Les nanoparticules de chitosane et d'albumine sérique bovine chargées de curcumine pourraient améliorer la phagocytose Aβ 42 et moduler la polarisation des macrophages dans la maladie d'Alzheimer

Introduction

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une apparition insidieuse et une progression du déclin cognitif. Histopathologiquement, l'amyloïde-β (Aβ) 42 en tant que peptide contenant 42 acides aminés est agrégé en filbrilles amyloïdes -peptide caractérisées par des « plaques séniles » extracellulaires dans la MA, induisant ainsi l'apoptose neuronale et la perte de synapses [1,2,3] . Généralement, les monomères Aβ 42 sont physiologiquement solubles et non toxiques, tandis que ses oligomères sont plus toxiques in vitro et in vivo [4, 5]. Par conséquent, intervenir sur l'agrégation d'Aβ 42 en éliminant le monomère Aβ 42 est largement considéré comme la cible thérapeutique la plus appropriée pour la MA [6,7,8,9]. Il est bien connu que les peptides Aβ peuvent déclencher l'activation microgliale en interagissant avec plusieurs récepteurs Toll-like (TLR), dont TLR4, et ils favorisent également la phagocytose dépendante de CD14, TLR4 ou TLR2 et la clairance de l'Aβ 42 [10, 11,12]. Bien que l'activation microgliale puisse favoriser la clairance de l'Aβ 42, les cellules microgliales - un type de macrophage mononucléaire - sont peut-être suractivées et polarisées vers le phénotype M1 (caractérisé par la libération de facteurs solubles potentiellement neurotoxiques et de cytokines pro-inflammatoires), conduisant ainsi à la mort neuronale et exacerbant le développement de la MA. A l'inverse, certaines cellules microgliales sont du phénotype classiquement activé (M2) caractérisé par la production de cytokines anti-inflammatoires; ceux-ci améliorent le dysfonctionnement cognitif dans la MA [13,14,15,16]. Par conséquent, le rapport des macrophages de type M1/M2 peut affecter de manière significative la progression de la MA [17, 18]; en outre, la régulation positive requise pour convertir les macrophages pro-inflammatoires M1 en macrophages anti-inflammatoires M2 montrera un potentiel prometteur dans la prévention et le traitement de la MA.

La curcumine, qui provient d'un composant du curcuma indien (Curcumin longa) - un type de gingembre - est un puissant agent anti-inflammatoire qui peut réduire l'inflammation et peut même jouer un rôle dans le traitement de la MA [19]. Ces dernières années, il a été découvert que la curcumine aurait des propriétés anti-amyloïdogènes, anti-inflammatoires, anti-oxydantes et chélatrices de métaux qui pourraient avoir des effets neuroprotecteurs potentiels [20, 21]. La curcumine module la polarisation des macrophages en inhibant les voies de la protéine kinase activée par les mitogènes (TLR4-MAPK)/NF-κB [22,23,24]. Cependant, la faible stabilité et la biodisponibilité de la curcumine limitent son application clinique. De plus, la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) empêche également la pénétration de la curcumine dans le traitement de la MA [25,26,27].

Pour améliorer le transport des médicaments du sang vers le cerveau, les nanoparticules (NP) avec une surface fonctionnalisée avec des peptides [28] et des anticorps [29] facilitent l'administration de médicaments à travers la BHE et l'efficacité de pénétration de la BBB des NP pourrait être considérablement améliorée via des mécanismes de transport actifs autres que la simple diffusion passive [30]. Les NP de chitosan (CS) - un nano-support pour s'associer à Aβ - peuvent imprégner la BHE et sont non immunogènes [31]. De plus, de l'albumine sérique a été trouvée dans le plasma circulant du corps humain à des concentrations de 50 g/L de sérum, et elle était non toxique et bien tolérée par le système immunitaire [32, 33]. Il a également été rapporté que les nanoparticules dérivées de la sérumalbumine bovine (BSA) ont des propriétés de libération prolongée qui peuvent augmenter la demi-vie du médicament, diminuant ainsi la fréquence d'administration et augmentant l'observance du patient [34]. Par conséquent, nous avons utilisé CS et BSA comme deux biomatériaux pour préparer des NP CS-BSA chargées de curcumine afin d'obtenir la meilleure pénétration de la BBB. Les effets de la curcumine sur la phagocytose de l'Aβ42, la sécrétion de cytokines inflammatoires et la régulation des voies TLR4-MAPK/NF-κB ont été étudiés pour confirmer davantage le mécanisme moléculaire de la curcumine sur la polarisation des macrophages.

Matériaux

Le CS avec un degré de désacétylation de 80 % et un poids moléculaire d'environ 400 kDa a été acheté auprès de Haixin Biological Product Co., Ltd. (Ningbo, République populaire de Chine). La BSA a été achetée auprès de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, États-Unis) et la curcumine a été achetée auprès de Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, République populaire de Chine). Le FITC-β-amyloïde (1-42) a été acheté auprès de Chinese Peptide Co., Ltd. (Hangzhou, République populaire de Chine). Les autres produits chimiques achetés étaient de qualité analytique et obtenus auprès de Sigma-Aldrich Co. La lignée cellulaire de macrophages, RAW 264.7 (lignée cellulaire de macrophages de monocytes leucémiques de souris) et la lignée cellulaire endothéliale microvasculaire cérébrale (hCMEC/D3), qui a servi de modèle de la BHE humaine, ont été établis par l'Institut de biologie cellulaire de Shanghai, Académie chinoise des sciences, Shanghai (République populaire de Chine). Les deux cellules ont été maintenues à des températures de 37 °C, et avec un taux de 5 % de CO₂ atmosphère, dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % (volume/volume) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et d'antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine). Il a été rapporté que les cellules RAW 264.7 traitées avec des lipopolysaccharides (LPS) récapitulent les aspects des cellules microgliales observées dans les maladies neurodégénératives illustrées par la MA [35, 36]. Par conséquent, les cellules de la lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 polarisées au phénotype M1 par le lipopolysaccharide (LPS ; 1 μg/ml) ont été en outre appliquées pour simuler les cellules microgliales dans la MA.

Préparation des NP CS-BSA chargées de curcumine

Selon notre rapport précédent [37], dans le cadre d'une interaction électrostatique, le CS chargé positivement pourrait se conjuguer avec le BSA chargé négativement pour former des NP. La méthode de préparation était la suivante :de l'acide acétique à 0,1 % a été utilisé pour dissoudre le CS afin d'obtenir une solution à 0,5 mg/mL de CS et 100 μL de DMSO contenant 0,05 mg/mL de curcumine ont été ajoutés à la solution de CS pour un mélange complet sous magnétique. agitation à température ambiante. En tant que quantité appropriée de solution de BSA, 1,0 mg/mL a été lentement ajouté au mélange de CS et de curcumine ; à ce stade, le phénomène d'opalescence est apparu et les NP de CS-BSA ont été davantage condensées en particules solides. De plus, la taille, la polydispersité, le potentiel zêta et la morphologie des NP ont été étudiés. La libération in vitro de médicaments par les NP a été estimée à l'aide d'une méthode précédemment rapportée [37]. L'efficacité d'encapsulation (EE, %) de la curcumine dans les NP a été calculée à l'aide de l'équation ci-dessous.

\( \mathrm{EE}\%=\frac{W_{\mathrm{total}}-{W}_{\mathrm{free}}}{W_{\mathrm{total}}}\times 100\% \ )

W _total était la quantité de curcumine initialement ajoutée, W _gratuit était la quantité de curcumine restée dans le surnageant.

Évaluation de l'apoptose cellulaire par MTT

Pour déterminer l'innocuité des NP CS-BSA sur l'apoptose cellulaire, un test MTT a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire. Selon le protocole de notre étude précédente, différentes quantités de NP vierges CS-BSA ont été utilisées pour traiter les cellules RAW 264.7 (phénotype M1) et les cellules hCMEC/D3 pendant 24 h à 37 °C pour une analyse plus approfondie.

Études de pénétration utilisant un modèle BBB in vitro

Une culture transwell monocouche utilisant la lignée cellulaire endothéliale microvasculaire cérébrale, hCMEC/D3, est un modèle BBB in vitro courant qui est utilisé pour étudier l'administration cérébrale des NP. Le mélange de cellules hCMEC/D3 (dans 0,5 à 1,0 mL de volume total) a été ajouté dans l'insert dans la chambre supérieure d'une plaque transwell à 12 puits pour la culture cellulaire en monocouche avec une résistance électrique transendothéliale>  300 Ω ; Du PBS à un pH de 7,4 a été ajouté dans la chambre inférieure. La curcumine libre et la suspension de CS-BSA chargées de curcumine ont été placées dans la chambre supérieure pour une incubation continue pendant 3 h dans un incubateur réglé à 37 °C, 5 % de CO₂ . Par la suite, les NPs CS-BSA libres de curcumine et chargées de curcumine ont été transférées à travers les cellules et entrées dans la chambre inférieure. La quantification des NP pénétrées a été détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Synergy-2; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) en vérifiant l'intensité de fluorescence de la curcumine, qui est excitée à 425 nm et émise à 530 nm. Le rapport de fluorescence relative (RFR, %), qui représente les taux de pénétration des NP, a été calculé en déterminant le rapport de l'intensité de fluorescence des NP CS-BSA chargées de curcumine pénétrées dans la chambre inférieure à celle de la curcumine initialement ajoutée. chargé CS-BSA NPs dans la chambre supérieure. Différents inhibiteurs endocytaires, tels que la chlorpromazine (qui inhibe l'absorption médiée par la clathrine) à 10 μg/mL, la génistéine (absorption médiée par les caveoles) à 1 μg/mL, la cytochalasine D (30 μM, macropinocytose) et 20 μg/mL de sodium azoture (un inhibiteur d'énergie), ont été utilisés pour déterminer diverses voies endocytaires impliquées dans les divers mécanismes de pénétration. Le taux de pénétration relatif a été déterminé en comparant les taux de pénétration des NP traités avec des inhibiteurs avec ceux des NP traités avec des non-inhibiteurs.

L'absorption cellulaire des NP CS-BSA chargées de curcumine

La distribution et l'emplacement des NP CS-BSA chargées de curcumine dans les cellules RAW 264.7 (phénotype M1) ont été observés par microscopie confocale à balayage laser (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japon). Le mélange de cellules hCMEC/D3 (dans 0,5 à 1,0 mL de volume total) a été ajouté dans l'insert dans la chambre supérieure de la plaque Transwell à 12 puits pour la culture cellulaire en monocouche avec une résistance électrique transendothéliale>  300 Ω. Des cellules RAW 264.7 (phénotype M1) ont été ensemencées dans la chambre inférieure. De la curcumine libre et une suspension de CS-BSA chargées de curcumine ont été placées dans la chambre supérieure pour une incubation continue dans un incubateur réglé à 37 °C, 5 % de CO₂ . À des intervalles prédéterminés, les distributions cellulaires de curcumine libre et de CS-BSA chargées de curcumine dans les cellules RAW 264.7 (phénotype M1) ont été observées en détectant la fluorescence verte émise par la curcumine à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser.

Détection de la phagocytose de Aβ 42 induite par la curcumine libre et les NP CS-BSA chargées en curcumine

Des cellules RAW 264.7 (phénotype M1) dans des milieux de croissance complète ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits (1 × 10 ⁵ cellules/puits) et traités avec de la curcumine libre et des CS-BSA chargées de curcumine pendant 24 h à 37 °C. Pour éliminer la curcumine non intériorisée et les CS-BSA chargées de curcumine, de l'eau distillée a été utilisée pour laver les cellules en peu de temps deux fois. Il a été constaté que les NP de CS-BSA chargées de curcumine et de curcumine étaient complètement éliminées du milieu, et il n'y avait pas de risque évident que les cellules de l'eau distillée induisent une faible osmolarité car la morphologie des cellules lavées à l'eau distillée était intacte et aucun éclatement de cellules a été observé. Enfin, de l'Aβ 42 libre marqué au FITC dissous dans du PBS (pH 7,4) a été ajouté dans la plaque pour une incubation continue pendant 3 h. La phagocytose de l'Aβ 42 marqué au FITC dans les cellules RAW 264.7 (phénotype M1) a été représentée en détectant la fluorescence verte émise par le FITC. La phagocytose intracellulaire et la localisation de l'Aβ 42 dans les cellules ont été étudiées plus en détail à l'aide de la microscopie confocale à balayage laser (FluoView FV10i; Olympus Corporation).

Dosage Western blot

Pour explorer le mécanisme moléculaire possible de la polarisation des macrophages médiée par la curcumine, nous avons examiné les niveaux d'expression de cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et l'interleukine (IL)-6, et les niveaux de phosphorylation de ERK, JNK , p38 et NF-κB par Western blot pour d'autres effets spécifiques à l'étude de la curcumine sur la voie de signalisation TLR4-MAPK/NF-κB.

Résultats

La caractérisation des NP CS-BSA chargées de curcumine

Les caractéristiques des nanoparticules ont été étudiées pour déterminer leur taille de particule, leur potentiel zêta et leur morphologie à l'aide d'un Zetasizer (Nano ZS90 ; Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni) et d'un microscope électronique à transmission (MET) (Jeol, Tokyo, Japon) à une tension d'accélération de 200 kV. Les résultats présentés sur la figure 1 ont indiqué que les NP de CS-BSA présentaient une taille moyenne à 143,5 nm, un potentiel zêta négatif à − 10,8 mV et une polydispersité à 0,021, respectivement. Il a été observé que les NP CS-BSA chargées de curcumine étaient de forme sphérique et monodispersées. La suspension résultante contenant des CS-BSA NP chargées de curcumine a été centrifugée pour obtenir une solution surnageante afin de déterminer l'absorbance de la curcumine et de calculer la teneur en curcumine libre dans la solution surnageante selon la courbe standard. L'efficacité d'encapsulation (EE, %) de la curcumine dans les NP a été évaluée à 95,4 %. En ce qui concerne le processus de libération du médicament à partir des NP, les NP CS-BSA chargées de curcumine ont montré un modèle de libération biphasique dans le milieu avec un pH de 7,4. Environ 11,3 % de tous les médicaments ont été libérés dans les 3 premières heures, ce qui indique que lorsque les NP sont entrées dans la circulation sanguine avant d'atteindre la BHE, la curcumine était bien protégée et encapsulée dans le noyau des NP. De plus, quelques médicaments se sont échappés des NP et ont été libérés dans le sang au cours des 3 premières heures. La majorité des NP CS-BSA chargées de curcumine pourraient être transportées autour de la BHE et augmenter la concentration de médicament dans le cerveau.

Caractérisation des NP CS-BSA chargées de curcumine. un Image MET de NP CS-BSA chargées de curcumine. b Analyse de diffusion dynamique de la lumière (DLS) des NP CS-BSA chargées de curcumine obtenues. c Analyse du potentiel zêta des NP CS-BSA chargées de curcumine obtenues. d Le profil de libération in vitro des NP CS-BSA chargées en curcumine obtenues dans une solution saline tamponnée au phosphate avec un pH de 7,4 à 37 °C pendant 48 h

Études de pénétration utilisant un modèle BBB in vitro

Les taux de pénétration de la curcumine libre et des NP ont été évalués en vérifiant l'intensité de fluorescence de la curcumine dans la chambre inférieure à l'aide d'un lecteur de microplaques (Synergy-2 ; BioTek Instruments), et ils ont été calculés en déterminant le rapport de l'intensité de fluorescence de la curcumine pénétrée -chargés CS-BSA NPs dans la chambre inférieure à celui des CS-BSA initialement ajoutés chargés de curcumine NPs dans la chambre supérieure. Les résultats (Fig. 2) ont montré que le processus de pénétration de la curcumine libre et des CS-BSA chargées de curcumine suivait des schémas dépendant du temps et que le taux de pénétration augmentait avec le temps. Cela suggère que le taux de pénétration de la curcumine libre était de 12,3 % à 1 h, 20,3 % à 2 h et 29,8 % à 3 h. Par rapport à la curcumine libre, l'efficacité de pénétration des NP CS-BSA chargées de curcumine a été améliorée, comme le montre l'augmentation des taux de pénétration ; les taux de pénétration sont passés à 37,7 % à 1 h, 45,6 % à 2 h et 60,2 % à 3 h. Cela a indiqué que la curcumine libre peut rencontrer des difficultés à pénétrer à travers les cellules et a montré une faible perméabilité à la BHE [38, 39]. Cette observation a également indiqué que les NP CS-BSA chargées de curcumine pourraient efficacement favoriser la pénétration du médicament à travers les cellules, suggérant le rôle joué par diverses voies endocytaires. Un test d'inhibition de l'endocytose a montré que, conformément aux rapports précédents [40], la curcumine libre dépendait de la diffusion passive pour la pénétration et qu'il n'y avait pas de variation évidente dans l'efficacité de pénétration de la curcumine libre, qu'un inhibiteur ait été ajouté ou non. Inversement, la pénétration des NP dépendait de l'énergie et le rapport de pénétration relatif traité avec de l'azoture de sodium était de 55,6 %. De plus, les cavéoles et la macropinocytose médiaient principalement les voies endocytaires des NP. Par rapport au traitement avec des non-inhibiteurs, les taux de pénétration relatifs dans les cellules traitées avec la génistéine et la cytochalasine D étaient respectivement de 67,8% et 60,3%.

Analyse du mécanisme de pénétration de la curcumine libre et des NP CS-BSA chargées de curcumine à travers les cellules hCMEC/D3. un Analyse du spectre de fluorescence des taux de pénétration de la curcumine libre et des NP CS-BSA chargées de curcumine. Les résultats sont exprimés en moyennes ± écart type (n = 3). *P < 0,05, ***i>P < 0,01 par rapport aux taux de pénétration de la curcumine libre à 1 h. ^## P < 0,01 par rapport aux taux de pénétration des NP CS-BSA chargées de curcumine à 1 h. b Effets des inhibiteurs endocytiques sur la capacité de pénétration de la curcumine libre et des NP CS-BSA chargées de curcumine. Les résultats sont exprimés en moyennes ± écart type (n = 3). ^## P < 0,01 vs rapport pénétré relatif des NP CS-BSA chargées de curcumine et traitées avec de la chlorpromazine

Évaluation de l'apoptose cellulaire par MTT

Les effets cytotoxiques des NP vierges CS-BSA contre les cellules RAW 264.7 (M1) et hCMEC/D3 ont été estimés in vitro par un test MTT. Les cellules ont été traitées avec diverses concentrations de CS-BSA NP allant de 0 à 2,0 mg/mL. Un test de viabilité cellulaire sur la figure 3 a montré qu'aucune activité cytotoxique évidente n'a été observée dans les cellules RAW 264.7 et les cellules hCMEC/D3 lorsqu'elles sont traitées avec des NP CS-BSA vierges [37].

Viabilité des cellules RAW 264.7 (M1) et des cellules hCMEC/D3 après incubation avec différentes quantités de NP CS-BSA nues pendant 24 h (n = 3)

Distribution et absorption cellulaire des NP

De la curcumine libre et des CS-BSA chargées de curcumine contenant la même quantité de curcumine à 100 μg/mL ont été utilisées pour traiter les cellules RAW 264.7 (M1), et la distribution et l'absorption cellulaire de la curcumine ont été observées par microscopie confocale à balayage laser (FluoView FV10i; Olympe). On peut voir sur la figure 4 que la distribution intracellulaire de la curcumine libre et des CS-BSA chargées de curcumine suivait un schéma dépendant du temps et que la fluorescence verte de la curcumine s'était accumulée dans la cellule et s'était dispersée dans tout le cytoplasme. Au fil du temps, l'intensité de la fluorescence verte à l'intérieur des cellules a été améliorée. Cela a démontré que la fluorescence verte émise par la curcumine libre à l'intérieur des cellules était très faible, ce qui indiquait que la majeure partie de la curcumine libre n'était pas absorbée par la lignée cellulaire de macrophages, RAW 264.7. Comme les NP pourraient avoir un potentiel prometteur pour une administration intracellulaire très efficace de médicaments [41, 42], il a été observé que les NP CS-BSA chargées de curcumine présentaient une intensité de fluorescence accrue par rapport aux cellules traitées avec de la curcumine libre, suggérant que les NP CS-BSA pourraient améliorer l'absorption cellulaire de la curcumine. Ici, cette observation a indiqué que les NP de CS-BSA pourraient efficacement favoriser l'accumulation de médicament dans les cellules.

L'absorption de curcumine libre et de NP CS-BSA chargées de curcumine dans des cellules RAW 264.7 (M1) pendant 6 h. La curcumine a montré une couleur verte fluorescente et a indiqué l'emplacement intracellulaire de la curcumine libre et des NP de CS-BSA chargées de curcumine. Le noyau a été coloré au Hoechst (bleu) pendant 15 min à 37 °C. La barre d'échelle est de 50 μm et s'applique à toutes les parties de la figure

Phagocytose d'Aβ 42 induite par la curcumine libre et les NP CS-BSA chargées de curcumine

Comme le montre la figure 5, la curcumine a affiché une fluorescence rouge à une longueur d'onde d'excitation de 550 nm et une longueur d'onde d'émission de 570 nm. De plus, il a également montré une fluorescence verte aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission du FITC. Par conséquent, une fois que l'Aβ 42 marqué à la curcumine et au FITC a été phagocyté dans des cellules RAW 264.7 (M1), ils ont tous montré une fluorescence verte aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission du FITC. Dans l'expérience de colocalisation, la fluorescence rouge et la fluorescence verte (représentant la curcumine) ont été fusionnées et les points jaunes représentaient l'existence intracellulaire et l'emplacement de la curcumine ; certains points verts n'étaient pas co-localisés avec les points rouges fluorescents, représentant l'existence et la phagocytose de l'Aβ 42 marqué au FITC dans les cellules RAW 264.7 (M1). Il a été observé que peu de quantités d'Aβ 42 étaient phagocytées par la microglie [43], ce qui a été prouvé par l'observation intracellulaire de la fluorescence verte dans les cellules. Comme le montre l'image superposée de la Fig. 5, par rapport à la curcumine libre, davantage de points fluorescents jaunes de curcumine s'étaient accumulés à l'intérieur des cellules, suggérant qu'une grande quantité de CS-BSA chargées de curcumine NP, comme représenté par une fluorescence jaune intensité, avait été accumulée dans les cellules en raison de l'interaction entre les NP et les cellules RAW 264,7 (M1). Cela a induit des concentrations intracellulaires plus élevées de curcumine, conduisant à une phagocytose accrue d'Aβ 42 [44], comme représenté par l'intensité de fluorescence verte plus élevée. Il était supposé que les NP CS-BSA chargées de curcumine induisaient une polarisation des macrophages, ainsi que des effets anti-inflammatoires et neuroprotecteurs contribuaient à l'amélioration de la phagocytose.

Phagocytose de Aβ 42 induite par la curcumine libre et les NP CS-BSA chargées de curcumine. La barre d'échelle est de 50 μm et s'applique à toutes les parties de la figure

Dosage Western blot

Pour explorer les mécanismes moléculaires possibles de la polarisation des macrophages médiée par la curcumine, nous avons examiné les niveaux globaux de TNF-α, IL-6 et TLR4 ainsi que les niveaux de phosphorylation de p38, ERK, JNK et IκBα par Western blot pour étudier plus avant le effets spécifiques de la curcumine sur la voie de signalisation TLR4-MAPK/NF-κB.

La figure 6 a montré que par rapport aux cellules RAW 264.7 normales en tant que groupe témoin, les cellules RAW 264.7 (phénotype M1) ont libéré plus de facteurs solubles potentiellement neurotoxiques et de cytokines pro-inflammatoires caractérisées par des niveaux d'expression plus élevés de TNF-α et d'IL-6, entraînant ainsi la mort neuronale et exacerbant le développement de la MA. Par rapport au contrôle et à la curcumine libre, les NP CS-BSA chargées de curcumine semblaient inhiber la polarisation des macrophages M1 et induisaient la plus faible expression de TNF-α et d'IL-6 dans les cellules RAW 264.7 (phénotype M1). De plus, les NP CS-BSA chargées de curcumine ont également diminué l'expression de TLR4, qui régule la polarisation des macrophages M1 et la phosphorylation de ERK, JNK, p38 et NF-κB semble être réduite. Cela suggère que les NP CS-BSA chargées de curcumine ont favorisé efficacement l'accumulation de curcumine - et sa concentration intracellulaire ultérieure - dans les cellules, renforçant ainsi ses effets de blocage sur la voie de signalisation TLR4-MAPK/NF-κB et inhibant davantage la polarisation des macrophages M1.

Analyses Western blot des niveaux d'expression de TNF-α, IL-6, TLR4 et phosphorylation de ERK, JNK, p38 et du facteur nucléaire (NF)-κB dans des cellules RAW 264.7 (phénotype M1) après des traitements avec de la curcumine et de la curcumine libres NP CS-BSA chargés

Discussion

La MA est l'une des maladies neurodégénératives les plus courantes et la principale cause de décès dans les pays développés. En ce qui concerne le traitement de la MA, la capacité de la BHE à empêcher l'entrée de la plupart des substances exogènes dans le cerveau était le principal obstacle à leur utilisation. Pour résoudre ce problème, nous avons conçu des NP CS-BSA pour améliorer le transport de la curcumine à travers la BHE. Les résultats ont démontré que, conformément à l'étude précédente [45], la curcumine libre pénétrait difficilement à travers les cellules et venait traverser la BHE, entraînant ainsi des effets de pénétration plus faibles. Les NP CS-BSA chargées de curcumine pourraient favoriser efficacement la pénétration du médicament à travers la BHE grâce à la médiation des voies médiées par les cavéoles et la micropinocytose. La neuroinflammation induite par l'agrégation Aβ est l'un des facteurs critiques sous-jacents aux mécanismes pathologiques de la MA [46]. Les niveaux d'Aβ dans le cerveau sont déterminés par l'équilibre dynamique entre la génération et la clairance d'Aβ; par conséquent, l'élimination de Aβ est également importante pour déterminer son niveau dans le cerveau. La capacité de phagocytose de la microglie a montré une importance physiologique importante dans la prévention de la MA. La microglie était principalement responsable de la clairance de la cible Aβ et avait tendance à s'agréger principalement autour de la zone de dépôt d'Aβ 42, empêchant ainsi davantage l'accumulation d'Aβ 42 par phagocytose [47, 48]. Les résultats ont montré que les effets de phagocytose des cellules RAW 264.7 traitées par CS-BSA chargées de curcumine (phénotype M1) sur Aβ 42 étaient augmentés et que l'accumulation et le dépôt d'Aβ 42 étaient réduits, ce qui peut améliorer le développement de la MA.

La microglie (phénotype M1) libère des facteurs solubles potentiellement neurotoxiques et des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α et l'IL-6, entraînant ainsi la mort neuronale et exacerbant le développement de la MA [49]. Il est constaté que la polarisation des macrophages M1 dépend de l'activation de la voie de signalisation TLR4-MAPK /NF-κB et que le blocage de la voie de signalisation TLR4-MAPK /NF-κB pourrait inhiber la polarisation des macrophages M1 et favoriser la polarisation des macrophages de type M1. au type M2 [50]. Nos résultats ont montré que la curcumine en tant que composant de l'épice indienne, le curcuma (Curcumin longa) - un type de gingembre - était un puissant agent anti-inflammatoire qui pourrait réduire l'inflammation et pourrait même jouer un rôle dans le traitement de la MA. Les NP CS-BSA ont été des outils puissants pour la pénétration efficace de la curcumine ciblée sur la BBB. Par rapport à la curcumine libre, les CS-BSA NP chargées de curcumine ont induit des effets de phagocytose et une plus grande quantité d'Aβ 42 a été phagocytée par les cellules RAW 264.7. De plus, les NP CS-BSA chargées de curcumine induisaient des niveaux d'expression protéique de TNF-α, IL-6 et TLR4 inférieurs à ceux de la curcumine libre, et la phosphorylation de ERK, JNK, p38 et NF-κB était également inhibée. Il a indiqué que les NP CS-BSA chargées de curcumine peuvent améliorer la phagocytose des macrophages induite par la curcumine en inhibant la polarisation des macrophages M1 en bloquant la voie de signalisation TLR4-MAPK/NF-κB, favorisant ainsi les effets anti-inflammatoires et neuroprotecteurs de la curcumine.

Conclusion

Nos données suggèrent que la curcumine pourrait être utilisée comme agent thérapeutique dans le traitement de la MA. Les NP CS-BSA chargées de curcumine ont déclenché la phagocytose induite par les cellules RAW 264.7 de l'Aβ 42 par la pénétration améliorée de la BBB de la curcumine et une concentration de médicament intracellulaire plus élevée. De plus, les NP CS-BSA chargées de curcumine ont induit des effets anti-inflammatoires et neuroprotecteurs en inhibant la polarisation des macrophages M1 et en bloquant la voie de signalisation TLR4-MAPK/NF-κB. Ensemble, les NP CS-BSA chargées de curcumine ont démontré leur potentiel pour améliorer le traitement de la MA.

Abréviations

AD :

Maladie d'Alzheimer

BBB :

Barrière hémato-encéphalique

BSA :

Sérum albumine bovine

CS :

Chitosan

LPS :

Lipopolysaccharide

NP :

Nanoparticules

TLR :

Récepteurs de type péage