Étude de la thérapie par ultrasons focalisés de haute intensité améliorée par des microbulles sonodynamiques N2O

Introduction

Les tumeurs malignes sont l'une des principales maladies qui menacent la vie et la santé humaines [1]. Les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) sont une nouvelle technique d'ablation locale non invasive des tumeurs. HIFU a été utilisé avec succès dans le traitement des tumeurs solides bénignes et malignes du foie, des reins, du pancréas, de la prostate, du sein, des os et de l'utérus [2, 3]. Cependant, les limitations inhérentes à HIFU, telles que la diminution de l'énergie ultrasonore pendant le traitement, l'affaiblissement de l'accumulation d'énergie dans la zone cible et les dommages aux tissus sains non ciblés réduisent son effet thérapeutique [4, 5]. Le champ focal formé par l'irradiation HIFU est petit, généralement de magnitude millimétrique. L'ablation de grosses tumeurs prend beaucoup de temps. L'extension du temps d'irradiation HIFU augmentera la température corporelle, atteignant même 39,2 °C. À mesure que la profondeur de la tumeur augmente dans le corps, l'énergie de l'ablation HIFU doit également augmenter [6]. Ceux-ci augmentent le risque de dommages physiques pour le patient et réduisent l'efficacité et la sécurité du traitement HIFU. Par conséquent, les chercheurs se sont engagés à trouver des moyens d'augmenter l'efficacité thérapeutique des HIFU ces dernières années [7,8,9]. Les microbulles pourraient améliorer de manière synergique l'efficacité thérapeutique des HIFU [7, 10]. Le gaz contenu dans la microbulle appartient au matériau à haute impédance acoustique. Les microbulles augmentent la diffusion et la réflexion de l'onde ultrasonore dans la zone cible lorsque le HIFU irradie la zone du tissu tumoral [11, 12]. Les microbulles augmentent la température de la zone cible de la tumeur et améliorent l'effet thermique du traitement HIFU en augmentant l'accumulation d'énergie HIFU dans la zone cible [13]. De plus, les microbulles en tant que noyau de cavitation exogène réduisent également le seuil de cavitation tissulaire et améliorent l'effet de cavitation de HIFU lorsqu'il traverse la circulation sanguine dans le tissu tumoral [14]. Ces dernières années, des études ont indiqué que la thérapie sonodynamique (SDT) peut améliorer de manière synergique l'efficacité du traitement HIFU [15, 16]. Les interactions entre les sonosensibilisateurs et les ultrasons produisent des espèces réactives de l'oxygène (ROS), y compris l'oxygène singulet et les radicaux hydroxyles, qui tuent les cellules tumorales et inhibent la croissance tumorale par apoptose et nécrose [17]. SDT a fait de grands progrès dans le traitement non invasif des tumeurs déposé ces dernières années. Il permet de réduire la dose médicamenteuse et la puissance d'irradiation HIFU par rapport à celles des monothérapies conventionnelles. Afin d'exploiter pleinement les avantages des deux, cette étude a combiné les microbulles et l'effet sonodynamique pour améliorer encore l'efficacité de HIFU. Les sonosensibilisateurs sont une partie importante du SDT [18, 19]. La plupart des sonosensibilisateurs traditionnels actuellement étudiés sont issus de photosensibilisateurs. N₂ O est un photosensibilisateur [20, 21], qui produit des substances toxiques dans des conditions d'irradiation à la lumière ultraviolette. Dans cette étude, la sonosensibilité de N₂ O a également été initialement exploré. Nous avons précédemment trouvé que l'application de N₂ O l'anesthésie par inhalation dans l'opération HIFU a aggravé le degré de lésion des tissus, y compris l'augmentation de l'épaisseur de la congestion abdominale et cutanée [22]. L'utilisation combinée de N₂ O et HIFU ont joué un effet synergique sur les lésions tissulaires. Mais, quel effet biologique N₂ O a dans le traitement HIFU n'est pas clair. N₂ O est un petit gaz moléculaire relativement stable sans biotransformation et sans spécificité tissulaire dans les cellules. Il peut être largement utilisé dans les tissus et n'a pas d'effet toxique sur le corps [23, 24]. C'est donc une perspective intéressante en tant que sonosensibilisateur. Dans cette étude, des microbulles à l'échelle nanométrique (N₂ O-mbs) ont été préparés en utilisant du N₂ enveloppé de lipides O et C₃ F₈ . Le dosage de N₂ O a été réduit et son domaine d'action in vivo a également été efficacement limité à la zone du tissu tumoral. L'effet sonodynamique de N₂ O et son effet synergique sur l'efficacité de HIFU ont été examinés.

Matériaux et méthodes

Matériaux

1,2-Dihexadécanoyl-rac-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) et 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N -[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-mPEG2000) ont été achetés auprès d'Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). La glycérine et l'agarose ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). N₂ O et C₃ F₈ ont été achetés à Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (Chine). 4′,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI), 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), 2′,7′-dichlorofluorescine diacétate (DCFH-DA) , 3-amino,4-aminométhyl-2′,7′-difluorescéine, diacétate (DAF-FM DA) et CCK-8 ont été achetés auprès de Beyotime Biotechnology (Chongqing, Chine). La calcéine-AM (CAM) et l'iodure de propidium (PI) ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology (TX, USA). L'annexine V-FITC/PI a été obtenue auprès de Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, Chine). Le capteur d'oxygène singulet vert (SOSG) a été acheté chez Invitrogen (NY, États-Unis).

Préparation de N₂ O-mbs et C₃ F₈ -mbs

N₂ Les O-mbs ont été préparés par le film rotatif combiné avec la méthode d'oscillation mécanique. Nous avons pris DPPC et DSPE-PEG2000 comme matériaux de coque et N₂ O comme noyau. Brièvement, 5 mg de DPPC, 2 mg de DSPE-PEG2000 et 10 ml de chloroforme ont été simultanément versés dans un ballon à fond rond, mélangés et complètement dissous par des ondes ultrasonores. Ensuite, les films lipidiques ont été formés par évaporateur rotatif (60 min, 55°C, 100 r/min). Ensuite, 2 ml de glycérol à 10 % ont été ajoutés pour hydrater les films lipidiques et préparer une suspension. dont 500 L ont été ajoutés à un tube capsule. Le tube de la capsule était coiffé d'un capuchon en caoutchouc. L'air dans le tube a été remplacé par N₂ O et C₃ F₈ par un dispositif de déplacement de gaz. Ensuite, la suspension a été oscillée mécaniquement par un mélangeur de capsules argent-mercure (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., Chine) pendant 150 s. Enfin, la suspension résultante a été soumise à une centrifugation différentielle pour obtenir la cible N₂ O-mbs, et a été centrifugé à 300 tr/min pendant 5 min, puis centrifugé à 800 tr/min pendant 5 min. N₂ Les O-mbs ont été remis en suspension dans du PBS puis stockés à 4 °C pour une utilisation ultérieure.

Le C₃ F₈ -mbs ont été fabriqués en utilisant la même méthode d'oscillation mécanique, comme décrit précédemment [25]. N₂ étiqueté DiI Les O-mbs peuvent être préparés en ajoutant DiI pendant la formation du film de centrifugation. Il convient de mentionner que N₂ O a un faible poids moléculaire et est instable. Le N₂ O dans la microbulle déborde facilement. Par conséquent, la demi-vie de la microbulle est réduite. C₃ F₈ est un gaz inerte macromoléculaire largement utilisé dans l'étude des agents de contraste à microbulles ultrasonores. C₃ F₈ peut augmenter la stabilité des microbulles. Par conséquent, dans cette étude, N₂ O et C₃ F₈ (2:1) ont été mélangés comme N₂ Noyau O-mbs pour augmenter leur stabilité.

Fabrication et détection des performances de N₂ O-mbs

La morphologie et la distribution des tailles de N₂ O-mbs ont été observés en microscopie optique à fond clair. Les concentrations de N₂ O-mbs et C₃ F₈ -mbs ont été calculés par globulimètre selon les directives de calcul. La taille moyenne des particules et le potentiel zêta du N₂ Les O-mbs ont été déterminés par un système de diffusion de lumière laser dynamique (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). La structure et la morphologie du N₂ Les O-mbs ont été caractérisés par microscopie électronique à transmission (MET, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japon). Le N₂ préparé Les O-mbs ont été conservés à 4°C. Afin d'observer la stabilité de N₂ O-mbs, la morphologie et la concentration ont été enregistrées les premier, deuxième et troisième jours. Dans le même temps, la taille moyenne des particules et le potentiel zêta des microbulles ont été déterminés.

Culture cellulaire et modèle animal

Des cellules humaines de cancer du sein (MDA-MB-231 ; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, Chine) ont été passées en laboratoire pendant moins de 3 mois après la réanimation. Les cellules ont été maintenues dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ , en utilisant du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 50 g/L de streptomycine et 50 g/L de pénicilline. Lorsque les cellules ont atteint 80 % de confluence, elles ont été utilisées pour l'expérimentation.

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives du Comité d'éthique animale de l'Université médicale de Chongqing. Un certain nombre de souris nude femelles (âgées de 4 à 6 semaines; poids de 15 à 20 g) ont été achetées au Centre d'expérimentation animale de l'Université médicale de Chongqing (Chongqing, Chine). Pour l'établissement de tumeur solide, les cellules MDA-MB-231 (1 × 10 ⁶ cellules/mL) en suspension dans une solution saline normale (100 L) ont été injectés par voie sous-cutanée dans le flanc arrière droit de chaque souris. Toutes les souris porteuses de tumeurs ont été utilisées pour des expériences thérapeutiques lorsque les volumes tumoraux ont atteint environ 150 mm ³ .

Évaluation de l'absorption intracellulaire et de la biocompatibilité de N₂ O-mb

Les cellules MDA-MB-231 en phase de croissance ont été ensemencées à une densité d'environ 1 × 10 ⁵ cellules par flacon de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) pendant 24 h. Ensuite, 100 L (1 × 10 ⁵ bulles/mL) de N₂ marqué DiI Une solution de dilution de milieu complet O-mbs a été ajoutée pour remplir la boîte confocale de milieu. Le plat a été scellé avec des scellants pour microplaques et stocké à l'envers dans un incubateur, en gardant le N₂ O-mbs en contact avec les cellules. Après 2 h et 4 h de co-incubation, les cellules ont été lavées doucement 3 fois avec du PBS, fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 20 min et colorées au DAPI pendant 20 min. Enfin, le comportement de ciblage des cellules de N₂ O-mbs a été observé par CLSM (Nikon A1, Japon).

La cytotoxicité de N₂ O-mbs a été évalué par un test CCK-8 standard. Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits (5 × 10 ⁴ cellules/puits) pendant 24 h. Ensuite, 100 L de concentrations différentes (1 × 10 ⁴ /mL, 1 × 10 ⁵ /mL, et 1 × 10 ⁶ /mL) de N₂ O-mb ont été ajoutés. Après 24 h d'incubation, une solution de CCK-8 (10 L) a été ajoutée dans chaque puits. Ensuite, les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées à 37 °C pendant encore 2 h. Enfin, l'absorbance de chaque puits a été mesurée à 450 nm avec un lecteur de microplaques Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA).

Dix souris nude femelles saines pesant environ 20 g ont été réparties en deux groupes au hasard. Le N₂ O-mbs (n =5) le groupe a reçu une injection intraveineuse de N₂ O-mbs (200 L, 1 × 10 ⁵ /mL) et le groupe contrôle (n =5) injecté avec une solution saline normale (200 L). Après 21 jours, les principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) de toutes les souris ont été excisés et colorés à l'hématoxyline-éosine (H&E).

Efficacité SDT In Vitro de N₂ O-mbs

La méthode de détection des radicaux oxygène était basée sur un rapport précédent [26]. Brièvement, 10 L de SOSG (500 M) ont été mélangés avec 2 ml de la solution échantillon. Les traitements ont été regroupés comme suit :groupe C (le groupe témoin à blanc), du PBS seul a été ajouté; N₂ Groupe O-mbs, 100 L de N₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ /mL) dans 2 mL de solution PBS a été ajouté; C₃ F₈ -groupe mbs, 100 L de C₃ F₈ -mbs (1 × 10 ⁵ /mL) dans 2 mL de solution PBS a été ajouté; Groupe LIFU, le PBS a été irradié par ultrasons (2 W/cm ² ; Institut d'imagerie par ultrasons des sciences médicales de Chongqing, Chongqing, Chine) pendant 100 s ; LIFU–N₂ Groupe O-mbs, PBS avec N₂ ajouté O-mbs a été irradié par ultrasons ; LIFU–C₃ F₈ -mbs groupe, PBS avec C₃ ajouté F₈ -mbs a été irradié par ultrasons. Les paramètres de traitement du groupe expérimental ont été fixés à 2 W/cm ² et 100 s par l'analyse et la comparaison des résultats expérimentaux et la consultation de la littérature [27, 28]. Les paramètres ultrasonores utilisés à des fins de traitement ont été fixés comme suit :fréquence, 650 kHz; distance focale, 12,5 mm; mode d'onde de pouls, cycle de service de 50 % ; et durée d'impulsion, 1 s. La génération d'oxygène singulet ( ¹ O₂ ) a été déterminée par spectrométrie de fluorescence (Cary Eclipse, Agilent Technologies) en mesurant l'intensité de fluorescence (λ excitation/λ émission =504 nm/525 nm). La sélection de l'intensité et de la durée des ultrasons était cohérente avec les expériences cellulaires in vitro.

Une fois que la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) extracellulaires a été détectée à l'aide du dosage SOSG, la production de ROS intracellulaires a été détectée par un kit de dosage ROS basé sur DCFH-DA. Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées à une densité d'environ 1 × 10 ⁵ cellules par flacon CLSM. Ensuite, ils ont été répartis aléatoirement en six groupes :le groupe témoin (sans traitement), les N₂ Groupe O-mbs uniquement (100 μL, 1 × 10 ⁵ bulles/mL), le C₃ F₈ -mbs uniquement groupe (100 μL, 1 × 10 ⁵ bulles/mL), le groupe LIFU seul (2 W/cm ² pendant 100 s), le LIFU-C₃ F₈ -mbs groupe, le LIFU–N₂ Groupe O-mbs. Après incubation pendant 24 h pour permettre la fixation des cellules, chaque groupe a été soumis à l'intervention expérimentale correspondante décrite ci-dessus. Ensuite, la même quantité de DCFH-DA (30 M) a été ajoutée à la boîte correspondante dans chaque groupe, et la boîte a été incubée pendant 20 min dans l'obscurité. Les cellules ont ensuite été rincées doucement 3 fois avec du PBS pour éliminer la sonde DCFH qui n'est pas entrée dans la cellule. Enfin, la génération de ROS intracellulaires a été déterminée par CLSM. Pour vérifier davantage l'efficacité SDT de N₂ O-mbs, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, cultivées pendant 24 h et réparties au hasard en six groupes, comme décrit ci-dessus. Ensuite, les traitements correspondants ont été effectués dans chaque groupe. Les cellules de chaque groupe ont été digérées et préparées en suspensions cellulaires à des concentrations appropriées et placées dans une boîte CLSM. Enfin, les cellules ont été scannées par CLSM après co-coloration avec des colorants CAM et PI pour différencier les cellules mortes (rouges) et vivantes (vertes). L'apoptose a été détectée par cytométrie en flux et coloration à l'annexine V-FITC/PI. Après 1 h de traitement, chaque groupe de cellules a été centrifugé et les cellules ont été collectées. Après la co-coloration à l'annexine V-FITC/PI, une détection par cytométrie en flux (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a été effectuée.

Effet sonodynamique in vitro de N₂ O-mbs améliore l'efficacité du traitement HIFU

Un système HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, Chine) composé d'une unité d'échographie diagnostique, d'une unité d'échographie thérapeutique et d'un système de traitement central a été utilisé comme décrit précédemment [29]. Les paramètres HIFU utilisés à des fins de traitement ont été fixés comme suit :fréquence de travail, 0,94 MHz; distance focale, 140 mm; diamètre, 220 mm; et fréquence du transducteur de diagnostic en temps réel, 3,5 MH. Les transducteurs intégrés ont été immergés dans de l'eau dégazée. Pour évaluer l'effet d'amélioration de N₂ O-mbs sur traitement HIFU, les cellules MDA-MB-231 ont été centrifugées, 5 × 10 ⁵ /mL, et répartis en quatre groupes :le groupe témoin (sans traitement), Le groupe HIFU seul (125 W, 5 s), le HIFU-N₂ Groupe O-mbs uniquement, le HIFU-C₃ F₈ -mbs uniquement groupe. Ensuite, les différents traitements respectifs ont été effectués pour chaque groupe. Les cellules traitées ont été centrifugées et lavées avec du PBS, doublement colorées avec de l'Annexine V-FITC/PI et récoltées pour la cytométrie en flux. La sonde d'oxyde nitrique (NO) DAF-FM a été utilisée pour détecter le NO dans le surnageant de chaque groupe de traitement. Toutes les expériences ont été réalisées 3 fois. La MET a été utilisée pour identifier la morphologie ultrastructurale des cellules traitées. Après chaque traitement, les cellules traitées ont été immédiatement fixées avec 2% d'OsO₄ , déshydraté dans une série graduée d'alcool, et noyé à plat dans de l'Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Des coupes ultrafines (100 nm) ont été préparées, colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb, et examinées au microscope électronique.

Effet Sonodynamique Ex Vivo et In Vivo de N₂ O-mbs améliore l'efficacité de l'ablation HIFU

Des tissus frais de foie de bovin ont été achetés à l'abattoir local et utilisés dans les 12 heures suivant l'abattage. Du foie de bovin frais ex vivo avec peu de tissu conjonctif et moins de vaisseaux sanguins a été découpé en tranches de 10 cm × 5 cm × 5 cm et dégazé pendant 1 h à 37 °C. Les foies de bovins ont été divisés en trois groupes :C₃ F₈ -mbs groupe, N₂ Groupe O-mbs et groupe PBS. Tout d'abord, du foie de bovin fraîchement isolé a été placé dans un récipient contenant de l'eau désaérée. Ensuite, 200 L (1 × 10 ⁵ bulles/mL) de microbulles dans du PBS a été directement injecté dans le foie de bovin de la manière illustrée sur la figure 6a. Sous la direction d'un transducteur à ultrasons de diagnostic, le point focal HIFU a été positionné au site d'injection. Ensuite, le transducteur thérapeutique a été utilisé pour effectuer 5 s d'ablation à différentes puissances (100 W, 125 W, 150 W) sur le site d'injection du foie bovin. Enfin, le volume nécrotique coagulant de la zone cible dans le tissu hépatique bovin a été calculé en fonction de la longueur, de la largeur et de la profondeur maximales mesurées (mm) par l'équation suivante :V (mm ³ ) =π/6 × longueur × largeur × profondeur. De plus, la valeur de gris de la zone cible avant et après l'ablation HIFU dans chaque groupe a été enregistrée sur les images échographiques de diagnostic.

Vingt souris porteuses de tumeurs ont été réparties au hasard en quatre groupes (n =5 par groupe), dont un groupe témoin (sans aucun traitement), un groupe HIFU-PBS, un HIFU-C₃ F₈ -mbs groupe, et un HIFU–N₂ Groupe O-mbs. L'ablation de la tumeur par HIFU (125 W, 5 s) a été appliquée après que les souris ont reçu une injection intraveineuse de 200 L de C₃ F₈ -mbs groupe, N₂ O-mbs et PBS. La procédure d'ablation HIFU des tumeurs solides était similaire à celle du foie de bovin isolé ex vivo. Tout d'abord, les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital à 1 % (8 ml/kg). Le site tumoral de la souris a été inoculé dans un récipient contenant de l'eau désaérée. Sous la direction d'un transducteur à ultrasons de diagnostic, le point focal HIFU a été positionné au niveau du tissu tumoral. Les poids corporels des souris et le volume tumoral ont été enregistrés avec un intervalle de 3 jours. Enfin, toutes les souris ont été tuées 21 jours après le traitement et les tissus tumoraux ont été disséqués des souris, puis envoyés pour H&E, coloration de l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), marquage terminal de la désoxynucléotidyl transférase dUTP (TUNEL).

Analyse statistique

Toutes les données ont été présentées et analysées avec GraphPad Prism (version 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Les données sont exprimées en moyenne ± SD. Chaque expérience a été répétée au moins 3 fois. Les analyses statistiques ont été réalisées par ANOVA unidirectionnelle avec le post-test de Bonferroni (comparant tous les groupes) ou le post-test de Dunnett (comparant tous les groupes à un groupe témoin). Une valeur de p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Caractérisation de N₂ O-mbs

La préparation de N₂ O-mbs par la méthode d'oscillation mécanique modifiée donne une suspension blanc laiteux très stable (Fig. 1a). Le N₂ O-mbs n'a pas changé de manière significative dans la taille des particules et la morphologie après 72 h de stockage à température ambiante. Sous le microscope optique, N₂ Des O-mbs ont été observés avec une taille uniforme, une bonne dispersion et une stabilité élevée (Fig. 1b). La concentration de N₂ O-mbs était de 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ bulles/mL. Comme le montrent les images TEM (Fig. 1c), la taille de N₂ O-mbs était uniformément réparti et la taille moyenne était d'environ 450 nm. Le N₂ Les résultats de diffusion dynamique de la lumière O-mb ont révélé des diamètres hydrodynamiques de 458,1 ± 17,26 nm (indice de polydispersité =0,368 ; Fig. 1d), ce qui était cohérent avec les résultats MET. Le potentiel du N₂ O-mbs était de − 16,2 ± 0,35 mV (Fig. 1e) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1).

un Photographies de N₂ O-mbs dispersés dans de l'eau déminéralisée ; b image de N₂ O-mbs sous microscopie optique à fond clair ; c image au microscope électronique à transmission de N₂ O-mbs ; d distribution de taille de N₂ O-mbs ; e potentiel zêta apparent de N₂ O-mbs

Captation intracellulaire et biocompatibilité de N₂ O-mbs

La cytotoxicité de N₂ O-mbs contre des cellules in vitro a été étudié par la méthode CCK-8. Nous avons défini la viabilité cellulaire du groupe témoin à 100 %. Après 24 h d'incubation, les résultats de viabilité cellulaire n'ont montré aucune cytotoxicité significative vis-à-vis des cellules MDA-MB-231. Même à N₂ élevé Concentrations d'O-mb, la viabilité cellulaire est restée supérieure à 95 % (Fig. 2a). La cytotoxicité de N₂ O-mbs in vivo sur des souris nudes saines a été analysé. Comme le montre la figure 2b, l'analyse histopathologique des principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) a montré que N₂ O-mbs n'a pas causé de dommages toxiques importants aux souris. Ces résultats ont indiqué que N₂ Les O-mbs ont une biocompatibilité élevée.

un La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage CCK-8; b Coloration H&E des principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) chez des souris nude femelles en bonne santé avec ou sans le N₂ O-mbs ; c les images de a à d montrer la cellule en fond clair, les noyaux cellulaires colorés par DAPI, N₂ O-mbs colorés par DiI et les résultats fusionnés des trois images de fluorescence ; barre d'échelle =50 μm [NS aucune signification par rapport au groupe témoin (0 bulles/mL)]

L'absorption intracellulaire de N₂ O-mbs sur des temps d'incubation prolongés (2 h et 4 h) a été visualisé par CLSM. L'incubation de cellules avec du N₂ marqué DiI O-mbs a entraîné l'accumulation d'un grand nombre de N₂ O-mbs dans la membrane et le cytoplasme des cellules cancéreuses. Comme le montre la figure 2c, il y avait une bonne colocalisation du N₂ rouge fluorescent O-mbs avec les cellules fluorescentes bleues. Ce résultat suggère que N₂ Les O-mbs sont efficacement internalisés dans les cellules cancéreuses MDA-MB-231.

Effet sonodynamique de N₂ O-mbs In Vitro

SOSG est une sonde de détection d'oxygène singulet couramment utilisée qui est très sensible et fiable pour la détection de la génération de radicaux libres d'oxygène. Pour explorer le potentiel de N₂ O-mbs en tant que sonosensibilisateur, la SOSG a été utilisée pour détecter la génération de ROS in vitro [30, 31]. SOSG se combine avec ¹ O₂ pour former SOSG-EP, qui se caractérise par une augmentation de l'intensité de fluorescence. Comme le montre la figure 3a, après irradiation par ultrasons d'une solution de SOSG contenant du N₂ O-mbs, la valeur d'intensité de fluorescence a augmenté de manière significative; par rapport à celle du reste des groupes, la production de radicaux libres d'oxygène a été significativement augmentée (p <0,01).

un Spectre de fluorescence de SOSG avec N₂ O-mbs irradiés par LIFU ; b la viabilité cellulaire a été déterminée par dosage CCK8; c images confocales de la génération de ROS intracellulaires (la fluorescence verte indique une coloration positive pour les ROS colorées au DCFH-DA) ; d la valeur d'intensité de fluorescence moyenne (DCFH-DA) de chaque groupe calculée par Image J. (Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SD, n =5 par groupe, *p <0,05, comparé à LIFU–C₃ F₈ -mbs groupe)

En plus de la détection de la génération de ROS en solution aqueuse après irradiation ultrasonore de N₂ O-mbs, un kit de dosage DCFH-DA ROS a été utilisé pour déterminer la production intracellulaire de ROS par N₂ O-mbs. Comme le montre la figure 3b, le groupe témoin positif a démontré la plus forte intensité de fluorescence. Le prochain signal de fluorescence verte le plus fort n'est apparu que dans le LIFU-N₂ Groupe O-mbs, révélant la production conséquente de ROS en présence simultanée de N₂ Irradiation O-mbs et LIFU. Cependant, aucune fluorescence évidente n'a été détectée dans aucun des groupes restants (Fig. 3c). La viabilité cellulaire du groupe témoin a été définie comme 100 %. Les résultats du test CCK-8 ont montré environ 46% de mort cellulaire dans le LIFU-N₂ Groupe O-mbs (Fig. 3d). La cytotoxicité de N₂ O-mbs en combinaison avec LIFU a été évalué par observation CLSM de la mort cellulaire après traitement. La CAM a été utilisée pour colorer les cellules vivantes avec une fluorescence verte. PI a été utilisé pour colorer les cellules mortes avec une fluorescence rouge. Comme le montre la figure 4a, il y avait de nombreuses cellules mortes dans le LIFU-N₂ Groupe O-mbs. De plus, les résultats de la cytométrie en flux ont montré que le taux d'apoptose du groupe de cellules MDA-MB-231 était significativement plus élevé que celui des autres groupes (p <0,05) après le N₂ combiné O-mbs avec traitement LIFU (Fig. 4b). Le combiné C₃ F₈ -mbs avec le traitement LIFU n'a pas causé de mort cellulaire ou d'apoptose évidente. Les résultats ont en outre indiqué qu'une apoptose et une nécrose étendues se sont produites en réponse au SDT. Les résultats de la cytométrie en flux étaient cohérents avec ceux du CLSM. Ces résultats indiquent que N₂ Les O-mbs combinés au LIFU induisent l'apoptose des cellules tumorales in vitro (Fichier supplémentaire 2 :Figure S2 ; Fichier supplémentaire 3 :Figure S3).

un Analyse par cytométrie de flux de l'apoptose et de la nécrose des cellules tumorales ; b images confocales de cellules MDA-MB-231 co-colorées CAM/PI après divers traitements. Les barres d'échelle sont de 100 μm

Évaluation de l'effet synergique in vitro HIFU dans les cellules cancéreuses

Les résultats de la cytométrie en flux sont présentés sur la figure 5a. Les deux N₂ O-mbs et C₃ F₈ -mbs a augmenté la mortalité des cellules MDA-MB-231 après ablation HIFU. De plus, par rapport à HIFU-C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs a significativement augmenté l'apoptose de MDA-MB-231 (p <0,05 ; Fig. 5b). Les résultats du test NO ont montré que l'intensité de fluorescence du surnageant du HIFU-N₂ Le groupe O-mbs était également significativement plus élevé que celui des autres groupes (p <0,05) (Fig. 5c). Des changements dans le cytoplasme et les organites ont été observés par MET (Fig. 5d). La cellule du groupe témoin (sans aucun traitement) présentait une morphologie cellulaire complète. De grandes quantités de substances vacuolaires ont été trouvées dans le cytoplasme des cellules du groupe HIFU. Mais les cellules ont toujours des membranes cellulaires complètes et des membranes nucléaires. Cependant, à la fois le HIFU–N₂ Groupe O-mbs et HIFU–C₃ F₈ -mbs a montré une perte d'intégrité de la membrane cellulaire et une désintégration complète de la structure cellulaire. Il convient de mentionner que les observations MET n'étaient que le moment du processus de mort cellulaire et d'apoptose après le traitement dans chaque groupe. N₂ Les O-mbs en tant que microbulles exogènes ont un effet évidemment synergique sur le traitement HIFU. Dans le HIFU–N₂ Groupe O-mbs, l'effet sonodynamique de N₂ O-mbs pourrait favoriser plus d'apoptose cellulaire. Les résultats ont été validés à la fois dans la détection par cytométrie en flux et dans l'expérience in vivo (Fichier supplémentaire 4 : Figure S4 ; Fichier supplémentaire 5 : Figure S5)

un Résultats du test de liaison à l'annexine V-FITC/PI ; b le taux moyen d'apoptose cellulaire dans chaque groupe ; c analyse quantitative de la génération de NO de N₂ O-mbs irradiés par HIFU ; d Image de microscopie électronique à transmission de cellules. Les barres d'échelle sont de 100 µm. (Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SD, n =5 par groupe, *p <0,05, par rapport au témoin, HIFU , HIFU–C₃ F₈ -mbs groupes)

N₂ O-mbs en tant que synergiste pour la thérapie HIFU

Après ablation par HIFU du foie de bovin isolé, une région nécrosée coagulante gris-blanc est apparue dans la zone ciblée (Fig. 6b). Les changements d'intensité moyenne de l'écho dans la zone cible avant et après HIFU sont illustrés à la Fig. 6c. Compared with those of the PBS group, the target echo intensity values of the C₃ F₈ -mbs group and the N₂ O-mbs group were significantly increased after HIFU treatment (p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

un Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; b photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; e quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

un Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; b H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Discussion

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. The N₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ and O₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:

The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO ^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Conclusion

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Disponibilité des données et des matériaux

The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.

Abréviations

N₂ O-mbs:

N₂ O microbubbles

C₃ F₈ -mbs:

C₃ F₈ microbubbles

HIFU:

high-intensity focused ultrasound

LIFU:

low-intensity focused ultrasound

SOSG:

singlet oxygen sensor green

SDT:

sonodynamic therapy

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescin diacetate

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

confocal laser scanning microscopy

TEM :

transmission electron microscope

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

FBS:

fetal bovine serum

PBS :

phosphate-buffered saline

DI:

deionized water

ROI:

regions of interest

ROS:

reactive oxygen species

NO:

nitric oxide