Nanoparticules d'or enrobées de protéines synthétisées vertement depuis Tricholoma crassum : potentiels antimicrobien, apoptotique et vecteur de gènes

Résumé

Nous rapportons la première synthèse verte de nanoparticules d'or enrobées de protéines (AuNP) utilisant le champignon mycorhizien comestible Tricholoma crassum. Les AuNP, de 5–25 nm de diamètre et de formes variées, se forment en une heure à 28 °C. La spectroscopie UV–vis montre un pic SPR caractéristique à 552 nm, décalant avec le temps de réaction et le pH. La caractérisation détaillée par MEB, MET, AFM, DRX et DLS confirme la monodispersité et une couronne protéique naturelle de 40 kDa. Les particules présentent une activité antimicrobienne puissante contre pathogènes Gram-négatif, Gram-positif et fongiques, incluant souches multi-résistantes, et inhibent la germination des spores. Les essais comète révèlent une induction apoptotique dose-dépendante dans cellules végétales, tandis que l'enrobage protéique 40 kDa facilite une livraison génique efficace vers cellules Sarcome 180, evidenced by expression GFP. Les tests d'hémolyse montrent une toxicité sanguine négligeable below 20 µl mL⁻¹, indiquant une fenêtre thérapeutique sûre. La production à grande échelle en fermenteurs est faisable, positionnant ces AuNP comme agents polyvalents pour applications antimicrobiennes, anticancéreuses et vecteur de gènes.

Contexte

L'adoption rapide des nanoparticules en agriculture, médecine et produits de consommation a accru le besoin de comprendre leur profil de sécurité. La synthèse verte, employant organismes vivants ou leurs enzymes, offre une voie éco-compatible, rentable, éliminant les produits chimiques dangereux. Les champignons filamenteux, avec leur forte sécrétion enzymatique, sont particulièrement aptes à produire des nanoparticules métalliques extracellulaires. Bien que plusieurs champignons aient produit des nanoparticules d'or (AuNP), peu de rapports décrivent des enrobages protéiques naturels sur ces particules, qui sont critiques pour la stabilité colloïdale et la fonctionnalisation. Les nanoparticules d'or sont attractives pour usage thérapeutique car elles n'induisent pas de résistance et peuvent cibler cellules tumorales via l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR). Les AuNP enrobées de protéines améliorent l'absorption cellulaire et fournissent sites d'ancrage pour médicaments ou gènes, obviant le besoin d'étapes de capage chimique additionnelles. Néanmoins, la biocompatibilité, cytotoxicité et risques d'agrégation doivent être soigneusement évalués avant application clinique.

Méthodes

Champignons, bactéries et conditions de croissance végétale

Tricholoma crassum a été cultivé pour la synthèse de NP. Les tests antimicrobiens ont utilisé E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404), et leurs dérivés multi-résistants, ainsi que pathogènes végétaux M. oryzae et A. solani. Plantules de tomate et tabac cultivées sous conditions contrôlées (28 ± 1 °C, 16:8 h jour/nuit, 50 µmol m⁻² s⁻¹).

Synthèse des AuNP

Les nattes mycéliennes ont été incubées dans bouillon dextrose pomme de terre (PDB) 7 jours à 28 °C. Après 24, 48, ou 72 h, 1 g de mycélium a été agité avec 10 mL eau déionisée 24 h à 50 tr/min. Le filtrat (pH 5,2) a été mélangé avec 1 mM HAuCl₄ et agité à 28 °C dans l'obscurité 1 h. En ajustant le pH du filtrat (3,5–9) et la température de réaction (0–100 °C), nous avons affiné la taille et la forme des particules. Variations du volume de filtrat (×0,5–×2) et concentration Au³⁺ (0,5–2 mM) ont affiné la synthèse.

Techniques de caractérisation

• Spectroscopie UV–Vis (450–750 nm) pour analyse SPR.
• MEB, MET, AFM pour morphologie et distribution de taille.
• DRX pour confirmation phase cristalline.
• DLS pour taille hydrodynamique.
• SDS‑PAGE pour identification couronne protéique.

Essais antimicrobiens et antifongiques

Essais diffusion sur disque et courbes de croissance ont quantifié l'inhibition contre souches bactériennes et fongiques. La germination des spores fongiques a été évaluée avec concentrations variables d'AuNP. La méthode impliquait incubation standard et observation microscopique.

Évaluation de l'apoptose

Essais comète sur noyaux de feuilles de tabac et tomate ont mesuré la fragmentation d'ADN après exposition aux AuNP. Différentes concentrations (0–30 % v/v) et temps d'incubation (15–30 min) testés.

Livraison génique dans cellules Sarcome 180

Le plasmide pCAMBIA1302 (marqueur GFP) a été complexé avec AuNP et incubé avec cellules Sarcome 180. L'expression GFP a confirmé la transfection réussie. Essais d'hémolyse avec érythrocytes humains ont évalué la compatibilité sanguine.

Résultats et discussion

Formation des AuNP et caractéristiques spectroscopiques

La transition du jaune pâle au violet en 1 h indique la formation d'AuNP. Les spectres UV–Vis montrent un pic SPR à 552 nm pour filtrat 24 h, se décalant vers le rouge avec incubation plus longue et vers le bleu avec pH plus élevé. La synthèse optimale se produit à 28 °C avec 1 mM HAuCl₄, donnant des particules monodisperses stables >30 jours.

Effet des paramètres de synthèse

L'augmentation du volume de filtrat ou de la concentration Au³⁺ élève l'intensité de couleur et l'absorbance, avec un léger décalage bleu à ×2 filtrat. Températures plus élevées (75–100 °C) produisent des particules plus grosses, moins stables. L'exposition à la lumière augmente la taille des particules et élargit le pic SPR.

Morphologie et distribution de taille

MEB et MET révèlent des AuNP 5–22 nm de formes allant de sphères, rhomboïdes, hexagones et triangles. AFM confirme hauteurs sub-10 nm, et DRX confirme l'or cubique à faces centrées avec diffraction {111} dominante à 38,23°.

Activité antimicrobienne

Les AuNP ont inhibé la croissance de E. coli, A. tumefaciens, et M. oryzae avec zones d'inhibition dose-dépendantes. Souches multi-résistantes aussi supprimées, indiquant efficacité à large spectre. Analyses de courbes de croissance ont montré phase log retardée et densité cellulaire réduite sous traitement AuNP.

Germination des spores fongiques

L'augmentation des concentrations d'AuNP a progressivement réduit la germination des spores et la longueur du tube germinatif de A. solani, démontrant une puissance antifongique.

Propriétés apoptogènes

Les essais comète ont révélé des dommages ADN significatifs à >20 % exposition AuNP, tandis que 5–10 % causaient apoptose négligeable. Ainsi, une fenêtre thérapeutique existe pour applications antimicrobiennes ou vecteur de gènes sans cytotoxicité.

Identification de la couronne protéique

SDS‑PAGE de NP bouillies montre une bande unique 40 kDa identique à la protéine extracellulaire de T. crassum. L'enrobage protéique stabilise les particules et fournit sites de liaison pour l'ADN.

Livraison génique et hémolyse

Les complexes AuNP-plasmide ont atteint l'expression GFP dans cellules Sarcome 180, tandis que plasmide nu ne l'a pas. L'hémolyse est restée < 8 % à concentrations jusqu'à 20 µl mL⁻¹, confirmant faible toxicité sanguine.

Conclusions

Le champignon mycorhizien comestible Tricholoma crassum permet la synthèse verte rapide d'AuNP enrobées de protéines aux formes diverses et aux propriétés antimicrobiennes, apoptotiques et vecteur de gènes robustes. La couronne protéique naturelle 40 kDa assure stabilité colloïdale et fonctionnalisation, tandis que les données d'hémolyse soutiennent un usage thérapeutique sûr. La production à grande échelle en fermenteurs est faisable, offrant une plateforme évolutive pour applications antimicrobiennes, anticancéreuses et nanomédecine.