Outils de bioimagerie basés sur des microcapsules de polyélectrolyte codées avec des nanoparticules semi-conductrices fluorescentes :conception et caractérisation des propriétés fluorescentes

Résultats et discussion

Développement de microcapsules de polyélectrolyte codées QD

Nous avons utilisé la technique de dépôt couche par couche pour obtenir des agents de bio-imagerie sous forme de microparticules fluorescentes codées par QD car la méthode suggérée ne nécessitait pas de solvants organiques, permettait l'utilisation de polymères biocompatibles [23, 24] et assurait une immobilisation efficace des QDs dans la coque polymère [21]. La fabrication des microcapsules de polyélectrolyte fluorescentes optiquement codées avec des QD hydrosolubles et modifiés en surface consiste en l'application de cinq couches de polyélectrolyte de charge opposée sur la surface de microparticules de carbonate de calcium servant de matrices dans la première étape, suivie du codage de l'enveloppe de polyélectrolyte avec QD chargés, revêtement de la couche QD avec des couches protectrices de polyélectrolytes chargés de manière opposée, dissolution de la matrice centrale de la microparticule et, enfin, modification de la surface de la microcapsule avec du BSA (Fig. 1). La charge de surface négative des microparticules de carbonate de calcium assure l'adsorption des HAP en raison de l'interaction électrostatique du polycation avec la surface des microparticules. Le potentiel ζ positif de la surface résultant de l'adsorption des HAP sur les particules permet l'application ultérieure du polyanion PSS, ainsi que des QD modifiés avec du HS-PEG₁₂ -COOH, qui ont également une charge de surface négative en raison du groupe carboxyle et, par conséquent, peuvent être adsorbés sur la couche de polycation PAH. L'enrobage des QD dans la membrane polyélectrolyte polymérique est effectué en appliquant des couches de polyélectrolyte de revêtement supplémentaires (au moins quatre à six d'entre elles), comme le montrent les Fig. 1a, b.

La conception et la structure des microcapsules polyélectrolytiques codées avec des points quantiques (QD) :a Un diagramme schématique de l'arrangement des couches dans la membrane de microcapsule polymère. b Modifications du potentiel de la surface des microparticules de carbonate de calcium lors de la stratification des électrolytes polymères et du codage QD. c Une microphotographie fluorescente des microcapsules de polyélectrolyte codées avec des QD CdSe/ZnS solubilisés avec du HS-PEG₁₂ -COOH. * Les potentiels de la surface de la microcapsule après le retrait du noyau ; ** une étape supplémentaire dans la fabrication de microcapsules polyélectrolytiques codées QD avec une surface modifiée par BSA

Des microcapsules creuses contenant des QD immobilisés dans leur membrane polymère sont obtenues par dissolution des microparticules de carbonate de calcium avec de l'EDTA 0,2 M (pH 6,5) et formation du complexe hydrosoluble de sel de calcium de l'acide éthylènediaminetétraacétique, dont la diffusion à travers la membrane polymère entraîne la formation de cavités à l'intérieur des microcapsules. Pour obtenir des microcapsules polyélectrolytiques codées QD avec une surface modifiée par BSA, le polyanion PAA est déposé sur la 11ème couche du polycation PAH. Le PAA est utilisé en raison de sa valeur de constante de dissociation lors de l'interaction avec la surface de la microcapsule. La valeur du pKa du PAA (pKa ≈ 4,7) est plus faible et, par conséquent, plus acide par rapport au PSS (pKa ≈ 7,5) [25, 26], ce qui entraîne un potentiel ζ plus élevé de la surface de la microcapsule. La charge de la surface modifiée par le PAA facilite l'adsorption passive du BSA en raison de l'interaction électrostatique entre le BSA et le PAA. Cependant, l'assemblage entre le PAA et le BSA entraîne une diminution de la charge de surface négative des microcapsules (Fig. 1b). Après le dépôt de BSA sur la surface de la microcapsule, le blindage de la couche de PAA chargée négativement par des groupes amino électrostatiquement positifs de BSA se produit, par conséquent, le potentiel des microcapsules codées QD revêtues de BSA est probablement déterminé principalement par le comportement électrostatique de la BSA en tant que revêtement extérieur de microcapsules [26].

Les QD PEGylés hydrosolubles se caractérisent par une distribution de taille étroite, l'absence d'agrégats dans la dispersion et une stabilité colloïdale élevée. Cela est susceptible d'assurer une adsorption homogène des QD sur la surface des microbilles et de faciliter un codage efficace et, par conséquent, l'obtention de microcapsules fluorescentes brillantes (Fig. 1c).

L'utilisation de protéines, telles que la BSA, pour la modification de surface rend les microcapsules polymères plus biocompatibles et plus résistantes à l'adhésion les unes aux autres. Cela garantit également une passivation temporaire de la surface des microcapsules, ce qui est important pour l'étude ultérieure des microcapsules formées par les complexes interpolymères PAH-PSS ou PAH-PAA en termes d'interaction in vitro avec les cellules et de comportement in vivo [27,28,29] .

Les microcapsules codées QD obtenues sont sphériques (Fig. 1c) et se caractérisent par une distribution de taille étroite (Fig. 2) avec une taille moyenne de 4,45 ± 0,65 μm. Cette taille est comparable à celle des globules rouges, étant encore plus petite qu'elle [30]. De plus, comme indiqué précédemment, la membrane polymère des microcapsules est une structure souple sujette à la déformation. Injectées par voie intraveineuse, les microcapsules de cette taille ne peuvent pas traverser les barrières hémato-tissulaires, ce qui permet de suivre le transport et la distribution des microcapsules optiquement codées dans le corps [31, 32]. Cependant, dans les localisations avec une perméabilité accrue de la paroi des vaisseaux sanguins, par exemple, dans les zones d'inflammation et de croissance tumorale, les microcapsules peuvent pénétrer dans l'espace extravasculaire, ce qui devrait assurer l'imagerie et la surveillance de l'administration ciblée [33,34,35 ,36].

Distribution de la taille des microcapsules polyélectrolytiques codées optiquement avec des points quantiques, où le nombre de microcapsules analysées était de 600

Les caractéristiques de fluorescence et de structure des microcapsules de polyélectrolyte codées QD

Les microcapsules fabriquées sont caractérisées par un pic de fluorescence à une longueur d'onde de 590 nm, qui correspond à celle des QD hydrosolubles originaux utilisés pour le codage optique des microcapsules. Cela indique que les polyélectrolytes polymères constituant la membrane de la microcapsule n'affectent pas les propriétés de fluorescence, en particulier la fluorescence maximale, des QD dans les microbilles et les microcapsules préparées à partir de celles-ci (Fig. 3).

L'effet de l'incorporation de points quantiques (QD) dans la membrane polymère des microbilles (MCB) et des microcapsules (MCC) sur leurs caractéristiques de fluorescence :Le spectre de fluorescence d'une solution QD contenant 2,241 mg de QD est montré ; cela correspond à la quantité de QD utilisés pour l'encodage optique des MCB

La figure 4 montre les histogrammes de distribution de l'intensité des signaux des populations de microcapsules codées QD, ainsi que des microcapsules placebo, dans le canal de fluorescence PE (575/25 nm) et FSC-A et SSC-A (488/10 nm ) canaux du cytomètre en flux. Les données indiquent une différenciation efficace entre le placebo et les microcapsules codées optiquement dans le canal PE (575/25 nm) (Fig. 4a, b). L'intensité du signal de fluorescence des microcapsules dans le canal PE (575/25 nm) est de ~ 10 ⁴ , qui démontre une capacité de fluorescence élevée des microcapsules codées QD. Dans les canaux FSC-A et SSC-A (488/10 nm), les distributions des deux populations de microcapsules se chevauchent, ce qui indique des tailles relatives et des paramètres de granularité similaires du placebo et des microcapsules codées (Fig. 4c, d) et, par conséquent, , l'homogénéité des populations. Apparemment, cela est dû au fait que les membranes des microcapsules sont constituées d'un nombre égal de couches de polymère, la membrane des microcapsules codées ne contenant qu'une seule couche de QD. Ainsi, les microcapsules obtenues se caractérisent par une distribution de taille homogène et des caractéristiques de fluorescence optimales assurant leur détection dans les canaux correspondants d'un cytomètre en flux.

Détectabilité des microcapsules polyélectrolytiques codées QD par cytométrie en flux :a profil dot-plot des microcapsules dans les canaux SSC-PE ; b histogramme de distribution des microcapsules dans le canal PE ; c profil dot-plot des microcapsules dans les canaux SSC-FSC ; d histogramme de distribution des microcapsules dans le canal FSC. Des microcapsules sans QD (placebo) ont été utilisées comme contrôle et sont représentées en gris, tandis que celles codées avec des points quantiques CdSe/ZnS (émission de fluorescence maximale à 590 nm) sont représentées en orange. Le nombre d'événements analysés était égal à 2500. Les tracés de points et les axes d'histogramme sont représentés par SSC-A, FSC-A, PE-A, où A signifie que les données sont représentées par la zone de signal

Les microphotographies de sections des microcapsules polyélectrolytiques codées par QD illustrées à la figure 5 démontrent que les microcapsules sont creuses, le signal fluorescent lumineux détecté étant émis par les membranes polymères contenant des QD. Ces données confirment l'efficacité de la procédure utilisée pour dissoudre le noyau et démontrent un signal de fluorescence brillant des microcapsules fabriquées, qui peut être détecté à l'aide des filtres correspondants, Texas Red et PE dans les cas de la microscopie à fluorescence et de la cytométrie en flux, respectivement. Les microcapsules polyélectrolytiques préparées contenant des QD dans leur enveloppe polymère possèdent des propriétés fluorescentes plus élevées que les microcapsules polyélectrolytiques marquées avec des colorants conventionnels tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou l'aminofluorescéine [14, 37]. Sinon, les microcapsules codées avec des QD en utilisant l'approche couche par couche ont une brillance comparable voire inférieure à celle des microbilles codées avec des colorants organiques en utilisant la technique de gonflement. La luminosité est déterminée par le produit du coefficient d'extinction et du rendement quantique. Les rendements quantiques des QD hydrosolubles à température ambiante sont d'environ 40 %, ce qui est comparable à celui des colorants organiques [22, 38, 39], alors que les extinctions des QD sont près de 100 fois plus importantes que celles des colorants organiques. Sinon, en raison de la grande taille des QD, leurs quantités dans l'enveloppe des microcapsules pourraient ne pas être comparables à celles des molécules de colorants organiques. Ainsi, les quantités de molécules de colorant organique codantes peuvent être rendues bien supérieures à celles des QD, assurant ainsi une luminosité comparable. D'un autre côté, le codage des microcapsules avec les QD offre un avantage comparatif aussi important que l'absence totale de photoblanchiment. De plus, les QD de différentes couleurs (tailles) peuvent être excités avec la même excitation de longueur d'onde. Ainsi, l'utilisation des QD de différentes couleurs pour le codage des microcapsules peut fournir un nombre pratiquement illimité de codes optiques résolus spectralement [21].

Microphotographies de coupes de microcapsules polyélectrolytiques codées avec des points quantiques. Les flèches dans (a ) indiquez les zones indiquées en (b , c ) à un grossissement plus élevé

Conclusions

Une technique développée pour obtenir des microcapsules polyélectrolytiques codées QD garantit un codage optique efficace. Les microcapsules polymères fabriquées sont caractérisées par une distribution de taille optimale et une intensité de fluorescence élevée à utiliser pour leur détection efficace par des cytomètres en flux commerciaux et des microscopes confocaux. Par conséquent, les microcapsules conçues sont des agents fluorescents potentiels pour la bio-imagerie in vitro et in vivo. Le développement ultérieur de la plate-forme polyvalente à base de microcapsules viserait à proposer de nouveaux outils de bio-imagerie et de théranostique basés sur des microparticules fluorescentes codées QD qui répondent à différents stimuli physiques ou chimiques externes ainsi qu'à la photoexcitation.

Abréviations

BSA :

Sérum albumine bovine

EDTA :

Éthylènediaminetétraacétate disodique

AAP :

Acide polyacrylique

HAP :

Polycation poly(chlorhydrate d'allylamine)

PEG :

Polyéthylène glycol

PSS :

Polyanion poly(sodium 4-styrènesulfonate)

QD :

Point quantique

TOPO :

Oxyde de trioctylphosphine