Effets protecteurs des points de carbone dérivés de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata contre les lésions rénales aiguës induites par le venin de Deinagkistrodon acutus

Introduction

Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , appartenant à la famille des Vipéridés, est considéré comme l'un des serpents terrestres les plus dangereux de Chine [1]. Envenimation par D. aigu est associée à une série de symptômes tels qu'une hémorragie, une thrombocytopénie et d'éventuels dommages directs au rein [2, 3]. L'insuffisance rénale aiguë (IRA) est l'effet systémique le plus grave et la complication courante de l'envenimation par D. aigu qui conduit directement à un dysfonctionnement rénal persistant et à une morbidité élevée [4, 5]. Le traitement topique actuel implique l'utilisation d'antivenin hyperimmun dérivé de cheval comme antidote. Cependant, son efficacité est limitée pour neutraliser les lésions tissulaires locales, en particulier dans la survenue d'IRA, et a plusieurs effets insatisfaisants tels que des réactions anaphylactiques et pyrogènes [6]. De plus, le coût relativement élevé et la faible stabilité de l'antivenin contribuent également au traitement insatisfaisant des personnes mordues par D. aigu , en particulier dans les zones sauvages ou rurales [7,8,9]. Par conséquent, il existe un besoin urgent de médicaments complémentaires efficaces, sûrs et abordables pour le traitement de D. aigu AKI induite par le venin.

Les points de carbone (CD), une nouvelle classe de nanomatériaux de carbone d'une taille < 10 nm, ont été découverts par hasard par séparation et purification de nanotubes de carbone à paroi simple en 2004 [10] et ont suscité beaucoup d'intérêt au cours de la dernière décennie en raison de leur remarquable de nouvelles propriétés telles qu'une biocompatibilité appréciable, une faible toxicité, une solubilité élevée dans l'eau et des matières premières abondantes [11,12,13]. L'avènement des CD a contribué à la recherche sur le développement de divers nanosystèmes « intelligents », notamment ceux pour la bio-imagerie [14], la biomédecine [15], l'administration de médicaments [16] et la photocatalyse [17].

Il convient de noter que le développement de CD avec un potentiel de bioactivité inhérent fournit de nombreuses stratégies pour la découverte d'une nouvelle génération de médicaments pour le contrôle ou le traitement efficace de certaines maladies en raison des avantages remarquables susmentionnés. Dans plusieurs bioactivités telles que les activités antibactériennes pour traiter la kératite bactérienne [18], hémostatique [19], peroxydase-like [20], anticancéreuse, antivirale et anti-inflammatoire [21] ont été rapportées. Ces effets ont attiré l'attention des scientifiques pour étudier d'autres applications pharmaceutiques et biomédicales des CD. En particulier, les activités d'atténuation des CD dérivées de Schizonepetae Spica Carbonisata [22] sur D. aigu les hémorragies induites par le venin ont fourni une nouvelle perspective sur l'étude des effets bénéfiques des CD sur l'IRA induite par D. aigu morsure de serpent, qui restait jusqu'à présent moins connue.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC)-CDs est synthétisé par pyrolyse directe de PCC (un type de médecine traditionnelle chinoise, utilisé depuis plus de 1000 ans) à l'aide d'un traitement de pyrolyse en une étape. Les PCCC-CD sont des CD hypotoxiques dont le diamètre varie de 1,2 à 4,8 nm. Il a été rapporté que les PCCC-CD possèdent des effets hémostatiques remarquables, ce qui a non seulement élargi l'application biomédicale des CD, mais a également ouvert la voie à l'élucidation de la base matérielle hémostatique du PCCC [23]. Il est à noter que le PCCC, une médecine traditionnelle chinoise préparée par traitement au charbon de bois, a été enregistré pour la première fois dans les Taiping Holy Prescriptions for Universal Relief (978-992 AD, en Chine). Le profil d'innocuité et l'efficacité thérapeutique satisfaisante du PCCC, comme l'hémostase et l'anti-inflammatoire, ont encouragé son application clinique continue pendant plus de 1000 ans, ce qui a été reconnu dans la Pharmacopée de la République populaire de Chine (PPRC, 2015). Cependant, l'étude des bioactivités sous-jacentes supplémentaires des PCCC-CD a été un défi. En particulier, il existe peu d'informations sur l'inhibition de l'IRA induite par D. aigu envenimation.

De plus, il a été rapporté que l'envenimation par morsure de serpent mettait en danger la physiologie rénale directement par les composants néphrotoxiques ou par l'activation ou la modulation de médiateurs immunitaires et inflammatoires [24]. Ces effets concernent principalement des paramètres biomédicaux [25] (créatinine sérique (SCR), azote uréique du sang (BUN), concentration urinaire en protéines totales (UTP) et en microalbuminurie (MALB)), des cytokines inflammatoires (interleukine (IL)-1β), la cytokine anti-inflammatoire (IL-10) et la protéine chimiotactique des monocytes 1 (MCP-1), la modification de l'histologie rénale et la numération plaquettaire (PLT). Dans la présente étude, nous avons synthétisé des PCCC-CD en utilisant une méthode de pyrolyse verte en une étape et, pour la première fois, nous avons étudié leurs effets protecteurs contre le développement de ces anomalies dans l'IRA induite par l'injection intrapéritonéale de souris avec D. aigu venin.

Matériel et méthodes

Produits chimiques

Le matériel PCC a été acheté auprès de Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Pékin, Chine), et le PCCC a été préparé dans notre laboratoire. Des membranes de dialyse avec un poids moléculaire de 1000  Da ont été achetées auprès de Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Pékin, Chine). Le kit de comptage cellulaire (CCK)-8 a été acheté auprès de Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japon). Le venin de serpent lyophilisé de D. aigu a été fourni par An Ren Snake Farm (comté de Yujiang, Yingtan, Jiangxi, Chine) à des fins expérimentales. D'autres réactifs chimiques de qualité analytique ont été obtenus auprès de Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, Chine). Des kits de test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) de souris MCP-1, IL-10 et IL-1β ont été achetés auprès de Cloud-Clone Crop. (Wuhan, Chine). Toutes les expériences ont été réalisées avec de l'eau déminéralisée (DW).

Animaux

Les protocoles de gestion des animaux et de recherche ont été soutenus et approuvés par le Comité institutionnel d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université de médecine chinoise de Pékin. Des souris mâles Kunming (pesant 30,0 ±  2,0  g) ont été achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., avec un certificat de conformité d'animaux de laboratoire, et ont été maintenues dans des cages à température et humidité constantes sur une lumière de 12 h/ cycle sombre avec ad libitum accès à la nourriture et à l'eau.

Préparation de la solution de venin

Le venin lyophilisé a été dissous dans une solution saline normale avec un mélange doux pendant 20 min (concentration finale :5 mg/mL) et conservé à -20 °C jusqu'à utilisation.

Préparation des CD-PCCC

Le PCCC a été préparé en utilisant une méthode de pyrolyse en une étape avec le PCC comme seul précurseur selon les méthodes précédentes [23]. Brièvement, les échantillons de PCC ont été placés dans des creusets en porcelaine séparés et chauffés pendant 1 h à 350 °C dans un four préchauffé. Après refroidissement à 30 °C, les résidus noirs homogènes obtenus ont été broyés en une poudre fine et bouillis deux fois dans de l'eau à 100 °C pendant 1 h à la fois. Ensuite, la solution a été recueillie en pré-filtrant la suspension à travers une membrane en acétate de cellulose de 0,22 µm. Les impuretés non carbonées ont été éliminées par dialyse contre DW pendant 72 h (poids moléculaire retenu :1000  Da). La solution de PCCC-CD a été concentrée et stockée à 4°C jusqu'à utilisation. L'organigramme de la figure 1 illustre le processus ci-dessus.

Illustration du processus de formation de points de carbone (CD) à partir de Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) par traitement de pyrolyse

Caractérisation des CD-PCCC

La morphologie des CD a été étudiée à l'aide d'un microscope électronique à transmission (TEM, JEM-2100 electron, JEOL, Japon) avec une énergie électronique de 200 kV. Les détails structurels ont été examinés à l'aide d'un MET haute résolution (HRTEM) à l'aide d'un microscope électronique Tecnai G2 20 (FEI, USA). Le spectre ultraviolet-visible (UV-Vis) et les propriétés de fluorescence ont été enregistrés et mesurés par spectroscopie UV-Vis (CECIL, Cambridge, Royaume-Uni) et de fluorescence (F-4500, Tokyo, Japon), respectivement. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a été utilisée pour analyser les informations des groupes fonctionnels de surface à une fenêtre spectrale comprise entre 400 et 4000 cm ^− 1 .

Dosages de cytotoxicité

L'hépatocyte humain L02 et les lignées cellulaires 293 T de rein embryonnaire humain ont été utilisés pour évaluer la cytotoxicité potentielle des PCCC-CD à l'aide d'un test CCK-8. Les cellules L02 ont été cultivées dans un milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) tandis que les cellules 293 T ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec une teneur élevée en glucose, contenant 10 % de FBS. Les deux lignées cellulaires ont été incubées à 37 °C dans 5% de CO₂ humidifié .

Les cellules L02 et 293 T ont été ensemencées à une densité de 2,0 × 10 ⁴ cellules/puits en plaques 96 puits et cultivées à 37 °C en atmosphère humidifiée à 5% CO₂ pendant 24 h. Ensuite, les deux types de cellules ont été traités avec 100 μL de concentrations différentes (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 et 19,5 μg/mL) des solutions PCCC-CD dans un milieu sans sérum et ont été incubés pendant 24 autres h. Par la suite, le milieu contenant les PCCC-CD a été retiré et les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La cytotoxicité a été déterminée en lisant la plaque à 450 nm immédiatement après avoir ajouté 10 L du réactif CCK-8 et incubé pendant 4 h à 37 °C.

D. aigu AKI et traitement induits par le venin

D. aigu Modèle AKI induit par le venin

Le modèle de souris AKI a été établi en injectant par voie intrapéritonéale des souris avec D. aigu venin de serpent. Les souris ont été réparties au hasard dans les cinq groupes suivants de 36 animaux chacun :contrôle; maquette; et les groupes de traitement PCCC-CD à dose élevée, moyenne et faible. Le groupe modèle a reçu D. aigu venin à 1 mg/kg (0,15 mg/mL, 0,2 mL) de poids corporel et 0,5 mL de solution saline normale par voie intrapéritonéale, tandis que les groupes de traitement PCCC-CD à dose élevée, moyenne et faible ont reçu un volume équivalent de venin de serpent et de PCCC -Extrait de CD à des doses de 8,0, 4,0 et 2,0 mg/kg, respectivement. Les souris injectées par voie intrapéritonéale avec seulement une solution saline normale (NS) ont servi de témoins. Six souris de chaque groupe ont été sacrifiées 1, 3 et 12 h après l'administration de NS, D. aigu venin et PCCC-CD selon le calendrier décrit ci-dessus, tandis que les souris sacrifiées aux jours 1, 2 et 5 ont été administrées en continu avec NS, D. aigu venin de serpent et PCCC-CD deux fois par jour.

Analyse des concentrations UTP et MALB

Après administration des traitements respectifs, les animaux des groupes témoins, modèles et traités par PCCC-CDs (4,0 mg/kg) ont été immédiatement placés dans des cages métaboliques appropriées pour la collecte d'urine jusqu'à la fin de la période d'incubation (24 h). Les concentrations d'UTP et de MALB ont été analysées à l'aide d'un analyseur biochimique automatique.

Analyse des biomarqueurs de la fonction rénale

La fonction rénale a été évaluée en mesurant les niveaux de SCR et BUN. Avant l'euthanasie des souris, des échantillons de sang ont été prélevés du plexus rétro-orbitaire puis placés dans des tubes en plastique pendant au moins 4 h à 4 °C. Le sérum a été obtenu par centrifugation à 750×g pendant 15 min, et les niveaux de BUN et de SCR ont été analysés à l'aide d'un analyseur biochimique automatique.

Détection des niveaux de cytokines inflammatoires

Les reins droits des souris ont été prélevés, congelés rapidement dans de la neige carbonique et conservés à -80 °C jusqu'à leur utilisation dans les procédures suivantes. Des échantillons de tissus (100 mg) des différents groupes ont été homogénéisés avec du PBS sur glace puis centrifugés à 750×g pendant 15 minutes. Les surnageants ont été collectés pour déterminer les niveaux de MCP-1, IL-10 et IL-1β à l'aide des kits ELISA respectifs conformément aux instructions du fabricant.

Histologie rénale

Les échantillons de tissu rénal gauche de souris ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % à 4 °C pendant plus de 48 h, déshydratés, inclus dans de la paraffine, coupés en sections, puis colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Les changements morphologiques ont été comparés entre les groupes témoins, modèles et traités par PCCC-CD.

Activité thrombocytopénique

Le PLT a été réalisé sur du sang prélevé sur les souris du plexus rétro-orbitaire et détecté à l'aide d'un analyseur d'hématologie automatisé (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japon).

Analyse statistique

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du progiciel statistique pour les sciences sociales (SPSS, version 13.0). Les données normalement distribuées et les variances homogènes sont exprimées en moyennes ± écart type (SD). Une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du test de la différence la moins significative (LSD) a été utilisée pour les comparaisons multiples. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Caractérisation des CD-PCCC

La MET a été utilisée pour observer directement la morphologie et la distribution de la taille des PCCC-CD (Fig. 2a, c et d). Les CD préparés étaient sphériques et de taille uniforme, avec la plupart à 2,84 ± 0,89 nm sans agrégations distinctes. L'image HRTEM a montré des franges de réseau (0,24  nm) des CD, qui correspondaient au carbone graphitique comme le montre la figure 2b.

un et c Images de microscopie électronique à transmission (MET) de points de carbone Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD), b Image TEM haute résolution de CD-PCCC, d Distribution de la taille des CD-PCCC

Comme le montre la figure 3a, les CD présentaient une fluorescence nettement bleue avec un pic maximum à 445 nm après une excitation à 370 nm. En conséquence, les informations optiques sur les PCCC-CD affichées dans le spectre UV-Vis ont montré un fort pic d'absorption à 265 nm correspondant à la transition π-π* des molécules organiques conjuguées sur les surfaces des CD (Fig. 3b).

Propriétés optiques des points de carbone Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD). un Spectres de fluorescence, b spectres ultraviolet-visible (UV-Vis) et c Spectre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

De plus, les groupes fonctionnels des CD formulés ont été identifiés sur la base du spectre FTIR en détail, comme le montre la figure 3c. Le pic à 3433 cm ^− 1 a été attribué aux bandes d'absorption des vibrations d'étirement O-H et N-H tandis que les vibrations d'étirement C-H sont apparues à 2923 cm ^− 1 et 2853 cm ^− 1 . De plus, le pic d'absorption à 1624 cm ^− 1 indique la présence de C=O. Des liaisons C–O–C ont été observées à 1109 cm ^− 1 , et le pic à 1400 cm ^− 1 a été attribuée à l'étirement C-N. Ces résultats sont cohérents avec ceux des rapports précédents.

Cytotoxicité in vitro

Pour évaluer la cytotoxicité, les cellules T L02 et 293 ont été exposées à diverses concentrations de PCCC-CD pendant 24 h et la viabilité a été examinée à l'aide du test CCK-8. Comme illustré sur la figure 4a, la viabilité des cellules L02 traitées avec des PCCC-CD était> 85 % par rapport à celle des cellules témoins, même à une concentration aussi élevée que 5  mg/mL. De même, les PCCC-CD n'ont pas affecté la croissance des cellules 293 T à des concentrations allant jusqu'à environ 2500 μg/mL (Fig. 4b). Ces résultats ont indiqué que les PCCC-CD présentaient une faible cytotoxicité.

Viabilité cellulaire par dosage CCK-8 de (a ) Cellules L02 et (b ) Cellules 293 T incubées avec PCCC-CD pendant 4 h

Effet des CD-PCCC sur les concentrations UTP et MALB

Par rapport au niveau d'UTP dans le groupe témoin (0,98 ± 0,38 mg/L), les niveaux d'UTP ont augmenté de manière significative dans le D. aigu traité au venin (3,08 ± 0,92 mg/L, P < 0,01) et PCCC-CD (2,36 ± 0,83 mg/L, P <0,05) (Fig. 5a). De plus, le niveau d'UTP a diminué après le traitement PCCC-CD par rapport aux niveaux après l'administration de venin (P < 0,05). De plus, le taux de MALB a manifestement augmenté 24h après l'injection intrapéritonéale de D. aigu venin (17,78 ± 5,96 mg/L, P < 0,01) par rapport à celui du groupe témoin (2,02 ± 0,91 mg/L). En revanche, les souris traitées par PCCC-CD ont montré une tendance à la diminution du niveau de MALB (14,25 ± 4,16 mg/L, Fig. 5b).

Effets des points de carbone Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sur les protéines urinaires totales (UTP) et la microalbuminurie (MALB) dans l'urine. un UTP et b MALB. Les souris ont été traitées avec une solution saline normale (NS), D.acutus venin (Dav, 1 mg/kg) et PCCC-CD (4 mg/kg) + Dav (1 mg/kg). Les données sont représentées par la moyenne  ± SD de six animaux de chaque groupe. *p  0,05 et ** p  0,01 par rapport au groupe témoin traité par NS. ^# p  0,05 par rapport au groupe Dav

PCCC-CDs soulagé le dysfonctionnement rénal dans D. aigu Souris AKI induites par le venin

La fonction rénale a été évaluée en mesurant les niveaux de BUN et de SCR, qui sont représentés sur les Fig. 6 et 7. Les souris traitées avec D. aigu le venin avait des niveaux significativement plus élevés de BUN (12,07 ± 1,00 mmol/L [1 jour], P < 0,01 ; 11,43 ± 1,37 mmol/L [2 jours], P < 0,01 ; 14,83 ± 2,53 mmol/L [5 jours], P < 0,01) et SCR (12,83 ± 1,43 μmol/L [1 jour], P < 0,01 ; 13.48 ± 2.26 μmol/L [2 jours] ; P < 0,01. 13.80 ± 1.90 μmol/L [5 jours], P < 0,01) que les souris traitées par NS (BUN :8,95 ± 1,04 [1 jour], 9,53 ± 1,40 [2 jours] et 9,07 ± 1,57 [5 jours] mmol/L ; SCR :9,40 ± 0,89 [1 jour] , 10,27 ± 2,04 [2 jours] et 9,85 ± 1,99 [5 jours] μmol/L) du jour 1 au 5 (Figs. 6a et 7a). Il est à noter que, par rapport au groupe modèle, le traitement avec des PCCC-CD à faible dose a inhibé de manière significative l'augmentation des niveaux de SCR (9,77 ± 0,79 μmol/mL, P < 0,01) et BUN (10,50 ± 1,38 mmol/L, P < 0,05), alors qu'il est élevé (9,62 ± 1,87 μmol/mL, P < 0,01) et moyen (10,75 ± 1,48 μmol/mL, P Les doses < 0,05) ont inhibé l'augmentation de SCR (Fig. 7b) mais pas de BUN (Fig. 6b) induite par D. aigu le venin au jour 1. Les niveaux de SCR (Fig. 7c) des groupes traités par PCCC-CD à dose élevée, moyenne et faible ont diminué (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 et 10,68 ± 1,41 μmol/mL, respectivement ; P < 0,05) que dans le groupe modèle au jour 2. De plus, par rapport au groupe modèle, les niveaux de BUN ont diminué de manière significative dans les niveaux élevés (9,57 ± 0,52 mmol/L, P < 0,01) et à faible dose (10,72 ± 2,04 mmol/L, P <0,05) Le groupe PCCC-CD mais pas le groupe à dose moyenne (Fig. 6c) au jour 2. Comme le montrent les Fig. 6j et 7j, des effets inhibiteurs ont été observés sur les niveaux des deux indices à haut (12,28 ± 1,65 mmol/L, P <0,01 (BUN) ; 11,38 ± 1,80 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), respectivement) et moyen (12,40 ± 1,33 mmol/L, P <0,05 (BUN) ; 10,83 ± 2,57 μmol/mL, P <0,05 (SCR), respectivement) doses de PCCC-CD. De plus, aucune différence significative n'a été observée entre les groupes témoins et traités par PCCC-CD dans le SCR.

Effets de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - points de carbone (PCCC-CD) sur l'azote uréique du sang (BUN). un La concentration de BUN change en 1 h, 3 h, 12 h, 1 jour, 2 jour et 5 jour. Les niveaux de BUN dans (b ) 1 jour (c ) 2 jour (j ) 5 jours. Les souris ont été traitées avec une solution saline normale (NS), D.acutus venin (Dav, 1 mg/kg) et des doses élevées (H), moyennes (M) et faibles (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg/kg). Les données sont représentées par la moyenne  ± SD de six animaux de chaque groupe. *p  0,05 et ** p  0,01 par rapport au groupe témoin traité par NS. ^# p  0,05 par rapport au groupe Dav

Effets des points de carbone Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sur la créatinine sérique (SCR). un La concentration SCR change en 1 h, 3 h, 12 h, 1 jour, 2 jours et 5 jours. Les niveaux de SCR en (b ) 1 jour (c ) 2 jours (d ) 5 jours. Les souris ont été traitées avec une solution saline normale (NS), D.acutus venin (Dav, 1 mg/kg) et des doses élevées (H), moyennes (M) et faibles (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg/kg). Les données sont représentées par la moyenne  ± SD de six animaux de chaque groupe. *p  0,05 et ** p  0,01 par rapport au groupe témoin traité avec une solution saline normale (NS). ^# p  0,05 par rapport au groupe Dav

PCCC-CDs inhibe la sécrétion de cytokines

Les effets de trois concentrations de PCCC-CD sur la production de cytokines chimiotactiques (MCP-1) et pro-inflammatoires (IL-1β) et anti-inflammatoires (IL-10) en réponse à des injections de D. aigu venin ont été étudiés. La figure 8 a montré que l'injection de venin augmentait l'IL-1β libérée dans le modèle murin (1 h :58,19 ± 5,35 ng/mL, P < 0,01 ; 3 h :56,57 ± 3,54 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h :49,48 ± 7,74 ng/mL, P < 0,05 ; jour 1 : 41,09 ± 4,82 ng/mL, P < 0,05 ; jour 2 : 47,96  ± 8,33  ng/mL, P < 0,05 ; jour 5 : 45,11 ± 6,95 ng/mL, P < 0,05) par rapport aux niveaux chez la souris traitée par NS (1 h :35,96 ± 4,72 ng/mL, 3 h :34,94 ± 2,58 ng/mL, 12 h :36,42 ± 5,25 ng/mL, jour 1 :34,47 ± 3,67 ng /mL, jour 2 :39,84 ± 3,71 ng/mL, jour 5 :36,82 ± 8,27 ng/mL). Comme le montre la figure 8b–d, la comparaison avec le D. aigu groupe induit par le venin a montré qu'une exposition de 1, 3 et 12 h à des niveaux élevés (50,09 ± 7,68 ng/mL, P < 0,05 [1 h] ; 40,36 ± 8,51 ng/mL, P < 0,01 [3 h] ; 39,87 ± 4,64 ng/mL, P < 0,05 [12 h], respectivement) et faible (46,64 ± 3,83 ng/mL, P < 0,01 [1 h] ; 37.65 ± 9.61 ng/mL, P < 0,01 [3 h] ; 38,75 ± 6,64 ng/mL, P <0,05 [12 h], respectivement) la dose de PCCC-CD diminue significativement les niveaux d'IL-1β. De plus, les PCCC-CD à dose moyenne ont considérablement réduit le niveau d'IL-1β (41,50 ± 11,08 ng/mL, P < 0,01) par rapport à celui des souris traitées au venin à 3 h mais pas à d'autres moments.

Effets des points de carbone Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sur le niveau d'IL-1β dans le tissu rénal. un Le niveau d'IL-1β change en 1 h, 3 h, 12 h, 1 jour, 2 jours et 5 jours. Niveaux d'IL-1β dans (b ) 1 h, (c ) 3 h, (j ) 12 h, (e ) 1 jour, (f ) 2 jours, et (g ) 5 jours. Les souris ont été traitées avec une solution saline normale (NS), D.acutus venin (Dav, 1 mg/kg) et des doses élevées (H), moyennes (M) et faibles (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg/kg). Les données sont représentées par la moyenne  ± SD de six animaux de chaque groupe. *p < 0,05 et ** p <0,01 par rapport au groupe témoin traité avec une solution saline normale (NS). ^# p  0,05 par rapport au groupe Dav

Les niveaux de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 ont considérablement augmenté dans le D. aigu groupe traité au venin à différents moments (23,27 ± 0,72 ng/mL, P < 0,01 ; 22,03 ± 0,96 ng/mL, P < 0,05 ; 21,76 ± 1,99 ng/mL, P < 0,05 ; 26,31 ± 6,55 ng/mL, P < 0,01 ; 3h, 12h, jour 1 et jour 2, respectivement) par rapport au groupe traité par NS (Fig. 9). À l'opposé, le traitement avec des PCCC-CD à dose élevée et moyenne (17,17 ± 4,04 et 17,25 ± 5,64 ng/mL, respectivement, les deux P < 0,05) a inhibé la sécrétion d'IL-10 induite par le venin à 3 h tandis que les PCCC-CD à faible dose ont inhibé les niveaux à 3 h, 12 h et jour 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 et 18,31 ± 2,14 ng/ ml, respectivement, tous les P < 0,05). Aucune différence significative n'a été observée entre le groupe traité par PCCC-CD et le groupe NS.

Effets des points de carbone Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sur le niveau d'IL-10 dans le tissu rénal. un Le niveau d'IL-10 change en 1 h, 3 h, 12 h, 1 jour, 2 jours et 5 jours. Le niveau d'IL-10 en (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 jour, (f ) 2 jours et (g ) 5 jours. Les souris ont été traitées avec une solution saline normale (NS), D.acutus venin (Dav, 1 mg/kg) et des doses élevées (H), moyennes (M) et faibles (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg/kg). Les données sont représentées par la moyenne  ± SD de six animaux de chaque groupe. *p < 0,05 et ** p <0,01 par rapport au groupe témoin traité avec une solution saline normale (NS). ^# p  0,05 par rapport au groupe Dav

De plus, la figure 10 montre que l'injection de D. aigu le venin a significativement augmenté la libération de MCP-1 dans le groupe modèle (1 h :197,45 ± 22,34 ng/mL, P < 0,01 ; 3 h :182,42 ± 12,94 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h :169,20 ± 26,74 ng/mL, P < 0,01 ; 24 h :142,81 ± 25,85 ng/mL, P < 0,05) par rapport au contrôle traité par NS (1 h :115,82 ± 14,80 ng/mL ; 3 h :106,46 ± 13,76 ng/mL ; 12 h :120,35 ± 15,75 ng/mL ; et 24 h :108,81 ± 25,60 ng/ ml). Plus remarquable, le traitement des souris envenimées avec les trois doses de PCCC-CD a inhibé l'augmentation des niveaux de MCP-1. Le moyen (3 h :136,84 ± 39,94 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h :127,48 ± 13,75 ng/mL, P < 0,01) et faible (1 h :152,13 ± 18,89 ng/mL, P < 0,05 ; 3 h :129,54 ± 30,85 ng/mL, P < 0,01 ; 12 h :118,75 ± 19,96 ng/mL, P < 0,01) Les PCCC-CD ont inhibé l'augmentation des niveaux de MCP-1 à 1, 3 et 12 h, sauf pour la dose moyenne, à 1 h (178,20 ± 22,79 ng/mL). Le traitement avec des PCCC-CD à haute dose n'a diminué efficacement le niveau de MCP-1 qu'à 3 h (131,42 ± 24,62 ng/mL, P < 0,01).

Effets des points de carbone Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sur le niveau de MCP-1 dans le tissu rénal. un Le niveau de MCP-1 change en 1 h, 3 h, 12 h, 1 jour, 2 jours et 5 jours. Niveaux MCP-1 en (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 jour, (f ) 2 jours, et (g ) 5 jours. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p  < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.

Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia

PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10 ⁹ ; 3 h:[1120 ± 36] × 10 ⁹ ; 12 h:[1245 ± 111] × 10 ⁹ ; day 1:[1177 ± 69] × 10 ⁹ ; day 2:[1195 ± 51] × 10 ⁹ ; and day 5:[1181 ± 46] × 10 ⁹ ), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10 ⁹ , P < 0,01 ; 3 h:[315 ± 77] × 10 ⁹ , P < 0,01 ; 12 h:[435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0,01 ; day 1:[663 ± 226] × 10 ⁹ , P < 0,01 ; day 2:[941 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0,05 ; day 5:[1083 ± 89] × 10 ⁹ ). Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10 ⁹ , P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10 ⁹ , P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10 ⁹ , P < 0,01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. un PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p  < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

Histopathological Observations

The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days

Discussion

As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].

The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.

The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.

In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.

Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.

Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.

An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.

Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].

The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.

Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.

Conclusion

The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.

Disponibilité des données et des matériaux

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

Abréviations

AKI:

Acute kidney injury

BUN:

Blood urea nitrogen

CD :

Points de carbone

D. acutus :

Deinagkistrodon acutus

HE:

Haematoxylin and eosin

IL :

Interleukine

MALB:

Microalbuminuria

MCP-1:

Monocyte chemotactic protein 1

PCC:

Phellodendri Chinensis Cortex

PCCC-CDs:

Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots

PLT:

Platelet counts

SCR:

Serum creatinine

UTP:

Urinary total protein