Synthèse de nanoparticules d'or à l'aide d'extrait de mimosa tenuiflora, évaluations de la cytotoxicité, de l'absorption cellulaire et de la catalyse

Introduction

La biosynthèse à médiation végétale des nanomatériaux est une méthode écologique qui permet la synthèse de NP dans un processus en un seul pot. En effet, les mêmes agents bio-réducteurs des extraits de plantes agissent comme agents stabilisants pour les particules formées avec un faible taux de composés toxiques [1,2,3]. En ce sens, Mimosa tenuiflora (Mt) l'écorce a une teneur élevée en tanins condensés qui ont une structure de quatre unités flavonoïdes [4], des saponines, du glucose, des alcaloïdes (N ,N -diméthyltryptamine) et l'amidon [5,6,7,8]. Ces composés (tanins condensés) peuvent agir comme agents réducteurs d'ions métalliques, mais en particulier, le flavonoïde a été associé à une complexation des métaux [4].

L'extrait éthanolique de Mt a été utilisé comme agent antibactérien pour les Gram négatifs, les Gram positifs et la levure [9]. Aussi, comme antiprotozoaire (utilisant les flavonoïdes des feuilles et des fleurs de Mt) [10] et sur la régénération cutanée [6]. De plus, il a le potentiel de guérir les ulcères cutanés sévères, dont les propriétés ont été attribuées aux molécules et aux polyphénols de l'écorce de Mt [11]. Les extraits de plantes présentent des propriétés antioxydantes et contiennent notamment des polyphénols utilisés dans la synthèse verte de NP métalliques telles que Au, Ag, Fe, Pt, Pd, Cu, leurs alliages et oxydes [12, 13]. Les propriétés optiques des systèmes NP, en tant que fréquence de résonance de la résonance plasmonique de surface (SPR), dépendent non seulement des caractéristiques intrinsèques des nanomatériaux (taille, forme, constante diélectrique), mais aussi des propriétés de l'environnement qui entourent les NP, en tant que solvant où ils se trouvent. dispersées ou nature de molécules stabilisantes, qui couvrent les NPs. Ces paramètres sont décisifs pour définir la position maximale de la SPR dans les systèmes NP [14,15,16].

D'une part, les propriétés catalytiques des AuNPs ont été rapportées dans plusieurs travaux, liées à la dégradation de composés organiques tels que les pesticides, les composés phénoliques et les colorants [17,18,19] et sont utilisées dans les processus catalytiques liés à la dépollution de l'environnement, par exemple, comme le nettoyage de l'eau contaminée [20]. Plusieurs rapports ont émergé ces dernières années sur les AuNPs synthétisés avec des extraits de plantes comme la cardamome noire [21] et des évaluations d'activité catalytique dans la dégradation des colorants utilisés dans l'industrie, tels que le bleu de méthylène (MB) [22], le méthyl orange [19] ou la Rhodamine B [23]. Cependant, dans le sens inverse, certains articles ont rapporté que les NP recouvertes de molécules stabilisatrices présentaient une faible activité catalytique en raison des sites disponibles pour la catalyse sur la surface des NP qui était occupée par des molécules organiques [24, 25]. En outre, les AuNP ont été utilisés comme capteurs moléculaires, tels que la détection colorimétrique d'ions métalliques toxiques [7] et des applications théragnostiques (thérapeutiques et diagnostiques) [26].

Les AuNPs fonctionnalisés avec des molécules à la surface présentent des propriétés optiques et biologiques associées à la composition, l'épaisseur, l'organisation et la conformation qui définissent leurs caractéristiques [27]. La nanotechnologie présente divers défis, tels que l'agrégation d'AuNPs dans le sang [28]. Les AuNPs à une concentration inférieure à 20 μg/mL et avec une taille autour de 20 nm ne montrent pas d'effets cytotoxiques dans les lignées cellulaires saines et cancéreuses, et leur utilisation a permis d'analyser l'interaction entre les NPs et les cellules [13, 29, 30]. Ensuite, les nanotechnologies offrent une possibilité d'interagir à la même échelle des récepteurs cellulaires [31] qui permettent de connaître les processus cellulaires [32, 33] et les propriétés antimicrobiennes [34], par exemple, dans le stress oxydatif qui génère une cascade de signalisation pour différents effets, tels que la cytotoxicité ou la réponse de défense antioxydante [35]. De plus, les AuNP fonctionnalisés agissent comme véhicule de transport de médicaments, de gènes ou de protéines [36] et d'applications biomédicales [37, 38]. Plus encore, les ligands AuNPs en tant que protéines et polymères génèrent un environnement chimique qui favorise l'internalisation des NPs pour atteindre le cytoplasme, le noyau, ou rester à l'extérieur de la membrane [39].

Dans ce travail, les AuNPs ont été synthétisés à l'aide d'un riche extrait d'écorce de Mt polyphénolique. La cytotoxicité de l'AuMt a été évaluée dans les cellules HUVEC et l'internalisation cellulaire a été contrôlée par microscopie confocale à 24h. Activité catalytique AuMt sur la dégradation du MB, en présence de borohydrure de sodium (NaBH₄ ) à température ambiante, a été évalué. Nos résultats ont été comparés par rapport à des travaux similaires de catalyse avec des AuNPs synthétisés par des méthodes « vertes ».

Matériaux et méthodes

Matériaux et produits chimiques

Pour la synthèse d'AuMt, 15 µg d'écorce d'arbre Mt ont été coupés en morceaux et placés dans un flacon de 100 ml. Soixante-dix millilitres d'éthanol (Fermont, pur à 99%) et 30 mL d'eau ultrapure (18 MΩ, Millipore) ont été ajoutés, puis il a été recouvert d'aluminium et laissé à température ambiante pendant 15 jours. La solution a été filtrée en utilisant du papier filtre Whatman (8 μm) et plus tard avec un acrodisque (0,20 μm). La solution obtenue a été utilisée comme agent réducteur (extrait de Mt) pour la synthèse d'AuMt. Une partie du filtrat a été roto-évaporée puis lyophilisée pour le dosage du DPPH et des polyphénols totaux et pour construire une courbe d'étalonnage de l'extrait de Mt. La concentration d'extrait de Mt était de 32,5  mg/mL, déterminée à partir d'une courbe d'étalonnage. Acide tétrachloroaurique (HAuCl₄ , Sigma-Aldrich pur à 99 %) a été utilisé comme précurseur métallique. Les concentrations de précurseurs utilisés dans la synthèse étaient de 5,3 mM pour AuMt1 et de 2,6  mM pour AuMt2. Le volume d'agent réducteur a été maintenu constant (1,6 mL) et le volume total de l'échantillon a été complété à 6 mL avec de l'eau ultrapure. Fichier supplémentaire 1 :le tableau S1 présente les formulations utilisées dans la synthèse d'AuMt1 et d'AuMt2 ainsi que les valeurs de pH pour chaque réactif. La synthèse a été réalisée à 25°C dans des conditions d'éclairage de laboratoire. Le protocole utilisé était le suivant. Dans un tube de 50 mL, la solution d'extrait de Mt est ajoutée suivie de l'eau ultrapure, et enfin, de la solution de précurseur d'or, en agitant immédiatement dans le vortex à 3000 rpm pendant 10 s. La synthèse des AuMtNPs a été confirmée visuellement en quelques minutes par le changement de coloration du mélange. Le processus de nettoyage des NP consiste à centrifuger la suspension à 14 000 tr/min pendant 1 h, à éliminer le surnageant, à ajouter de l'eau et à disperser par sonication, en répétant le processus deux fois. Après ajout d'éthanol, les AuMt sont à nouveau dispersés par sonication et centrifugés à 14 000 rpm pendant 1 h. Le surnageant est jeté et précipité et est séché dans un four à une température de 40°C. Ensuite, le nanocomposite obtenu est composé d'AuNPs avec des molécules d'extrait de Mt en surface.

Changement de pH en fonction du temps de la synthèse AuMtNP

Le pH de la synthèse d'AuMtNP a été mesuré au fur et à mesure de la réaction. Pour cela, un pH/Conductivité Benchtop Meter multi-paramètres (Orion™ VERSA STAR™) a été utilisé. L'instrument a été étalonné à 25 °C en utilisant une solution standard de référence tampon pour l'étalonnage à pH =4,01. Un bain de recirculation a été utilisé pour contrôler la température des échantillons à 25 °C (± 0,1 °C) dans toutes les mesures. Le pH a été mesuré pendant que la réaction était effectuée pendant 180 µs immédiatement après le mélange des réactifs. Le même appareil a été utilisé pour la mesure du pH des réactifs.

Spectres UV-Vis, 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) et dosage des polyphénols totaux

Un spectromètre UV/Vis Perkin-Elmer Lambda 40 à double faisceau a été utilisé pour obtenir le spectre UV-Vis de l'extrait, dans une plage de mesure de 200 à 400 nm, avec une vitesse de balayage de 240  nm/min. AuMt SPR a été surveillé entre 250 et 875 nm.

La cinétique de formation d'AuMt a été déterminée en mesurant l'absorbance à 550  nm chaque seconde tandis que la réaction de synthèse de NP se développait à l'intérieur de la cellule de quartz sous agitation magnéto.

Pour les dosages DPPH, tous les tests ont été effectués en triple. Différentes concentrations d'extrait de Mt (25, 12,5, 6,25 et 3,125  μg/mL) ont été testées. Cent microlitres d'éthanol ont été ajoutés à 100 L de chaque concentration, en plus de la solution de DPPH (300 M). Par la suite, les échantillons ont été incubés pendant 2 h dans l'obscurité avant de mesurer l'absorbance à 517  nm. Les résultats ont été comparés à la vitamine C et aux catéchines (70 µmol/L), et les deux molécules ont été utilisées comme témoins. Pour l'activité de piégeage, le radical DPPH dissous sur l'éthanol a été utilisé comme blanc [40, 41]. Le pourcentage d'activité de balayage a été calculé avec l'équation. (1).

où Un échantillon est l'absorbance de l'échantillon et Un contrôle est l'absorbance à blanc. Les données ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance (ANOVA) avec des tests de comparaison multiple de Tukey.

Pour le dosage des polyphénols totaux, les mêmes concentrations ont été utilisées en ajoutant du Folin-Ciocalteu à 0,25 N et du carbonate de sodium à 5% avec une incubation de 1h en l'absence de lumière. L'absorbance a été mesurée à 750  nm. Les résultats sont exprimés en équivalents d'acide gallique [42, 43].

Détermination du potentiel Zeta et de la taille DLS

Le potentiel zêta (ζ) des NP a été mesuré avec Zetasizer NS (Malvern, PA), et les tailles ont été mesurées par diffusion dynamique de la lumière (DLS) de Zetasizer NS (résolution de 0,5 nm). L'instrument calcule le en déterminant la mobilité électrophorétique (μ _e ) en utilisant l'équation d'Henry. (2) [44] :

où ε , η , et f (ka) désignent respectivement la constante diélectrique du média, la viscosité du média et la fonction de Henry. Deux valeurs sont généralement utilisées comme approximations pour le f (ka) détermination, soit 1,5 ou 1,0. Les déterminations électrophorétiques de sont les plus couramment effectuées dans un solvant aqueux et une concentration d'électrolyte modérée. f (ka), dans ce cas, prend la valeur de 1,5 et est appelée l'approximation classique de Smoluchowski, Eq. (3) [45].

Les échantillons ont été placés dans une cellule capillaire pliée en forme de U pour ζ des mesures. Chaque échantillon a été mesuré à température ambiante (25°C) en triple.

Évaluation de la stabilité des NP dans un milieu de culture supplémenté (s-DMEM)

La stabilité AuMtNP a été évaluée dans s-DMEM par DLS et ζ . Le diamètre hydrodynamique (2R_H ) d'AuMt1 et AuMt2 a été mesurée à 37 °C dans de l'eau ultrapure et du s-DMEM à des concentrations comprises entre 25 et 200 μg/mL. Pour AuMt1 et AuMt2 dans le s-DMEM, ζ a été mesuré à 37°C pour établir si le milieu de culture modifie la charge de surface des NP. Des nanoparticules ont été ajoutées à un tube Eppendorf avec du s-DMEM préalablement thermalisé et agité dans le vortex à 3000 rpm pendant 30 s. L'incubation à 37 °C est maintenue pendant 15 min avant de prendre les mesures à la même température.

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

L'extrait de Mt et le FTIR AuMt ont été obtenus par un FTIR Perkin-Elmer Frontier en utilisant un échantillon solide. Le spectre a été obtenu en mode transmittance à une résolution de 2 cm ^− 1 , de 4500 à 500 cm ⁻¹ .

Spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS)

L'expérience XPS a été réalisée en utilisant un Perkin-Elmer (Modèle PHI 5100, résolution basée sur la FWHM du pic Ag3d5/2 0.80 eV, source XR anode double standard (Mg/Al), et 15 kV, 300 W, 20 mA ). Les analyses de balayage d'enquête ont été effectuées avec un taux de balayage de 0,5 eV/s. Pour les analyses à haute résolution, une vitesse de balayage de 0,025  eV/s a été utilisée.

Microscopie électronique à transmission (MET)

Pour la MET, 10 μL de l'échantillon ont été déposés sur des grilles de cuivre recouvertes d'un film de fomvar-carbone (Electron Microscopy Sciences, 300 Mesh). Les grilles sont laissées à sécher pendant 1 h et placées dans une chambre à vide pendant 12 h. L'équipement de microscopie électronique est un Jeol 2010 F à émission de champ fonctionnant à 200 keV. La spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDS) est un détecteur Bruker Quantax 200, refroidi par Peltier, et couplé au système TEM. Les espacements interplanaires des plans cristallins révélés par MET haute résolution (HRTEM) ont été déterminés par analyse numérique de micrographie (version 3.0 Gatan).

Diffraction des rayons X

Les données ont été recueillies à l'aide d'un système de diffractomètre Bruker D8 QUEST, équipé d'un monochromateur à miroir multicouche, et d'un tube scellé CuKα Microfocus (λ = 1.54178 Å). Les cadres ont été collectés à T = 300 K via des scans.

AuMt effet cytotoxique

L'effet cytotoxique de l'AuMt a été évalué dans les cellules HUVEC en utilisant le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazolyl-2)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les cellules ont été cultivées sur milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich), supplémenté avec 10 % de sérum bovin foetal (GibcoBRL) à 37 °C et 5 % de CO₂ . Les cellules HUVEC ont été comptées dans une chambre Neubauer et la viabilité a été déterminée par le test d'exclusion au bleu trypan (Sigma-Aldrich).

Pour le test MTT, les cellules ont été ajustées à 100 000 cellules/mL, et 100  μL par puits ont été placés dans des plaques à 96 puits. AuMt1 et AuMt2 ont été évalués à des concentrations de 200, 100, 50 et 25 g/mL. Les cellules traitées ont été incubées pendant 24 et 48 h à 37 °C, 5% de CO₂ . Après le temps d'incubation, la plaque a été lavée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une solution de MTT a été ajoutée et incubée pendant 4 h. Du diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté pour dissoudre les cristaux de MTT. L'absorbance a été mesurée à 570 nm sur un lecteur de plaques multimode (Synergy HTX, BioTek), en utilisant le logiciel Gen5. La viabilité cellulaire a été calculée en utilisant l'équation. (4) :

où Un échantillon est l'absorbance de l'échantillon et Un contrôle est l'absorbance du blanc [46, 47].

Analyse statistique

Les données sont exprimées sous forme de moyennes  ± déviations standard (SD). Les différences significatives entre les groupes ont été analysées par le test de Tukey, ANOVA à un facteur, le cas échéant. P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Le logiciel Origin Pro 9.1 est utilisé pour la gestion des données, l'analyse statistique et la génération de graphiques. Les signes utilisés sont *p < 0,05. Les performances avec le traitement (AuMt1 et AuMt2) et le groupe témoin pendant 24 et 48 h ont été comparées.

Pour le test vivant/mort, les cellules HUVEC ont été ensemencées sur des lames de verre et traitées avec AuMt1 et AuMt2. Après 24 h d'incubation, les lames ont été colorées à l'aide d'un kit de viabilité/cytotoxicité vivant/mort (ThermoFisher) selon les recommandations du fabricant. Les échantillons ont été observés par microscopie confocale à balayage laser (CLSM800, Carl Zeiss).

Microscopie confocale à balayage laser :fluorescence de l'AuMt

L'analyse en microscopie confocale a été réalisée dans un appareil LSM 800 (Carl Zeiss, Jena Allemagne) monté sur un microscope inversé Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Jena Allemagne). Trois lasers de 405, 488 et 640 nm, avec une puissance maximale respective de 5, 10 et 5  mW, ont été utilisés pour l'étude. La fluorescence a été collectée à l'aide de détecteurs GaAsP hautement sensibles. Des images en fond clair ont été obtenues par une collection de lumière laser transmise sur tube photomultiplicateur (PMT). Pour la fluorescence AuMt, le test live/dead et la distribution NP sur l'étude des cellules HUVEC, un objectif sec Plan-Apochromatic ×  40/0,95 a été utilisé. Pour les cellules de reconstruction 3D avec AuMt, un objectif à huile Plan-Aprochromatic × 63/1,40 a été utilisé.

Pour la caractérisation de fluorescence AuMt, une goutte de 20 μL de dispersion colloïdale de NP a été déposée dans un couvercle en verre et séchée à température ambiante avant une analyse par CLSM. Un laser de 640 nm a été utilisé comme source d'excitation à 0,5% de puissance, et la fluorescence a été collectée entre 650 et 670  nm. Des images AuMt en fond clair ont été formées à l'aide d'un laser à 488 nm (0,2 % de puissance) en mode lumière transmise. La fluorescence et le champ clair ont été collectés sur des pistes séparées.

Internalisation cellulaire

Pour l'internalisation de l'AuMt sur les cellules HUVEC, le noyau a été coloré au 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) et les fibres d'actine avec un anticorps anti-β actine couplé à la fluorescéine-5-isothiocynate (FITC) pour délimiter la frontière cellulaire . Le DAPI était excité avec un laser de 405 nm à 1,0 % de puissance et le FITC avec un laser de 488 nm à 0,20 %. Les émissions de DAPI et d'anticorps anti-actine ont été collectées entre 410 et 500 nm et 500-700 nm, respectivement. Les AuMt ont été excités avec un laser de 640  nm (0,50 % de puissance) et l'émission a été collectée entre 650 et 700  nm.

Des reconstructions 3D de cellules-AuMt et des projections orthogonales ont été réalisées à partir de 30 images en mode Z-stack (total Z longueur = 8 μm), recueillant la fluorescence de DAPI, FITC et AuMt comme décrit ci-dessus. Les signaux fluorescents ont été collectés sur des pistes séparées pour chaque Z position. Pour plus de clarté, le signal FITC a été omis sur une reconstruction 3D.

Une comparaison relative de l'absorption cellulaire des nanoparticules a été réalisée. Pour cela, l'intensité moyenne de fluorescence d'AuMt1 et AuMt2 dans les cellules HUVEC a été déterminée à partir de l'analyse d'images confocales à l'aide du logiciel ImageJ [48].

Catalyse

Activité catalytique sur MB, à une concentration de 3,33 × 10 ⁻⁵ M, a été analysé par spectroscopie UV-Vis. En catalyse homogène, 90 μL de NPs (2 mg/mL) ont été ajoutés directement dans la cellule de quartz qui contient MB et 200 μL de NaBH₄ à une concentration de 100 mM. L'échantillon a été homogénéisé par agitation magnétique à l'intérieur de la cellule du spectrophotomètre. La réaction a été effectuée à 25°C.

Résultats et discussions

Synthèse

Par inspection visuelle, il a été détecté que la synthèse des NPs est très rapide dans les deux systèmes. La couleur la plus intense du système AuMt1 montrée dans l'encart du fichier supplémentaire 1 :la figure S1 indique un contenu plus élevé de NP de cette synthèse. En effet, AuMt1 a une double concentration de précurseur métallique par rapport à AuMt2. Dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S1, les réactifs utilisés dans la synthèse de nanoparticules ont un pH acide. Fichier supplémentaire 1 : La figure S1 montre les changements de pH des réactions au fur et à mesure que les synthèses d'AuMtNPs sont effectuées. Les réactions commencent dans un environnement acide (pH < 2,65), et au fur et à mesure que la synthèse des NP se développe, l'acidité augmente. Cela est dû à la déprotonation des groupes hydroxyle présents dans les molécules polyphénoliques de l'extrait de Mt. En fait, il s'agit de la première étape d'un processus de réduction d'oxyde qui entraîne le transfert d'électrons du groupe hydroxyle déprotoné vers Au ³⁺ ions. En tant que produits de la réaction de réduction d'oxyde, Au ³⁺ les ions sont réduits en atomes métalliques Au ⁰ et l'anneau polyphénolique qui apporte 2 électrons est oxydé. Le processus est décrit dans l'encart du fichier supplémentaire 1 :Figure S1.

Dosages des spectres UV-Vis, DPPH et polyphénols totaux

Le spectre UV-Vis de l'extrait d'écorce de Mt est illustré à la Fig. 1a, où le signal consiste en une bande bien définie avec un maximum de 280  nm et une large de 50  nm. Ce spectre est très similaire à celui rapporté pour Rumex hymenosepalus extrait de racine, qui a une teneur élevée en composés polyphénoliques [49]. La détermination de la teneur en polyphénols dans l'extrait d'écorce de Mt est importante car ces molécules peuvent contribuer de manière significative en tant qu'agents réducteurs dans la synthèse des AuNPs, fournissant les électrons nécessaires à la réduction de Au ³⁺ ion en or métallique (Au ⁰ ). Une fois les NP formées, les composés polyphénoliques sont absorbés à leur surface, assurant la stabilité des nanomatériaux.

Caractérisation de l'extrait de Mt. un Extrait de Mt Spectre UV-Vis et b Inhibition de la DPPH avec analyse ANOVA unidirectionnelle (*p < 0,05)

Pour le dosage DPPH, il a été observé que pour 12,5 mg/L d'extrait de Mt, nous obtenions une inhibition de 50% (L50), à l'instar des valeurs rapportées pour la Vitamine C et les catéchines (46 et 58%, respectivement). Cela indique que l'extrait de Mt possède une capacité antioxydante très similaire aux composés purs utilisés comme témoins, Fig. 1b où des différences significatives (*p < 0,05) des valeurs de contrôle sont marqués d'un astérisque. La valeur de 425 mg/g obtenue à partir du dosage des polyphénols totaux indique que près de la moitié de la masse extraite est équivalente à de l'acide gallique. La capacité antioxydante élevée et la teneur élevée en polyphénols de l'extrait de Mt suggèrent qu'il peut être utilisé comme un bon agent réducteur et stabilisant pour la synthèse de nanomatériaux dans le cadre d'une chimie durable [50, 51].

Caractérisation

Cinétique de formation et spectre UV-Vis AuMt

La figure 2a montre une évolution temporelle de l'absorbance sur un pic SPR d'AuNPs (550 et 560  nm pour AuMt1 et AuMt2, respectivement) au fur et à mesure que la réaction de synthèse de nanomatériaux a lieu. Les données expérimentales correspondent à la fonction sigmoïde de Boltzmann [52], où au moins trois stades de croissance sont observés. Dans le premier, l'absorbance croît lentement au début de la réaction de synthèse lorsque Au ³⁺ les ions sont réduits à Au ⁰ et forment des agrégats de quelques atomes qui se rejoignent pour former de petits NP. Dans la deuxième étape, les petites NP augmentent leur taille par croissance autocatalytique et l'absorbance croît rapidement. Dans la dernière étape, dans la recristallisation NP, l'absorbance atteint sa phase stationnaire. Comme on peut le voir sur la Fig. 2, une absorbance maximale est atteinte en 60 s pour AuMt1 et 120 s pour AuMt2. Fait intéressant, le premier stade de croissance est de 20 s pour AuMt1, alors qu'il est presque nul (moins de 1 s) pour AuMt2, ce qui s'explique par la proportion plus élevée de molécules réductrices (extrait de Mt) par rapport au précurseur métallique. Ceci favorise la formation rapide du noyau dans les NP d'AuMt2 par rapport à AuMt1; néanmoins, la prochaine étape de croissance des NP est faible pour AuMt2, et des NP de plus grande taille sont obtenues. Il a été rapporté que la synthèse d'AuNPs, utilisant le maltose et le tween80 comme stabilisants, montre une cinétique de croissance avec un temps de réaction très similaire à celui rapporté dans ce travail [53]. Dans un autre rapport de synthèse verte [54], il est souligné que la plus faible proportion d'agents réducteurs/précurseurs génère des NP de plus petite taille.

Caractérisation UV-Vis des AuMt1 et AuMt2. un Formation cinétique et b Spectres UV-Vis

La figure 2b montre les spectres d'absorption caractéristiques de l'AuMt dans la région comprise entre 250 et 875  nm. SPR pour AuMt1 montre une bande symétrique avec une absorption maximale à 550 nm et large de 200 nm. Le pic de plasmon AuMt2 subit un léger décalage vers le rouge localisé maintenant à 560 nm avec une bande asymétrique et une largeur supérieure à 300 nm, ce qui est dû à la différence de tailles entre les deux nanomatériaux (d_AuMt1 AuMt2 )_{1 2} . Un comportement similaire a été rapporté dans la synthèse d'AuNPs avec du citratum de sodium comme agent réducteur, où le décalage vers le rouge et l'élargissement du plasmon sont attribués à des modes d'oscillation plus élevés qui affectent la section efficace d'extinction en augmentant la taille des NP [55]. De plus, les deux spectres montrent la bande d'absorption à 280 nm correspondant aux molécules polyphénoliques de l'extrait, ce qui suggère que l'extrait de Mt agit comme un stabilisateur des AuMtNPs.

Taille, potentiel Zeta et stabilité des AuMtNPs

Les tailles AuMtNP par DLS et le potentiel Z ont été testées dans différentes conditions pour une concentration (50 μg/mL) comme indiqué dans le tableau 1. AuMt1 et AuMt2 ont montré des valeurs négatives élevées (≤ 30 mV) dans l'eau, qui favorisent la stabilité électrostatique des deux nanoparticules systèmes. Selon Qu et al. [56], ζ la valeur augmente progressivement avec la taille de NP ; dans notre cas, AuMt1 a une taille plus petite que AuMt2 dans l'eau, une taille qui est contrôlée par la synthèse de NP. Ces valeurs de taille correspondent à NP ζ valeurs, où la valeur ζ la plus élevée correspond à NP de taille supérieure. Potentiels zêta (ζ ) des AuMtNPs dispersés dans le s-DMEM présentent des valeurs moins négatives par rapport à celles obtenues dans l'eau ultrapure (tableau 1). Cette réduction peut être attribuée aux cations présents dans le DMEM et aux protéines présentes dans le FBS qui recouvrent les surfaces AuMtNP qui provoquent une diminution des interactions électrostatiques. Malgré cela ζ réduction, la valeur reste proche de − 25 mV pour les deux systèmes ce qui indique que les nanoparticules conservent leur stabilité électrostatique après incubation du s-DMEM [57]. De plus, le tableau 1 montre les résultats obtenus par DLS pour les diamètres hydrodynamiques AuMtNP (2R_H ) mesurée à 37 °C dans de l'eau ultrapure et des milieux de culture. Dans le s-DMEM, la taille des deux systèmes a augmenté en raison de l'adsorption des protéines à la surface des nanoparticules [58]. Pour AuMt1, la croissance de 2R_H en raison de la couronne protéique est de 33,8 nm et pour AuMt2 est de 42,9 nm. On s'attend à ce que plus la taille des nanoparticules soit plus grande que la surface d'absorption des protéines [59]. Cela pourrait expliquer la valeur légèrement plus petite sur ζ pour AuMt2 par rapport à AuMt1 dans s-DMEM. Pour AuMt1 et AuMt2, l'interaction avec les protéines s-DMEM est due aux molécules d'extrait qui sont attachées à la surface des nanoparticules. Ces molécules diffèrent légèrement entre AuMt1 et AuMt2, comme le montrent les résultats XPS. Nous avons également mesuré le pH de solutions dans la même plage de concentration. Il a été constaté qu'il n'y a pas de changement de pH et dont la valeur moyenne était d'environ 7,5 pour l'AuMt dans l'eau ultrapure et 7,2 dans le s-DMEM (tableau 1).

Fichier supplémentaire 1 : La figure S2 montre les diamètres hydrodynamiques de l'AuMtNP lorsqu'il est dispersé dans de l'eau ultrapure et du s-DMEM à 37 °C, dans une plage de concentration comprise entre 25 et 200 μg/mL. Pour chaque système étudié, le diamètre hydrodynamique ne change pas avec la concentration de nanoparticules, et seulement pour, AuMt2 s-DMEM à 100 μg/mL, la taille des particules augmente par rapport à la concentration évaluée la plus faible, ce qui peut indiquer des processus d'agrégation de NP à ces concentrations [32].

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

Le spectre FTIR, illustré à la Fig. 3, correspond à l'extrait de Mt, AuMt1 et AuMt2. Les larges bandes caractéristiques centrées autour de 3250 cm ⁻¹ sont associés aux OH phénoliques provenant des tanins et des flavonoïdes principalement. Pics à 1594 cm ⁻¹ correspondent aux vibrations de flexion N-H, à 1705 cm ⁻¹ à l'étirement et à la région acycliques des cétones compris entre 1000 et 1300 cm ⁻¹ à l'étirement C–O. Pics compris entre 1600 et 500 cm ⁻¹ sont identifiés aux polyphénols, signaux à 1235 et 1160 cm ⁻¹ sont liés à l'étirement de la liaison C–O aromatique, et à 1020 cm ⁻¹ à l'étirement de la bande C–O aliphatique et à 1235 cm ⁻¹ sont spécifiquement liés à la caractéristique de la nature cyclique de l'éther. Ces signaux peuvent être associés aux composés les plus abondants dans l'extrait de Mt comme le tanin de Mimosa, la sakuranétine de flavone, les saponines triterpénoïdes, les chalcones et le N ,N -alcaloïde diméthyltryptamine (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3). Les échantillons AuMt1 et AuMt2 présentent les mêmes pics caractéristiques dans la région des polyphénols confirmant que les NPs sont stabilisées par les molécules d'extrait de Mt [60]. On observe un changement de 1331 cm ⁻¹ dans la bande de largeur et une diminution de l'intensité du pic pour l'AuMt1 et l'AuMt2 correspond à la liaison entre les AuNPs et le groupe C-H des polyphénols ; 1723 cm ⁻¹ est déplacé par oxydation des composés polyphénoliques en composés carboxyliques lors de la réduction de Au ³⁺ à Au ⁰ [51, 61, 62].

spectres FTIR. Extrait de Mt (vert), AuMt1 (noir) et AuMt2 (rouge)

Spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS)

Dans l'analyse du scan de l'enquête XPS pour AuMt1 et AuMt2, les échantillons ont clairement montré la présence d'oxygène (O 1s ), carbone (C 1s ) et l'or (Au 4f ), dont les pics sont centrés autour de 532, 284 et 85  eV, respectivement, comme le montrent les Fig. 4a, b. Des expériences XPS à haute résolution ont été réalisées pour établir une abondance relative de différents groupes fonctionnels de molécules qui recouvrent les surfaces AuNP. Au4f les spectres XPS haute résolution pour AuMt1 et AuMt2 se composent de deux pics symétriques séparés de 3,7  eV (Fig. 4b, e). Pics associés à 4f _5/2 spin-orbital coupling are located on binding energy (BE) of 88.6 and 87.7 eV for AuMt1 and AuMt2, respectively. For 4f 7/2, spin-orbital coupling peaks are located on 84.9 and 84.0 eV. The link of intensities (I4f _7/2  > I4f _5/2 ) and location and separation (ΔBE = 3.7 eV) between peaks confirm that gold ions (Au ³⁺ ) are reduced completely to metallic gold Au ⁰ [63]. Au4f signals, for AuMt1, are slightly shifted (~ 0.9 eV) at higher energies with respect to sample AuMt2. This can be explained in terms of NP size differences between samples. AuMt1 has a half population of NPs with size less to 40 nm, while AuMt2 NPs have a mean diameter of 150 nm, determined by TEM. Peak shift for Au4f signals, due to the presence of small NPs, has been reported by other authors who relate the Au4f BE increase with decreasing NP size [64, 65]. Also, the shift effect could be due to the interaction of functional groups capped on surfaces of AuNPs [66]. In Fig. 4c, f, the high-resolution XPS spectra of C1s are shown for AuMt1 and AuMt2. Spectra were deconvoluted by 3 Gaussian bands associated with C=O, C–O, and C–C or C=C. For AuMt1, peaks are centered on 286.9, 286.1, and 284.5 eV, for AuMt2 on 287.0, 286.3, and 284.7 eV, respectively. Comparing the experimental XPS curves for C 1s , we see appreciable differences between AuMt1 and AuMt2. The main difference comes from a significant decrease in AuMt1 of the signal associated with C–O group. Comparing the percentage contributions of each group, obtained from the deconvolutions (Additional file 1:Table S2), we see that in AuMt2 contribution of C–O signal is 27.8% while in AuMt1 is 16.6%. This difference can be explained in terms of the oxide-reduction reaction that gives rise to the process of AuNP formation. The synthesis of AuMt1 is added twice the metal precursor (HAuCl₄ is 0.01 M) than in synthesis of AuMt2. In both cases, the same amount of extract is used as a reducing agent, so in AuMt1, more hydroxyl groups (−C–OH) are consumed to reduce a greater number of Au ³⁺ ions. Thus, a decrease of C–O signal in AuMt1 confirms that hydroxyl groups participate in the synthesis reaction. High-resolution XPS of O 1s revealed that carbonyl C=O is the most abundant group (Additional file 1:Figure S4 and Table S2). In addition, the content of the C=O group is higher in the AuMt1 sample, which confirms what was previously discussed.

XPS spectra of AuMt1 and AuMt2. un , d Survey spectra, b , e Au4f high resolution, and c , f C1s high resolution

XPS and FTIR indicate that AuMtNPs interact mainly with carbonyl groups (ketones) in addition to hydroxyl groups of Mimosa tannins, saponins, and other molecules that participate in the reduction of Au ³⁺ à Au ⁰ and stabilization of AuMtNPs [63, 67, 68].

Transmission Electron Microscopy

AuMt1 TEM micrographs are shown in Fig. 5a, b and AuMt2 in Fig. 5d, e showing products’ shape distribution. AuMt1 has the biggest diversity in shapes. AuMt shape is determined by the relationship between the variation of metal precursor concentration and Mt extract at a fixed concentration. In this case, NPs were observed without cleaning the extract to observe the interaction that forms around the AuMt. As observed in the micrographs, an extract is placed on the surface; however, NPs are kept dispersed and no aggregation is shown. Figure 5c, f show size distribution for each sample, and AuMt1 have an average size dispersion of 40 nm and AuMt2 of 150 nm.

Size distributions by TEM. un , b , c AuMt1 and d , e , f AuMt2

In Fig. 6a, AuMt TEM micrographs were also analyzed by EDS (Fig. 6b), which showed Au presence. Other chemical elements such as Cl, O, and Ca, on EDS spectrum, come from the extract that surrounds NPs. According to the crystallographic tab (JCPDS file:04-0784), the obtained distances between 2.35 and 2.03 Å (Fig. 6c) correspond to Au crystalline planes (111) and (200).

Nanostructural characterization of AuMt. un TEM, b EDS, c single HRTEM, and FFT and d XRD

X-ray Diffraction (XRD)

Figure 6d shows the characteristic AuMt XRD diffraction peak at 2Ɵ , which are in 38.17, 44.37, 64.81, and 77.66 ^o corresponding with the planes (111), (200), (220), and (311), respectively; these planes correspond with the face-centered cubic Au (space group Fm ³ m, JCPDS File No. 89-3722). High Score Plus and Origin software were used for the analysis [69].

Biological Tests

Cytotoxicity by MTT and Live/Dead Assay

To evaluate AuMt1 and AuMt2 toxicity, tests were performed on HUVEC cells using MTT. Four concentrations and two times for both materials were evaluated. In Fig. 7a, it is observed that at 24 h for AuMt1, cell viability decreases between 10 and 20%, only in concentrations higher than 25 μg/mL. For AuMt2, a similar effect is obtained in cell viability; however, the concentration of 100 μg/mL seems to have no effect on these tests. In Fig. 7b, MTT tests at 48 h for AuMt1 and AuMt2 are shown. For AuMt1, it is easy to notice that concentration with the greatest effect is 50 μg/mL, where the viability drops almost 30% compared to the control. The concentration of 50 μg/mL seems to be the concentration with the highest toxic effect; however, when the obtained data were analyzed, it is found that there is no significant difference between the obtained data on 24 and 48 h, a similar result obtained for 100 and 200 μg/mL, Fig. 7c. For AuMt2, a toxic effect between 20 and 30% is observed only on 100 and 200 μg/mL, while 25 and 50 μg/mL show no significant difference, compared to the observed effect at 24 h, Fig. 7d. This seems to correlate with AuMt2 size growth in s-DMEM (Additional file 1:Figure S2) where at a concentration of 100 μg/mL, they begin to aggregate. In the work published by Chandran et al. [70], they used gold nanoparticles coated with branched polyethyleneimine (BPEI), lipoic acid (LA), and polyethylene glycol (PEG), where they see an important toxicity in HUVEC cells by nanoparticles coated with BPEI, which have sizes of 40 and 80 nm, where viability is between 20 and 30%. When these particles are covered with human serum proteins, it is found that toxicity decreases; this is due to the corona effect. Recently, Zhaleh et al. [71] have reported the biogenic synthesis of 40-nm gold nanoparticles using leaf extracts from Gundelia tournefortii L. plant. Interestingly and in contrast to our results, the authors indicate that MTT cell viability tests for these particles in HUVEC, the cell viability was 95% at 1000 μg/mL; however, they do not establish if the low cytotoxicity is due to the fact that there is no material internalization or if the particles are harmless due to protein corona. In this sense, bioreductive compounds present in Gundelia tournefortii L extract are different from those reported for Mimosa tenuiflora extract (Additional file 1:Figure S3). Thus, the interactions of these two nanoparticle systems with proteins present in FBS are very different, which may explain the differences in cytotoxic responses.

Viability assay using MTT in HUVEC cell. un For 24 h and b 48 h. 0ne-way ANOVA analysis with (*p < 0,05). Comparison between 24 and 48 h for c AuMt1 and d AuMt2 with ANOVA analysis with Tukey tests (n.s. no significance and (*p  < 0.05))

As mentioned above, AuMt1at a 50-μg/mL concentration shows the highest toxicity and cellular uptake. We believe that toxicity may be due to the fact that the nanomaterial has a low affinity to s-DMEM proteins, since it has only 16.6% of hydroxyl groups on the surface to promote hydrogen bonding with S-DMEM proteins. The fact that the material toxicity decreases as AuMt1 concentration increases may be due to a cellular detoxification response, like an exocytosis caused by high intracellular content of gold [70]. For AuMt2, the toxicity effect at 100 and 200 μg/mL may be due to nanomaterial agglomeration, which could be attaching to the membrane causing adverse effects for the cells; however, more experiments are required to confirm this hypothesis.

Only one concentration (50 μg/mL) was chosen to be evaluated by live/dead fluorescent dye; this is due to the purpose of confirming the MTT results and later analyzing the metallic NP internalization in HUVEC cells, avoiding a field saturation by NPs. When cells were stained with live/dead fluorescent dye kit, it was found that a large part of the cell population favorably marked for calcein and just a few for ethidium homodimer, indicating that cell culture is viable, as shown in Fig. 8.

Live/dead assay in HUVEC cells. un , d , et g with calcein; b , e , et h with ethidium homodimer; et c , f , et i merge by confocal microscopy

Confocal Laser Scanning Microscopy:Fluorescence of AuMt

In Fig. 9a, d are shown micrographs of AuMt1 and AuMt2 in bright field and in Fig. 9b, e, their corresponding fluorescence, captured by confocal microscopy. Red fluorescence of AuMt (collected emission 650–700 nm) was excited employing 640 nm diode laser, and a mayor size of NPs can be appreciated in AuMt2 sample than AuMt1. In the merge images in Fig. 9c, f, it can be observed how the luminescence comes exclusively from the dark points associated with the NPs. This indicates that the cleaning process effectively removed the extract that is not complexed to the nanomaterial, so there is no background emission. It is interesting to observe that an intense fluorescence of the NPs captured by the confocal system is achieved at a very low excitation power of the laser (below 0.5 mW). So, this NPs system can be fluorescently traced efficiently in cellular systems with little risk of phototoxicity. Some authors have reported fluorescent emission about 610 nm, suggesting intrinsic Au fluorescence [72, 73]. AuNPs emission is related to the core size confinement effect that generates discreet electronic states [74]. However, in our case, the metal surface is covered with flavonoids, which show fluorescence, and when complexing with AuNPs, the fluorescence of both is enhanced. Different authors have reported that fluorescence is largely enhanced by charge transfer from the surface ligands to the metal core via S–Au bonds [75]. It has also been reported that ligands (thiol molecules, DNA oligonucleotides, dendrimers, polymers, peptides, and proteins) affect AuNPs optical and electronic properties since its fluorescent properties can be significantly affected by their surface chemistry [76].

AuMt1 and AuMt2 fluorescence. un , d Bright field. b , e Confocal. c , f Merge

Cellular Internalization

Cells were also analyzed, by confocal microscopy, after 24 h incubation, with AuMt1 and AuMt2 at a concentration of 50 μg/mL. The nucleus is shown in blue color using DAPI Fig. 10a, and the cytoskeleton structure was stained with anti-beta actin in green color Fig. 10b and merge Fig. 10c. The observed micrographs were obtained through 3 different channels on separate tracks, where the excitation wavelengths were 405, 488, and 640 nm for DAPI, anti-beta actin, and AuMt, respectively.

AuMt1 and AuMt2 cellular internalization. un , d , et g with DAPI; b , e , et h with beta-actin; et c , f , et i merge by confocal microscopy

As previously described, cells were also analyzed by confocal microscopy, for AuMt1 and AuMt2 internalization, at a concentration of 50 μg/mL. Confocal micrographs show that AuMt are internalized in HUVEC cells cytosolic space, and many of these particles are surrounding the nucleus, without being internalized in it. When not observing particles in the nucleus, a more meticulous analysis was carried out, by cell orthogonal projection and a 3-D reconstruction. Observing the micrographs of both reconstructions, it is possible to notice that AuMt is distributed differentially. In Fig. 11a, b for AuMt1, it can be observed that a material is dispersed in the cytoplasm, while in AuMt2, the material is concentrated in the nuclear periphery, as shown in Fig. 11c, d. We were not able to find NPs in the nucleus, and this suggests that the nanomaterial has little or no genotoxic potential, since it has no way of interacting with nuclear DNA, which is a quality for a nanocarrier. Efficient cellular uptake depends on NP size, shape, charge, and coating, the parameters that can affect their interactions with cell proteins. The fact that polyphenolic compounds are found on AuMt surface could facilitate the nanomaterial internalization, which would make it a candidate as a possible pharmacological nanocarrier [77,78,79].

Orthogonal projections and 3-D images. un , c AuMt1 and AuMt2 cellular internalization analysis through orthogonal projection and b , d 3-D reconstruction by confocal microscopy

The obtained results for an AuMtNP cellular uptake in HUVEC by a confocal microscopy at 50 μg/mL suggests that AuMt1 interacts with the cells in a greater quantity than AuMt2 in a 3:1 ratio, as seen in Additional file 1:Figures S5–S7. If we consider that protein corona in AuMt1 is 9.1 nm smaller than in AuMt2, we can suggest that AuMt1-efficient internalization by HUVEC cells is given by a combination of factors such as AuMt1 smaller size, the highest absolute value of z potential and the lower thickness of protein corona. This indicates a poor protein coverage that allows partial exposure of the nanoparticle surface, which is rich in extract molecules. Therefore, nanoparticles can interact by means of extract molecules with surface-specific membrane receptors that facilitate the internalization of AuMt1.

Catalytic Tests

Catalysis

Analysis of catalytic reaction was realized to calculate the degradation percentage ( %D) using the Eq. (5) :

using the A ₀ absorbance at t  = 0 and A is the absorbance at time t . Langmuir-Hinshelwood equation was used to calculate the slope of the regression plot \( \ln \left(\frac{A}{A_0}\right) \) versus irradiation time [80], which is expressed in Eq. (6) and K is the first-order rate constant of the degradation ratio:

For the analysis of catalytic activity on MB degradation, the absorbance at 660 nm was monitored. Figure 12 shows the AuMt1 and AuMt2 catalytic activity, where a decrease on maximum absorption of MB is observed as time progresses Fig. 12a, d. MB degradation and its conversion to leucomethylene is confirmed by progressive decreases of the absorbance at 292, 614, and 660 nm correspond to MB and by the increase in time of the absorbance at 256 nm associated with leucomethylene. Homogeneous catalysis reaches a 50% MB degradation at 190 s Fig. 12b, while the degradation ratio K for the total process is 8.24 × 10 ⁻³ s to AuMt1 Fig. 11c. AuMt2 reaches a 50% of MB degradation in 400 s, Fig. 12e, and K takes the value of 3.54 × 10 ⁻³ /s, Fig. 12f.

AuMt1 and AuMt2 Catalysis. un , d UV-Vis spectra. b , e Percentage. c , f Ratio of MB degradation

On this way, AuMt1 have a more efficient response than AuMt2. We observed a size-dependent effect (AuMt) in degradation ratio [81], and a total surface area of NPs is inversely proportional to the NP size [37]. Table 2 shows a comparison between different green syntheses of AuNPs and their K obtained in size function.

Conclusions

In this work, we show for the first time that the extracts of bark of Mimosa tenuiflora allow the production at room temperature of gold nanoparticles by means of one-pot synthesis. AuNP sizes are easily controlled by regulating a metal precursor/reducing an extract ratio. It was observed that AuMt1 and AuMt2 cellular uptakes generate a moderate cytotoxic effect at 24 and 48 h post exposition. However, toxicity does not behave in a dose-dependent manner, which suggests different action mechanisms for AuMt1 and AuMt2. XPS and FTIR indicate that AuMtNPs interact mainly with carbonyl groups (ketones) in addition to hydroxyl groups of Mimosa tannins, saponins, and other molecules that participate in the reduction of Au ³⁺ à Au ⁰ and stabilization of nanomaterials. Polyphenols adsorbed on AuMtNPs facilitate nanoparticle internalization. AuMt2 were located near the nuclear periphery, but for AuMt1, it was observed that nanoparticles distribute on the whole cell and present a 3 fold uptake in comparison to AuMt2. Due to the fluorescence property at low excitation power and a high cellular uptake, AuMtNPs synthesized with Mt bark extracts are candidates for its implementation as drug nanocarriers and fluorescent probes in cells. However, other strategies must be addressed, in order to reduce the nanomaterial toxicity. Finally, it was observed that AuMtNPs showed a relevant catalytic activity on MB degradation using NaBH4 as a reducing agent.

Disponibilité des données et des matériaux

All datasets are presented in the main paper.

Abréviations

ANOVA :

Analysis of variance

AuMt:

Colloids formed by AuNPs and molecules of Mt

AuNPs:

Nanoparticules d'or

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

EDS :

Energy dispersive X-rays spectroscopy

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HAuCl₄ :

Tetracloroauric acid

HRTEM :

TEM haute résolution

HUVEC :

Human umbilical vein endothelial cells

Mo :

Bleu de méthylène

Mt:

Mimosa tenuiflora

MTT :

3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NaBH₄ :

Sodium borohydride

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PdI:

Indice de polydispersité

PMT:

Photomultiplier tube

ROI:

Region of interest

SD :

Standard deviations

SPR :

Résonance plasmonique de surface

TEM :

Microscopie électronique à transmission

UV-Vis :

Ultraviolet-visible

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

XRD :

Diffraction des rayons X