Effets antimicrobiens et cytotoxicité des nanoparticules d'argent synthétisées à partir de l'extrait de peau de Punica granatum

Contexte

Au cours des dernières décennies, il y a eu une quantité croissante de recherches sur les nanotechnologies, impliquant en particulier la synthèse verte et la caractérisation des nanoparticules, car les nanoparticules de moins de 100 nm sont des agents idéaux pour l'administration de médicaments et les applications biomédicales [1]. La synthèse de nanoparticules joue un rôle influent dans plusieurs domaines, notamment la nanotechnologie, la biotechnologie, le traitement chimique, la méthodologie physique, l'ingénierie des systèmes, les moteurs moléculaires, les nanocristaux et les nanobiomatériaux [2]. Trois méthodes de production de nanoparticules existent aujourd'hui :les voies chimiques, physiques et « vertes », la voie verte impliquant l'emploi d'agents réducteurs biologiques, notamment des extraits de plantes et des filtrats microbiens. Les deux premières méthodes sont souvent coûteuses et génèrent des sous-produits toxiques, mais la méthode de nanosynthèse verte a été reconnue comme un procédé peu coûteux et respectueux de l'environnement [3,4,5].

Dans la synthèse verte des NP, les constituants végétaux, y compris les protéines, les enzymes et les glucides, sont utilisés pour formuler des nanoparticules qui peuvent facilement interagir avec les biomolécules cibles [6]. Cette approche de la synthèse de nanoparticules d'argent pourrait jouer un rôle important dans les traitements futurs de diverses formes de cancer ou d'autres maladies pouvant être contrôlées par la phyto-nanotechnologie [7, 8]. Bactéries à Gram négatif, telles que Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , et Proteus vulgaris , et les pathogènes à Gram positif, tels que Staphylococcus aureus et S. épiderme , sont responsables de la plupart des infections nosocomiales [9]. En effet, les infections chirurgicales, dont la pneumonie et les infections du sang, sont également dues à la présence de bactéries Gram-positives et Gram-négatives [10]. La synthèse à médiation végétale des AgNPs peut aider au développement d'agents antibactériens efficaces contre les agents pathogènes microbiens d'importance pour la santé publique. Récemment, il a été noté que les AgNPs synthétisés peuvent avoir une relation synergique avec l'antibiotique lévofloxacine, augmentant l'activité antimicrobienne totale [11]. De nombreux chercheurs ont rapporté que les AgNPs synthétisés contiennent des propriétés antimicrobiennes bien connues contre les agents pathogènes Gram-positif et Gram-négatif, ainsi que des effets cytotoxiques sur différentes lignées cellulaires cancéreuses et normales [12,13,14]. De plus, les AgNP sont très efficaces en raison d'un rapport surface/volume élevé, peuvent facilement perturber et ont la capacité de pénétrer dans les cellules bactériennes par rapport aux ions argent seuls [13].

L'étude actuelle se concentre sur la synthèse verte des AgNPs en utilisant l'extrait aqueux de Punica granatum peler et sur l'étude de leurs propriétés antimicrobiennes en utilisant des plaques à stries et des mesures de concentration minimale d'inhibition (CMI) après 24 h d'incubation à 37 °C. Les bactéries Gram-négatives E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27584), P. vulgaris (ATCC 8427) et Salmonella typhi (ATCC 14028) ainsi que la bactérie Gram-positive Staphylococcus aureus (ATCC 29213), S. épiderme (MTCC 3615), et K. pneumonie ont été étudiées pour tester l'inhibition potentielle de la croissance par les AgNPs synthétisés. De plus, les effets cytotoxiques sur une lignée cellulaire de cancer du colon (RKO :ATCC® CRL-2577™) ont été testés et ont montré un taux de viabilité cellulaire de 56% au jour 3 et de 61% au jour 5 avec une dose de 12,5 μg d'AgNPs.

Méthodes

Préparation de l'Extrait de Peel

Un kilogramme de fruits de grenade saoudiens (Punica granatum —cultivé dans la région de Taif du Royaume d'Arabie saoudite) a été acheté au supermarché de Riyad, en Arabie saoudite. Les fruits ont été lavés plusieurs fois à l'eau du robinet puis à l'eau bidistillée (DDH₂ O). Après lavage, la peau a été soigneusement retirée. Le zeste de grenade a été rincé abondamment avec du DDH₂ O pour éviter toute contamination de surface et laisser sécher complètement à température ambiante. Enfin, la peau a été broyée en une fine puissance. Dix grammes de poudre fine ont été trempés dans 100 mL de DDH₂ O pendant 24 h à température ambiante. Le mélange résultant a été filtré en utilisant du papier filtre Whatman n° 1 pour obtenir l'extrait aqueux. L'ensemble du processus a été effectué dans des conditions stérilisées.

Processus de synthèse des AgNPs

Nitrate d'argent (AgNO₃; 0,1 mM) a été mélangé avec 250 mL de DDH2O. Ensuite, dix millilitres d'extrait aqueux de zeste de grenade ont été ajoutés et la solution a été soigneusement mélangée à l'aide d'un incubateur à agitation pendant 5 minutes. Le mélange réactionnel s'est avéré changer de couleur d'une solution incolore à une solution de couleur brune après 24 h, indiquant la réduction des ions d'argent en nanoparticules d'argent. La solution de nanoparticules a ensuite été centrifugée à 15 000 tr/min pendant 15 min, et le processus a été répété quatre fois. Enfin, des AgNPs purifiés ont été collectés et d'autres tests ont été effectués pour analyser les caractéristiques et les activités biologiques des NPs synthétisées. L'excès d'extrait de peau a été conservé à 4 °C pour une analyse plus approfondie.

Caractérisation des AgNPs

La réduction des ions argent par l'extrait aqueux de zeste de grenade a été suivie à l'aide d'un spectrophotomètre Perkin Elmer Lambda 950 UV/Vis/NIR 24, 48 et 72 h après le début de la réaction de 200 à 800 nm et à une résolution de 1 nm . Les diagrammes XRD ont été obtenus par un diffractomètre à rayons X PANalytical capable de vitesses de balayage allant de 20 à 50 avec 2θ et ont été utilisés pour déterminer la structure cristalline des nanoparticules d'argent.

Les analyses topographiques et de composition de surface des AgNPs ont été réalisées à l'aide d'une analyse MET réalisée sur un JEOL JEM-1230 (JEOL, Tokyo, Japon) et un JSM 6380 LA SEM, avec une résolution de 3,0 nm. L'analyse élémentaire des AgNPs a été réalisée par spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX) en utilisant une série JED 2200 (Jeol).

Études antibactériennes

Préparation de la suspension bactérienne

Les souches bactériennes E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27584), P. vulgaris (ATCC 8427), S. typhi (ATCC 14028), S. aureus (ATCC 29213), S. épiderme (MTCC 3615), et K. pneumonie ont été obtenus auprès de l'hôpital King Khalid, Riyad, Royaume d'Arabie saoudite. Une identification rapide des cellules bactériennes a été réalisée selon les méthodes précédemment publiées [15]. Toutes les cultures identifiées ont été transférées sur gélose et conservées à - 20 °C jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires à l'étude. À ce stade, chaque souche bactérienne a été inoculée dans de la gélose nutritive stérile et incubée à 37 °C pendant 24 h. La suspension (10 ⁶ UFC/mL) a été préparé en transférant une boucle d'inoculum de la culture incubée sur 24 h dans 5 mL de bouillon nutritif et en l'incubant à 37 °C pendant 2 h.

Dosages antimicrobiens

Les dosages d'activité antimicrobienne ont été réalisés en utilisant une méthode de diffusion en puits d'agar [16]. Un écouvillon stérile a été humidifié avec une suspension bactérienne fraîche et étalé sur une plaque d'agar Muller-Hinton solide et stérile. Des puits ont été réalisés dans la plaque de gélose à l'aide d'un perce-bouchon. Différentes concentrations (25, 50, 75 et 100 μL) de suspension de nanoparticules synthétisées ont été versées dans chaque puits consécutif. Toutes les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 24 h. Une zone d'inhibition a été mesurée (mm) autour de chaque puits dans chaque plaque incubée. Pour chaque expérience, trois répétitions ont été effectuées [17].

Analyse de la prolifération cellulaire

L'effet des AgNPs sur la prolifération cellulaire a été évalué à l'aide d'un test Alamar Blue tel que décrit précédemment [12].

En bref, 0,005 × 10 ⁶ cellules/puits ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits avec différentes concentrations (100-0,3 μg/mL) d'AgNPs et incubées pendant 2 à 5 jours à 37 °C. Le milieu, DMEM, a été complété par 4 500 mg/L de d-glucose, 4 mM de l-glutamine, 110 mg/L de pyruvate de sodium, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 × pénicilline-streptomycine et des acides aminés non essentiels (tous achetés chez Gibco-Invitrogen, États-Unis). Les puits de contrôle ont été traités avec le milieu seul et la prolifération cellulaire a été mesurée aux jours 3 et 5. À ces moments, du bleu Alamar (1:10) a été ajouté à chaque puits et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 4 h.; ensuite, les plaques ont été lues à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique (Biotek Synergy 2 ; Biotek Instruments, États-Unis) et l'unité de fluorescence relative (RFU) a été enregistrée.

Analyse de l'apoptose/nécrose cellulaire

Pour déterminer l'apoptose/nécrose, les cellules ont été traitées avec des AgNPs à différentes concentrations (25-1,5 μg/mL). Le jour 5, les cellules ont été colorées avec une solution de coloration fluorescente double (1 μL) contenant 100 μg/mL d'AO (acridine orange) et 100 μg/mL d'EtBr (bromure d'éthidium) (AO/EtBr, Sigma, St. Louis, MO ). Les cellules colorées ont été exposées à une solution de colorant AO/EtBr (1:100) pendant 1 min et observées à l'aide d'un microscope à fluorescence Nikon Eclipse Ti. Les résultats ont été comparés avec le contrôle expérimental. AO/EtBr, une combinaison de deux colorants, aide à visualiser les cellules avec une organisation aberrante de la chromatine. L'absorption différentielle d'AO/EtBr permet l'identification de cellules viables et non viables. En particulier, l'AO a été utilisée pour visualiser le nombre de cellules ayant subi une apoptose.

Analyse statistique

Les analyses statistiques et les graphiques ont été réalisés à l'aide de Microsoft Excel 2010 et du logiciel GraphPad Prism 6.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA). P les valeurs ont été calculées à l'aide de comparaisons multiples ANOVA à un facteur. L'analyse des données antimicrobiennes pour différentes concentrations a été testée avec un niveau de signification de P < 0,05.

Résultats et discussion

Les AgNPs ont été synthétisés avec succès en utilisant l'extrait aqueux de zeste de grenade comme source d'agent réducteur. La figure 1a montre 0,1 mM de nitrate d'argent dissous dans 250 mL de DDH₂ O pour faire une solution incolore. Ensuite, 10 mL d'extrait de peau aqueux ont été ajoutés et bien mélangés, et le mélange réactionnel a lentement viré à une couleur brun foncé en 24 h, comme le montre la figure 1b. Le changement de couleur observé lors de la synthèse des AgNPs a été rapporté pour des réactions similaires lorsque plusieurs types d'extraits de parties de plantes telles que les feuilles, les fleurs, les pelures, les graines et les fruits sont utilisés. Le changement de couleur était dû à AgNO₃ interagissant avec des sources végétales et étant réduit du nitrate d'argent à l'argent élémentaire [18,19,20,21,22].

un 0,1 mM de nitrate d'argent. b La couleur change après P. granatum extrait d'écorce ajouté

La figure 2 montre le spectre UV-Vis des AgNPs synthétisés à l'aide d'extrait aqueux de zeste de grenade. Comme le montre la figure 2, la bande d'absorbance a un pic à 378 nm à des temps de réaction de 24, 48 et 72 h avec des intensités de 0,96, 1,08 et 1,16, respectivement. L'intensité a augmenté avec le temps, car la réaction avait plus de temps pour se produire, conduisant à des concentrations plus élevées d'AgNPs. Les données de résonance plasmonique de surface ont montré que des concentrations croissantes d'AgNPs ont conduit à des pics d'AgNP croissants, coïncidant avec des quantités accrues d'argent réduit au fil du temps. Comme AgNO₃ réagi pour former des AgNPs en raison de la libération d'électrons de l'extrait de grenade, une réaction simultanée a commencé à oxyder les radicaux ascorbate. Un spectre d'absorption UV-Vis similaire a été observé dans une étude différente qui a produit des AgNP à partir d'extrait de zeste de grenade, avec un pic d'absorbance à 371 nm [23].

Spectres d'absorbance UV-Vis des AgNPs synthétisés à 48 à 72 h à des intervalles de temps

Le schéma XRD des AgNPs synthétisés en vert est illustré à la Fig. 3. Six pics de diffraction intenses sont observés à 2θ des valeurs allant de 0 à 90, indiquant que nous pourrions attribuer les plans 111, 200, 220 et 311 d'un cube à faces avec un ion Ag central. Le spectre XRD suggère que les AgNPs synthétisés ont formé une structure cristalline. Ce résultat est en accord avec les modèles XRD précédemment publiés dans la base de données JCPDS (n° 04-0783). Les pics cristallins non identifiés (*) observés correspondent à des oxydes d'argent [24]. Une image MET de NP de pelure aqueuse de grenade 0,1 mM est illustrée à la figure 4. Cette image montrait que les particules étaient de forme sphérique avec un diamètre allant de 20 à 40 nm, la taille moyenne des particules étant de 26,95 nm. Des rapports similaires ont été faits concernant la nanosynthèse de NP en utilisant Actinidia deliciosa extrait de fruit [25]. Les observations SEM des AgNPs synthétisés (Fig. 5) montrent une répartition égale des nanoparticules d'argent à la surface des cellules de peau de grenade. À partir de cette image, il a été déterminé que les nanoparticules sont de forme sphérique, avec des diamètres allant de 20 à 40 nm, ce qui est similaire à un rapport précédent d'AgNPs de forme sphérique allant de 34 à 50 nm de diamètre produit à l'aide de Raphanus sativus Extrait d'écorce de L. [26].

Modèle XRD d'AgNPs synthétisés à partir de P. granatum extrait d'écorce

Image TEM d'AgNPs synthétisés à partir de P. granatum extrait d'écorce

Image SEM d'AgNPs synthétisés à partir de P. granatum extrait d'écorce

Dans la phytosynthèse de nanoparticules d'argent à l'aide de l'extrait de zeste de grenade présenté ici, la taille des nanoparticules obtenues est assez prometteuse pour l'administration de médicaments. La taille des nanoparticules inférieure à 100 nm jouerait un rôle dans le développement de systèmes intelligents, améliorant les valeurs thérapeutiques et d'imagerie et l'administration de médicaments à des tissus spécifiques pour fournir une thérapie à libération contrôlée [27]. La taille et la forme des nanoparticules influencent la biodisponibilité du médicament dans les tissus cibles. Les nanoparticules de 100 nm présentent une absorption 2,5 fois supérieure à celle des particules de 1 µm de diamètre [28, 29]. La taille des nanoparticules joue un rôle clé dans la fonction des particules, comme la dégradation, la dynamique vasculaire, le ciblage, la clairance et les mécanismes d'absorption [30]. De plus, la nature nanocristalline des AgNPs synthétisés améliore la bio-distribution et la pharmacocinétique comme indiqué [31, 32]. L'utilisation des biodéchets de grenade sera une nouvelle approche de l'utilisation des déchets, comme indiqué précédemment [33].

Les données de l'étude EDX ont fourni une analyse qualitative et quantitative des éléments trouvés dans les nanoparticules synthétisées, comme le montre la figure 6. L'étude EDX a fourni une ventilation élémentaire du contenu des NP synthétisés et a estimé que les NP se composaient de 70% Ag en poids. D'autres éléments et liaisons identifiés dans les résultats comprenaient C-K, O, C-U, Cu et K, chacun correspondant à un petit pourcentage de la masse totale. Le rapport EDX fournit la preuve que la faible concentration de 0,1 mM AgNO₃ a entraîné un nombre élevé d'AgNPs synthétisés. Des résultats similaires ont été signalés pour 0,3 mM AgNO₃ qui a été versé dans de l'eau distillée pendant 3 h et chauffée à 300 °C, et pour 1, 2 et 3 g d'extrait de zeste de grenade mélangé à 30 mL d'eau distillée et chauffé à 80 °C [34].

Image EDX des AgNPs synthétisés de P. granatum extrait de peau avec analyse quantitative

Les propriétés antibactériennes des AgNPs synthétisés par la grenade ont été étudiées à l'aide d'échantillons de 25, 50, 75 et 100 μg/mL contre des bactéries Gram-positives et Gram-négatives via le test de diffusion en puits d'agar. Des plaques de gélose avec les bactéries Gram-négatives E. coli , S. typhi , et P. aeruginosa et les zones d'inhibition sont montrées dans la Fig. 7a–c. De faibles concentrations d'AgNPs synthétisés par la grenade (25 et 50 μL) ont montré une activité inhibitrice contre P. aeruginosa et E. coli mais pas contre S. typhi. Des effets antimicrobiens similaires de produits à base de grenade ont été signalés précédemment, où les inhibitions les plus fortes ont été observées pour E. coli , S. aureus , et P. aeruginosa [35,36,37].

Effets antimicrobiens et zone d'inhibition des AgNPs des pathogènes Gram-négatifs (a –c )

Effets antimicrobiens et zone d'inhibition des AgNPs des pathogènes à Gram positif (d –f )

La figure 8a–c montre l'activité antimicrobienne des AgNPs synthétisés contre les pathogènes Gram-positifs K. pneumonie , S. aureus , et S. épiderme . Une activité antimicrobienne a été observée même à de faibles concentrations d'AgNP (25 et 50 μL) pour K. pneumoniae, avec des zones d'inhibition de 9 et 14 nm, respectivement, et contre S. aureus , avec des zones d'inhibition de 6 et 14 nm, respectivement. Des études antérieures ont également confirmé l'inhibition de la croissance des bactéries Gram-positives traitées avec des NP synthétisées [35,36,37,38]. L'activité antibactérienne évaluée après exposition aux AgNPs synthétisés a montré des zones d'inhibition comprises entre 7 et 21 mm. La figure 9 présente les effets inhibiteurs de différentes concentrations (25 à 100 μL) de P. granatum peler les AgNPs sur E. coli , P. aeruginosa , S. typhi , K. pneumonie , S. aureus , et S. épiderme . Même à de faibles concentrations d'AgNPs, une bonne activité antibactérienne a été observée pour tous les microbes, à l'exception de S. typhi , comme indiqué précédemment [38].

Afin d'analyser les effets cytotoxiques des AgNPs, une lignée cellulaire de cancer du côlon (RKO :ATCC® CRL-2577™) a été utilisée. Au jour 3, nous avons trouvé une viabilité de 56 % avec un traitement à 12,5 μg et une viabilité de 61 % au jour 5. Les réductions globales significatives de la prolifération ont été observées à>   12,5 μg (Fig. 10a), et elles étaient cohérentes au jour jour 5. De plus, les images colorées AO/EtBr ont confirmé la réduction de la prolifération en visualisant les colonies et le nombre de cellules (Fig. 10b). Fait intéressant, nous avons pu observer des cellules avec des vacuoles cytoplasmiques périnucléaires à 12,5 μg (Fig. 10b, c); ce processus pourrait être une voie de dégradation dans les lysosomes dans le processus d'autophagie pour améliorer la mort cellulaire programmée. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour confirmer l'effet de l'AgNP sur les fonctions d'autophagie. Dans notre étude précédente sur les AgNPs synthétisés à l'aide de Pimpinella anisum graines, nous avons également constaté que 12 μg d'AgNPs étaient toxiques pour les cellules HCT116 en augmentant soit l'apoptose, soit la nécrose [12]. Une faible concentration d'AgNPs a également été signalée comme étant capable d'induire l'apoptose [39]. Les expériences en cours avec des AgNPs synthétisés avec Punica granatum l'extrait de peau a également montré une toxicité de 55 à 62 % avec 12,5 μg. De plus, la coloration AO/EtBr a révélé une image claire de la mort cellulaire programmée via l'autophagie.

Activité antimicrobienne des AgNPs contre les pathogènes Gram-négatifs et Gram-positifs

Cytotoxicité des AgNPs. un Analyse de la prolifération et de la viabilité cellulaire sur cellules RKO. Comparaisons multiples ANOVA à un facteur, ***P < 0,0005. b Analyse apoptose/nécrose sur cellules RKO. c Cellules RKO exposées à différentes doses d'AgNPs

Conclusions

Les résultats de la présente étude ont montré que l'extrait de zeste de grenade est un bon agent réducteur pour synthétiser des nanoparticules d'argent avec une plage de tailles de 20 à 40 nm (taille moyenne, 26,95 nm), une condition préalable idéale pour une administration efficace des médicaments et pour une biodisponibilité accrue à un site cible. L'activité antibactérienne des AgNPs synthétisés sur les organismes testés, même à de faibles concentrations d'AgNPs (25-100 μL), confirme en outre l'efficacité antibiotique des AgNPs synthétisés en vert pour le développement de nouveaux agents antibactériens pour le traitement contre Gram-négatif et Gram -agents pathogènes positifs. De plus, les effets cytotoxiques observés des AgNPs sur les lignées cellulaires du cancer du côlon et les réductions de la prolifération cellulaire à un niveau de dose de> 12,5 μg favorisent davantage les AgNPs comme traitement de première intention des tumeurs.

Abréviations

EDX :

Spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie

SEM :

Microscope électronique à balayage

TEM :

Microscopie électronique à transmission

XRD :

Diffraction des rayons X