XTT, and GSH reagents [33, 34, 49,50,51]. To exploit the potential bactericidal capability of the materials, a wavelength of approximately 760 nm was determined to be the most efficient for deriving the relative maximum TPA ratio of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ under TPE (Fig. 3a); this is attributable to the interband transitions involved [52]. This wavelength was used in subsequent experiments in this study. The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was photoexcited through TPE at a power of 211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans (Ex, 760 nm; total effective exposure time, ~ 3.2621 s) and delivered dose of 3 or 6 μg mL ⁻¹ (Additional file 1:Table S2). Furthermore, to confirm the involvement of ROS in the PDT effects of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ , α -tocopherol was used for ROS neutralization [49, 53]. The quantity of generated ROS was reduced after the addition of α -tocopherol, but the observed bacterial viability increased as expected. Additionally, the quantity of generated ROS depended on the delivered dose. To prevent ¹ O₂ et O₂ ^{. −} production possibly engendered by inadvertent exposure of water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ to white light—which could have compromised the experiments in this study [60]—subsequent PDT experiments were conducted in the dark. This study focused on the quantities of generated ¹ O₂ et O₂ ^{. −} . The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ exhibited considerable antibacterial effects, demonstrating its potential for application in PDT. Notably, after the same experiment, the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ (Additional file 1:Figs. S3, S4; Fig. 3a) was less effective in forming ¹ O₂ et O₂ ^{. −} when compared with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ (Additional file 1:Table S2). The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ generated more ¹ O₂ et O₂ ^{. −} than did the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁; additionally, the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ and water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ had Φ _Δ values of approximately 0.93 and 0.85, respectively (for reference, Φ _Δ =0.64 is the QY of TSPP dissolved in D₂ O [29, 30]).

un Relative TPA spectra of the material. TPE as a function of the wavelength (720–820 nm) at 98.56 nJ pixel ⁻¹ that was used to monitor the signals. Delivered dose, 3 μg mL ⁻¹ water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ or C₆₀ (OH)₂₁ fullerenol. The number of surviving b material-treated bacteria was determined by CFU counting assay and is expressed as the percentage (%) for c bacteria that corresponds to the unit of CFU mL ⁻¹ . Delivered dose, OD600 ~ 0.05 of E. coli and 0–9 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol. d Measurement of phosphorescence spectra at 1270 nm for material. Delivered dose, 3 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol. Data are means ± SD (n =6)

Antimicrobial Ability Determination Using TPE

Before the execution of antimicrobial experiments, the toxicity of water-soluble fullerenols must be examined to exclude factors that could contribute to bacterial elimination and confound experimental results. In addition, to prevent possible ROS production engendered by the inadvertent exposure of experimental materials to white light, which could confound experimental results [35], PDT experiments must be conducted in the dark. This study applied Gram-negative E. coli as the experimental template. A CFU counting assay was conducted to determine the number of surviving bacteria (expressed herein as a percentage, corresponding to CFU mL ⁻¹ ). The bacteria were treated with two types of the prepared water-soluble fullerenols (dose range, 0 to 9 μg mL ⁻¹ ) and incubated in the dark for 3 h at 37 °C to determine absorbance at 600 nm (OD₆₀₀ ~ 0.05; Additional file 1:Fig. S1). The growth levels of the bacteria treated with the water-soluble fullerenols were first monitored by measuring absorbance at 600 nm. The initial absorbance was 0.05 OD₆₀₀ , and the absorbance associated with both materials reached approximately 0.37 over time. Accordingly, neither material inhibited bacterial proferation. Moreover, the materials engendered a nearly 0 log₁₀ reduction in the number of surviving bacteria (Fig. 3b), corresponding to a viability of approximately 100% (Fig. 3c). Accordingly, the materials were determined to exhibit excellent biocompatibility with the bacteria. Consequently, the materials subjected to 3 h of incubation in the dark at 37 °C were used to conduct experiments. Although the water-soluble fullerenol could generate ROS, interactions between materials and reagents (i.e., SOSG, t -MVP, XTT, and GSH) may result in false-positive ROS signals, thereby confounding PDT results [52]. Therefore, to exclude this possibility, bacteria were introduced and treated with materials in the present study. The amount of ROS generated from the photoexcited material-treated E. coli was observed. Table 2 presents the observed amount of ROS, revealing a similar trend to that in Tables S2–S3 (Additional file 1:materials alone and material-treated-Gram-positive Bacillus subtilis (B. subtilis )); these results were consistent with the ¹ O₂ phosphorescence signal emitted from the materials at 1270 nm (Fig. 3d). PDT against E. coli was performed using irradiation with a low dose of energy (211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans, total effective exposure time ~ 3.2621 s; Ex, 760 nm). The effects PDT on the viability of E. coli treated with two-photon photoexcited materials were then determined (Fig. 4). No bactericidal effects were observed on bacteria alone (with or without laser exposure) or on the panel of material-treated bacteria without laser treatment (Fig. 4a). After TPE, bacterial viability was relatively low; specifically, the viability observed for the panel that was treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was nearly 15%, corresponding to an approximately 0.823 log₁₀ reduction (Fig. 4b). By contrast, the bacterial viability observed for the panel treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 0 (100% elimination efficiency, corresponding to a ~ 7.736 log₁₀ reduction). When the dose was increased, complete bactericidal effects were observed for both materials (Fig. 4c, d). However, antimicrobial effects did not differ by bacteria type (Gram-negative E. coli or Gram-positive B. subtilis ) after photoexcitation (Additional file 1:Fig. S5). In addition, regarding the fullerenols that eliminated bacteria, a higher composition of hydroxyl groups increased bactericidal capability when compared with a lower composition under identical treatment conditions.

Viability (%) was quantified according to the determined viable count of material-treated bacteria through a CFU assay conducted using short excitation with a TPE power of 211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm) to deliver a dose of a , b 3 or c , d 6 μg mL ⁻¹ . Delivered dose, OD600 0.05 of E. coli . Data are presented as means ± SD (n =6). For C₆₀ (OH)₄₆ - and C₆₀ (OH)₂₁ -treated E. coli with photoexcitation, a p <0.001 and p =0.662, b p <0.001 and p =0.658, c p <0.001 and p <0.001, and d p <0.001 and p <0.001. *p value obtained by Student’s t test

Observation of Water-Soluble Fullerenol-Treated E. coli Using TEM and Investigation of Two-Photon Properties

To observe the disruption of material-treated bacteria after photoexcitation, the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ with high PDT efficiency was selected, and bacteria were imaged using TEM. Bare E. coli (Fig. 5a) were incubated with the water-soluble fullerenol for 3 h, resulting in the substantial adsorption of materials on the bacterial surfaces. Nevertheless, no unusual morphologies were observed, indicating normal live bacterial morphology (Fig. 5b). Uptake assay results revealed the adsorption of materials onto the bacterial surface, with the corresponding burst rate being approximately 85% within the first 3 h of incubation (Fig. 5c); the rate reached saturation from the 3rd to the 10th hour. Therefore, the materials were adsorbed and formed an external barrier on the bacterial surface. However, the E. coli exhibited a distorted appearance and severe morphological changes over 3 days of incubation (Fig. 5d), resulting in a 0.940 log₁₀ reduction that corresponded to a nearly 18% viability (Fig.5f; Additional file 1:Fig. S6). Material absorption and coating on the bacterial surface suppressed the absorption of nutrients essential for microbial growth and engendered changes in membrane (wall) permeability, thereby inducing internal osmotic imbalances and inhibiting microbial growth. In other words, the water-soluble fullerenol had antibacterial (bacteriostatic or bactericidal) effects after 3 days of incubation. Furthermore, the photoexcited material-treated bacteria, particularly E. coli , exhibited unique morphologies with severe damage after 3 h of incubation (Fig. 5e, f; Additional file 1:Fig. S6). No heat-generated bubbles formed on the bacterial surface incurred damage, indicating that the water-soluble fullerenol did not have photothermal-mediated heat properties after photoexcitation (Additional file 1:Fig. S7). The viability of E. coli was also determined through fluorescence and quantification (Fig. 6). The green fluorescence indicative of living bacteria in Fig. 6a reveals that the bacteria exposed to laser treatment alone were largely undamaged, which is consistent with the results presented in Fig. 5a. Dead bacteria were detectable after treatment with the materials and laser exposure (red fluorescence in Fig. 6b), a finding that is also consistent with that in Fig. 5e. Bacterial viability was quantified for further antimicrobial testing. Nearly complete elimination of the material-treated bacteria (Fig. 6c) was observed. Viability was also quantified using a CFU assay (Figs. 4a, b and 5f, and Additional file 1:Fig. S6) to demonstrate the antibacterial efficiency of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ in PDT. According to the results in Figs. 4, 5, and 6; Table 2; and Table S2 (Additional file 1), E. coli treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was susceptible to photoexcitation, leading to a higher death rate, increased ROS generation, and more severe morphological collapse compared with E. coli treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ . In general, the absolute cross section for TPE makes fluorophores efficient for nonlinear microscopic studies because the ratio of the energy absorbed to the input energy flux to a specimen is high, thereby minimizing possible photodamage to specimens [39, 40]. When two-photon techniques are used to image molecular activities in living biological preparations and turbid tissues, a favorable cross section is desirable [61]. In the present study, the absolute cross section for TPE calculated for the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 1037 GM (Goeppert-Mayer unit, with 1 GM =10 ⁻⁵⁰ cm ⁴ s photon ⁻¹ ) at a 760-nm excitation wavelength (fluorescein was the standard reference for the cross section [39, 40]; Fig. 1b and Tables 1 and 3); the absolute cross section calculated for the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 1230 GM, which is similar to values obtained in relevant studies [62, 63]. These absolute cross sections could facilitate the two-photon process. Moreover, the fluorescence of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was illuminated through a two-photon process (Fig. 1b). The relative fluorescence QY was approximately 0.02 (the QY of Cy5.5 in dimethyl sulfoxide [31] served as a reference:QY_ref =0.28); similarly, the absolute QY [64] was approximately 0.01, and the same QYs were derived for one-photon excitation and TPE [31]. By contrast, the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ had lower relative and absolute QYs (0.06 and 0.05, respectively). In addition, this study investigated the lifetime of the fullerenols. The effects of radiative and nonradiative decay rates on QY and lifetime were calculated. The average lifetime of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 7.797 ns, as calculated from observed lifetimes of 0.149, 1.775, and 19.679 ns; the average lifetime of the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 5.251 ns (Fig. 7 and Table 4). Therefore, the ratio of radiative to nonradiative decay rates of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately0.020 (derived from rates of approximately 2.565 × 10 ⁶ s ⁻¹ to 1.257 × 10 ⁸ s ⁻¹ ), whereas that of the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 0.064 (approximately 1.143 × 10 ⁷ s ⁻¹ and 1.790 × 10 ⁸ s ⁻¹ ; Additional file 1:Table S4). This finding is attributable to the existence of a hydroxyl group on the surface of the water-soluble fullerenol, which induced the nonradiative recombination of electron–hole pairs, leading to the inhibition of intrinsic state emission. However, hydroxylgroups at the edge of the water-soluble fullerenol may have a high occupied molecular orbital. This can be attributed to the strong orbital interaction between hydroxyl groups, which could thus increase the efficiency of intersystem crossing (rather than fluorescence generation) and generate numerous nanomaterial triplets with a high composition of hydroxyl groups; therefore, this would result in a high Φ _Δ value for the water-soluble fullerenol and induce the fullerenol to react with oxygen according to the Jablonski diagram [65]. Consequently, two-photon PDT can be effectively performed using ultralow energy in an extremely short time, thereby providing an alternative approach to killing malignant species.

images TEM. un Showing bare bacteria without any treatment. Bacteria treated with material for b 3 h and d 3 days of incubation. e The photoexcited material-treated bacteria (3 h of incubation) with a TPE power of 211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm). c Uptake assay of bacteria and material at 37 °C. f Viability (%) was quantified following the determined viable count of material-treated bacteria via CFU assay by short excitation with the same treatment. Delivered dose OD600 ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol C₆₀ (OH)₄₆ . Data are means ± SD (n =6)

Images obtained after laser photoexcitation exposure (211.2 nJ pixel ⁻¹ ) with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm) of a , b material-treated bacteria. The Live/Dead kit was used to stain bacteria before images were obtained. Scale bar, 50 μm. c Viability (%) determination results. Delivered dose, OD600 ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol C₆₀ (OH)₄₆ . For the percentages alive and dead, p <0.001. *p value obtained using Student’s t test. Data are presented as mean ± SD (n =6)

Time-resolved room-temperature PL decay profiles of material (98.56 nJ pixel ⁻¹ ). Excitation wavelength, 760 nm. Delivered dose, OD₆₀₀ ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL ⁻¹ matériaux. Data are presented as means ± SD (n =6)

Conclusions

This study revealed that a water-soluble fullerenol material with a higher composition of hydroxyl groups had superior photoproperties to those of a fullerenol material with a lower composition of hydroxyl groups; the superior photoproperties can be attributed to the reduced laser exposure and materials used for treatment. Furthermore, the water-soluble fullerenol with a higher composition of hydroxyl groups exhibited high TPA, a favorable absolute cross section for TPE, and high two-photon stability. Therefore, this fullerenol has potential as a two-photon PS in two-photon PDT coupled with TPE. This property is probably due to the presence of a hydroxyl group on the surface of the water-soluble fullerenol, which caused the nonradiative recombination of electron–hole pairs, leading to the inhibition of intrinsic state emission. Moreover, hydroxyl groups at the edge of the water-soluble fullerenol may have a high occupied molecular orbital; this may be ascribed to the strong orbital interaction between the hydroxyl groups, thereby increasing intersystem crossing (rather than fluorescence generation) efficiency and generating numerous material triplets with a high composition of hydroxyl groups. Therefore, the water-soluble fullerenol would have a high Φ _Δ value and react with oxygen according to the Jablonski diagram. Consequently, two-photon PDT can be effectively performed using ultralow energy in an extremely short time. Accordingly, this efficient alternative approach to managing malignant species presents possibilities for future clinical applications.

Disponibilité des données et des matériaux

All datasets are presented in the main paper.

Abréviations

PS:

Photosensibilisateurs

QY :

Quantum yield

PDT :

Thérapie photodynamique

UV–vis:

Ultraviolet–visible

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

ψ _Δ :

Singlet oxygen QY

NIR :

Proche infrarouge

TPE:

Two-photon excitation

E. coli :

Escherichia coli

HR-TEM :

Microscopie électronique à transmission haute résolution

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

FTIR :

Infrarouge à transformée de Fourier

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

FD :

Field desorption

CFU:

Colony forming unit

TSPP:

Meso -tetra(4-sulfonatophenyl)porphine dihydrochloride

PL :

Photoluminescence

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

OPE:

One-photon excitation

TPA:

Two-photon absorption

TPL:

Two-photon luminescence

ti-sa:

Titanium-sapphire

NA :

Numerical aperture

FLIM:

Fluorescence lifetime imaging microscopy

¹ O₂ :

Singlet oxygen

SOSG:

Singlet Oxygen Sensor Green

t -MVP:

Trans-1-(2′-methoxyvinyl)pyrene

O₂ ^{. −} :

Superoxide radical anion

XTT:

2, 3-Bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide

GSH:

Glutathione, γ -l-glutamyl-l-cysteinyl-glycine

S₁ :

Singlet

T₁ :

Triplet

B. subtilis :

Bacillus subtilis

GM:

Goeppert-Mayer