Évaluation des propriétés antimicrobiennes, apoptotiques et d'administration de gènes de cellules cancéreuses de nanoparticules d'or protéinées synthétisées à partir du champignon mycorhizien comestible Tricholoma crassum

Contexte

Avec l'application inévitable et généralisée des nanoparticules dans l'agriculture, la médecine et les produits ménagers, il y a une pression accrue pour comprendre les effets nocifs et les moyens de les réduire [1]. La synthèse verte de nanomatériaux à l'aide d'organismes vivants ou de leurs enzymes a l'avantage d'être écologique, rentable et sans danger pour des usages thérapeutiques [2]. Parmi les microbes, les champignons filamenteux ont une plus grande capacité à synthétiser des nanoparticules en raison de leur capacité à sécréter de plus grandes quantités d'enzymes [3, 4]. Des nanoparticules d'or extracellulaires (AuNPs) ont été produites à l'aide de plusieurs champignons [5,6,7], mais seules quelques mentions d'enveloppes de protéines naturelles sur ces particules dans ces rapports [8, 9].

En médecine, avec l'arrivée des bactéries multirésistantes, les nanoparticules sont l'alternative car elles n'engendrent pas de résistance [10]. Les AuNP sont spécifiquement prometteuses dans la thérapie et le diagnostic des cellules tumorales et la délivrance de gènes à base de nanotransporteurs [11,12,13]. Dans des conditions physiologiques, les AuNPs présentent une faible perméabilité à travers la membrane cellulaire, mais dans les cellules tumorales, l'absorption est améliorée en raison de l'effet amélioré de perméation et de rétention (EPR) [14]. Cette absorption est encore améliorée lorsque les AuNPs sont coiffées de protéines. Le capuchon protéique aide à stabiliser les nanoparticules à l'état colloïdal et fournit des sites d'amarrage pour les médicaments ou les gènes à administrer [14]. Cependant, le processus de coiffage implique des étapes supplémentaires. La mise à disposition de bouchon protéique naturel élimine l'application de voies chimiques qui sont pour la plupart dangereuses [5]. Malgré son importance, il existe peu de rapports concernant la synthèse verte de nanoparticules de métaux nobles avec des enveloppes de protéines naturelles [15, 16].

Avant l'application des AuNPs en thérapie, un aspect important à analyser est la biocompatibilité d'un nanomatériau avec les membranes cellulaires [6]. Un autre aspect est la cytotoxicité et les AuNP peuvent agréger les globules rouges [13]. Par conséquent, l'accent doit être mis sur les aspects dangereux et l'utiliser dans des limites de sécurité [7, 17].

Notre laboratoire a signalé à ce jour les seuls champignons mycorhiziens comestibles à produire des nanoparticules d'argent extracellulaires, le champignon étant le Tricholoma crassum (Beurk.) Sacc [2]. Ici, nous décrivons la synthèse verte des AuNPs de T. crassum de la gamme de taille 5-25 nm et de différentes formes. Ceux-ci ont été caractérisés et testés pour leur activité antimicrobienne contre les bactéries, les champignons ainsi que les bactéries pathogènes multirésistantes (MDR). Ceux-ci ont eu un effet inhibiteur sur la cinétique de croissance des bactéries et la puissance des spores fongiques. Plus important encore, les particules sont naturellement enrobées de protéines. Nous avons testé ces particules pour leur efficacité en tant que véhicule pour la livraison de gènes dans les cellules cancéreuses. Un test d'hémolyse a été effectué pour vérifier la biocompatibilité et la toxicité de ces particules. Les propriétés apoptotiques des AuNPs ont été testées avec des tests de comètes sur des cellules eucaryotes pour estimer une concentration exploitable pour une utilisation thérapeutique avec des effets secondaires minimes. Le présent travail tente donc d'optimiser la synthèse et l'application des AuNPs à l'interface médicale et nanotechnologique dans des limites sûres afin de causer des dommages environnementaux et biologiques minimes.

Méthodes

Champignons, bactéries et conditions de croissance des plantes

Tricholome crassum (Beurk.) Sacc. a été utilisé pour la production de nanoparticules. Pour les tests antimicrobiens, E. coli (DH5α), Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), des souches multirésistantes (MDR) de E. coli (DH5α), et A. tumefaciens (LBA4404) ont été utilisés. Les champignons phytopathogènes Magnaporthe oryzae et Alternaria solani ont été utilisées. Des semis de tomates (variété Pusa Ruby) et de tabac (variété SR1) ont été cultivés sur le sol dans des chambres de croissance avec des photopériodes lumière/obscurité de 16:8 h, 28 ± 1 °C et une intensité lumineuse de 50 μmol m ^− 2 s ^− 1 .

Synthèse des AuNP

T. crassum le mycélium a été cultivé dans un bouillon de dextrose de pomme de terre (PDB) pendant 7 jours à 28 °C. 1 g de tapis mycélien a été agité avec 10 ml d'eau déminéralisée sur un agitateur à 50 tr/min pendant 24, 48 et 72 h à 28 °C. Les surnageants ont été filtrés sur papier filtre Whatman no. 1. Le filtrat cellulaire (pH 5,2) a été incubé avec une solution aqueuse 1 mM de chloroaurate (HAuCl₄ ) et agité à 28 °C à l'obscurité selon notre rapport [2] pendant 1 h pour chaque type de filtrat cellulaire réalisé par 24, 48 et 72 h d'incubation avec du mycélium.

Pour la biosynthèse des AuNPs à différents pH, 1 M de HCl ou 1 M de NaOH a été utilisé pour ajuster le pH du filtrat sans cellules à une plage acide (3,5) et alcaline (7, 8 et 9) avant l'incubation. Les AuNPs ont également été synthétisés en utilisant différentes températures de réaction (0, 15, 28, 75 et 100 °C), différentes concentrations de filtrat acellulaire (× 0,5, × 1, × 2) et des ions chloroaurate (0,5, 1, 2 mM ).

Spectroscopie UV-visible

L'absorbance des surnageants de chaque filtrat cellulaire incubé pendant 1 h avec une solution de chloroaurate a été analysée à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible entre 450 et 750 nm a été utilisé pour tracer les spectres d'absorbance.

Microscopie électronique à balayage (MEB), microscopie électronique à transmission (MET), microscopie à force atomique (AFM) et diffraction des rayons X (XRD)

Ces analyses ont été faites selon Chowdhury et al. [15] avec quelques modifications. Nanoparticules d'or produites à l'aide de filtrats cellulaires de 24 h suivis de 1 h d'incubation avec 1 mM de HAuCl₄ solution à 28 °C (pH 5,5) a été caractérisée en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB), la microscopie électronique à transmission (MET), la microscopie à force atomique (AFM) et la diffraction des rayons X (XRD). Un film mince des AuNPs sur un talon de verre a été séché sous vide et a été soumis à SEM en utilisant FEI Quanta 200 (FEI, USA).

Les formes et les tailles de l'AuNP ont été déterminées par MET. Une goutte (10 μl) de la suspension AuNP a été placée sur des grilles de cuivre recouvertes de carbone et a été soumise à une dessiccation sous vide avant d'être chargée sur un porte-échantillon. Des micrographies MET de ces nanoparticules ont été obtenues à l'aide de TECNAI G TEM avec une construction basse tension (100 kV).

Pour l'imagerie AFM, les AuNP ont été déposées sur une feuille de mica Ruby muscovite fraîchement clivée (Ruby Mica Co. Ltd., Inde) et ont été séchées à l'aide d'un séchoir sous vide. L'AFM en mode courant alternatif acoustique (AAC) a été réalisé à l'aide d'un AFM Pico plus 5500 ILM (Agilent Technologies, États-Unis).

Pour l'étude XRD, un film mince de suspension AuNP a été étalé uniformément sur une lame de verre et a été séché à l'aide d'un séchoir sous vide. Les diagrammes XRD ont été enregistrés dans un système D8 Advance DAVINCI XRD (Bruker AXS Pvt. Ltd.) fonctionnant à une tension de 40 kV et un courant de 40 mA avec un rayonnement CuKα (λ = 1,54060/1,54443 Å), et les intensités diffractées ont été enregistrées de 35° à 80° 2θ d'angle.

Analyse de logiciels informatiques

Les mesures des AuNPs et la construction d'un histogramme ont été effectuées à l'aide du logiciel OLYMPUS MEASURE IT tool. La concentration de nanoparticules a été calculée selon Sriram et al. [18] et notre publication précédente, Chowdhury et al. [15].

Transformation de bactéries pour développer une multirésistance aux médicaments

A. tumefaciens souche LBA4404 et E. coli souche DH5α ont été rendues multirésistantes par transformation en utilisant les plasmides pCAMBIA2301 et pUC19 avec pZPY112, respectivement, en utilisant notre protocole publié [2, 15].

Tests antibactériens et tests de croissance bactérienne

Ces dosages ont été effectués selon notre protocole publié [15]. Nanoparticules d'or, qui ont été synthétisées à l'aide de filtrats cellulaires de 24 h et d'1 h d'incubation avec 1 mM de HAuCl₄ solution à 28 °C (pH 5,5), ont été utilisés pour tous les tests biologiques. Pour les tests sur disque de papier, des quantités croissantes d'AuNPs polydisperses (0,249, 0,498, 0,747, 0,996, 1,245 μg) ont été utilisées. À partir de cultures fraîches d'une nuit de chaque souche bactérienne, une aliquote de 25 μL a été étalée sur des plaques de gélose LB. Des séries de dilution de la solution de nanoparticules ont été constituées à l'aide d'une solution d'AuNP de concentration 31,121 mg/L et d'eau déminéralisée stérile. Des disques de papier stérile de 5 mm de diamètre avec une quantité croissante de nanoparticules d'or dans chaque disque telles que 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 et 1,245 μg (dans un volume total de 40 μl) ont été placés sur les plaques bactériennes et incubés. A. tumefaciens les plaques ont été incubées à 28 °C pendant 48 h et E. coli à 37 °C pendant 12 h. Pour les tests de croissance de DH5α et LBA4404, 7,5 ml de culture bactérienne ont été complétés par 2,5 mL d'AuNPs.

Dosage antifongique

Suspension aqueuse de M. oryzae spores a été faite à 6,1 × 10 ⁵ spores/ml avec un hémocytomètre. 150 μl de cette suspension ont été étalés sur plaque MEA. Des disques de papier stérile de 5 mm de diamètre avec des quantités croissantes d'AuNPs polydispersées (0,249, 0,498, 0,747, 0,996 et 1,245 μg) ont été placés sur les plaques et incubés à 28 °C. Les zones d'inhibition ont été mesurées après 2 jours.

Test antimicrobien pour les cellules bactériennes traitées avec AuNPs

La culture LBA4404 liquide pendant la nuit a été traitée avec un volume égal de suspension AuNP (15,56 mg/L) pendant 12 h à 28 °C. 50 μl de la suspension ont été mélangés avec un volume égal de solution de bleu Trypan à 0,4 % (0,5 g de bleu trypan, 500 ml de glycérol, 450 ml de H₂ distillé O, 50 ml de HCL) a été observée au microscope composé (Leica DMLS, Allemagne).

Test de germination de spores fongiques en présence d'AuNPs

Une série de dilutions de nanoparticules a été réalisée avec 20, 40, 60, 80 et 100 % v /v en utilisant une solution mère de nanoparticules de concentration 15,56 mg/L portant le volume final à 100 μl avec de l'eau. Des volumes égaux de ces suspensions ont été ajoutés à 50 μl d'Alternaria solani suspension de spores (4,2 × 10 ⁵ spores/ml) et incubé à 28 °C. Les spores ont été observées à 0, 2, 4 et 6 h au microscope composé (Leica DMLS, Allemagne).

Tests de comète

Les propriétés apoptogéniques des AuNPs ont été mesurées par test standard des comètes [19] avec peu de modifications. Les feuilles de tabac ou de tomate ont été exposées à des concentrations croissantes (0, 15, 20 et 30 % v /v pour le tabac; 5, 10, 15 et 20 % v/v pour la tomate) d'AuNPs (stock de 15,56 mg/L) pendant 24 h. L'électrophorèse des noyaux isolés a été réalisée à 0,74 V/cm (25 V, 300 mA) pendant 30 min à 4 °C. Les lames ont été neutralisées avec du tampon Tris 0,4 M, déshydratées dans du méthanol, colorées au bromure d'éthidium (20 μg/ml) et observées au microscope à fluorescence avec un filtre d'excitation de 515-560 nm et un filtre barrière de 590 nm. Les données ont été analysées avec le logiciel Tritek CometScore.

SDS-PAGE

Les protéines ont été isolées selon notre publication [15]. Pour l'analyse des protéines liées aux nanoparticules, les AuNPs ont été lavées avec de l'eau stérile et bouillies dans du tampon Laemmli pendant 10 min et centrifugées à 8000 rpm pendant 10 min. Les échantillons traités et non traités au SDS ont été analysés sur SDS-PAGE à 12 %.

Culture de lignées cellulaires cancéreuses

La lignée cellulaire Sarcoma 180 a été cultivée dans du milieu RPMI 1640 [20] contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 200 U/ml de pénicilline et 200 μg/ml de streptomycine à 37 °C, 5 % de CO₂ en incubateur humidifié.

Livraison du complexe ADN plasmidique-AuNP dans des cellules cancéreuses

Le plasmide a été isolé à partir de DH5α contenant pCAMBIA1302 en utilisant le protocole publié [15]. Le plasmide contenant la construction de gfp la séquence clonée sous le promoteur pCaMV35s a été délivrée dans des cellules Sarcome 180 en utilisant un protocole standard [21]. Les cellules ont été visualisées au microscope à fluorescence en utilisant un filtre spécifique de la GFP (excitation maximale   =395 nm) (Axioskop-40, Carl Zeiss). Les cellules traitées avec de l'ADN plasmidique nu ont été conservées comme contrôle.

Test hémolytique

Le dosage hémolytique a été réalisé selon le protocole standard [22]. Volumes égaux d'érythrocytes (1,6 × 10 ⁹ érythrocytes/mL) ont été traités avec des concentrations variables d'AuNPs (0,1, 0,5, 1, 5, 10 et 20 μl/mL à partir d'un stock de 15,56 mg/L) pendant 1 h et les activités hémolytiques des nanoparticules à différentes concentrations ont été calculées.

Résultats et discussion

Biosynthèse des AuNPs à pH 5,5

Au cours de la synthèse, la formation de l'AuNP est indiquée par le changement de couleur du filtrat cellulaire du jaune clair au violet [23] en raison du changement de la résonance plasmonique de surface (SPR). 1 mM HAuCl₄ solution sans filtrat fongique était jaune verdâtre (Fig. 1a, ‘A’) et le filtrat cellulaire de T. crassum qui était jaune pâle (Fig. 1a, 'B'). Après incubation, la couleur du mélange a viré au violet en 1 h (Fig. 1a, « C »), indiquant la formation d'AuNPs.

Biosynthèse d'AuNPs à l'aide de Tricholoma crassum et l'analyse spectroscopique. un Changement de couleur au cours de la réaction. Un Solution 20 mM de HAuCl₄ . B Filtrat cellulaire sans mycélium de Tricholoma crassum . C 1 mM HAuCl₄ avec un filtrat cellulaire de 24 h pendant 1 h montrant une couleur violette indiquant la synthèse des AuNPs. b Spectres UV-vis des AuNPs synthétisés avec différentes périodes d'incubation (24, 48, 72 h). La flèche pleine montre le pic d'absorption à 552 nm pour une période d'incubation de 24 h. La flèche en pointillé montre un léger décalage vers le rouge des maxima d'absorption avec l'augmentation de la période d'incubation. c AuNPs synthétisés sous différents pH montrant différentes couleurs. d Spectres UV-vis du même. La flèche pleine indique le pic d'absorption à 552 nm pour un pH de 5,5 et la flèche en pointillé indique le décalage vers le bleu des maxima d'absorption avec l'augmentation du pH

Un inconvénient des autres méthodes de production de nanoparticules à partir de micro-organismes est qu'elles prennent du temps et que les organismes produisent des toxines. Auparavant, Phanerochate chrysosporium un extrait acellulaire a été utilisé pour produire des AuNPs en 90 min [3]. Récemment, des nanoparticules d'argent et d'or ont été biosynthétisées à l'aide de Sporosarcina koreensis en utilisant un temps de réaction prolongé de 1 à 2 jours [24]. Dans notre rapport, le temps de production d'AuNP a été réduit à 1 h seulement.

Spectroscopie ultraviolet à visible

Les spectres d'absorption optique des nanoparticules métalliques sont régis par la forme, l'agrégation et le SPR, qui se déplacent en fonction de la taille et de la forme des particules [25, 26]. La figure 1b montre les spectres UV-vis des AuNPs synthétisés à l'aide de filtrats cellulaires produits sur 24, 48 et 72 h suivis de 1 h d'incubation avec 1 mM de HAuCl₄ solution (pH 5,5). Ici, le pic d'absorbance est à 552 nm pour le filtrat cellulaire de 24 h. La bande de résonance plasmonique transversale qui apparaît en premier à 552 nm se déplace légèrement vers le rouge de 24 à 48 et 72 h (représentée par une ligne continue par rapport à une ligne en pointillés Fig. 1b), confirmant un décalage vers le rouge avec une intensité d'absorbance progressivement amplifiée. L'élargissement des pics indique que les particules sont polydispersées. Le fort SPR centré à ca. 550-560 nm est typique de l'or colloïdal (Fig. 1b). À mesure que la concentration du filtrat cellulaire augmentait avec l'augmentation des périodes d'incubation (c'est-à-dire 24, 48, 72 h), l'absorbance augmentait également proportionnellement. Lorsque la réaction a été effectuée à 28 °C, elle a atteint l'équilibre après 1 h et est restée stable pendant 30 jours sans aucun signe d'agrégation probablement dû à l'enveloppe protéique stabilisante. Dans des études précédentes, les AuNPs revêtus de BSA n'ont montré aucune agrégation [27]. D'autres études ont été réalisées en utilisant des AuNP préparées avec un filtrat cellulaire de 24 h.

Biosynthèse d'AuNPs à différents pH et spectroscopie UV-vis

Les AuNPs ont été synthétisés à différents pH de 3,5, 5,5, 7, 8 et 9, ce qui a donné une coloration rose à violet foncé (Fig. 1c). La spectroscopie UV-vis a montré les maxima d'absorbance et la longueur d'onde SPR a augmenté de pH 3,5 à pH 5,5, ce qui a entraîné un décalage vers le rouge. Cependant, avec une augmentation supplémentaire du pH de 7 à pH 9, les maxima d'absorbance et la longueur d'onde SPR ont diminué, montrant un décalage vers le bleu (Fig. 1d). Le pic à pH 9 avait une amplitude plus petite et une couleur inchangée, indiquant que seules de petites quantités d'AuNP se sont formées. S'agissant d'une biosynthèse enzymatique, le pH 9 a probablement inhibé la réaction enzymatique nécessaire à la formation des AuNPs (Fig. 1d). Les nanoparticules produites à différents pH ne se sont pas agrégées après 1 mois à température ambiante.

Production d'AuNPs en utilisant différentes températures, concentrations de substrat et concentrations de précurseur

L'optimisation des conditions physico-chimiques au cours de la biosynthèse est essentielle pour la génération de nanoparticules fonctionnellement efficaces [28]. La synthèse utilisant des concentrations plus élevées de filtrat a montré une production accrue d'AuNPs avec plus d'intensité de couleur et de maxima d'absorbance (Fig. 2a, b). Un léger décalage vers le bleu de la résonance plasmonique de surface localisée maximale (LSPR) a été observé pour la synthèse avec un filtrat × 2 indiquant une distance interparticulaire accrue et une taille de cluster réduite [29, 30].

Biosynthèse et spectroscopie UV-vis des AuNPs de Tricholoma crassum utilisant différents paramètres de synthèse. un , b Différentes concentrations de filtrat cellulaire. c , d Différentes concentrations de HAuCl₄ . e , f Différentes températures de réaction. g , h Dans l'obscurité et sous la lumière. La flèche pleine montre le pic d'absorption typique à 552 nm pour × 1 filtrat cellulaire et 1 mM HAuCl₄ à 28 °C pH 5,5 et la flèche en pointillé indique le décalage bleu des maxima d'absorption, la flèche en pointillé montre le décalage rouge dans la bande SPR

Sur les trois concentrations de chlorure d'or testées (0,5, 1 et 2 mM), la synthèse était maximale pour 1 mM, avec des maxima d'absorption à 552 nm. (Fig. 2c, d). 28 °C s'est avéré optimal pour la synthèse. Des températures plus élevées (75 et 100 °C) bien que médiées par une synthèse plus rapide des AuNPs, la couleur sombre et le décalage vers le rouge du maximum d'absorption (Fig. 2e, f) indiquent des particules plus grosses qu'à 28 °C. À 0 et 15 °C, il n'y avait pas de développement de couleur ou de pic d'absorbance entre 550 et 600 nm. La synthèse à la lumière a entraîné une coloration violet foncé (Fig. 2g) et un décalage vers le rouge du maximum d'absorption avec un pic large (Fig. 2h) signifiant des particules plus grosses. La taille et le nombre de particules ont été dosés avec du DLS (Fig. 3a–j). Cette variation de la taille et de l'agrégation des nanoparticules dépend de la nature et de la quantité de matière organique associée [30] qui varie là encore avec les conditions de synthèse.

DLS montrant les distributions de taille des AuNPs synthétisés a avec × 1 filtrat sans cellules, 1 mM HAuCl4 à 28 °C à l'obscurité, b sous la lumière, c avec × 0,5 filtrat sans cellule, d avec × 2 filtrat sans cellules, e à 0 °C, f à 15 °C, g à 75 °C, h à 100 °C, i avec 0,5 mM HAuCl₄ et j avec 2 mM HAuCl₄

Microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (MET)

Le SEM a montré des AuNP de petites tailles et de formes géométriques distinctes à un grossissement × 80000 (Fig. 4a). L'analyse MET a clairement montré des AuNPs polydispersés d'un diamètre compris entre 2 et 22 nm (Fig. 4b). Le graphique de distribution des tailles montre que les AuNP de la plage de tailles 5 à 10 nm étaient de la fréquence la plus élevée, suivies successivement de 2 à 5 nm, 10 à 15 nm, 15 à 20 nm et 20 à 22 nm (Fig. 4c). Il s'agissait de différentes formes géométriques comme de petits cercles ou losanges d'un diamètre de 5 nm ou moins, des hexagones, des cuboïdes, des triangles isocèles et des triangles presque équilatéraux avec des côtés variant de 4,36 à 22,94 nm (Fig. 4d, e).

Microscopie électronique des AuNPs. un SEM à un grossissement de × 80 000. b MET montrant des particules dispersées de différentes tailles dans un champ microscopique. c Un histogramme montrant la distribution granulométrique des AuNPs. Vue agrandie d'AuNPs individuels montrant différentes formes géométriques et leurs représentations schématiques avec des dimensions. d Sphérique (à gauche) et rhomboïdal (à droite) de petite taille. e De gauche à droite :hexagonale, triangulaire équilatérale, rhomboïdale, polyédrique et triangulaire isocèle

Microscopie à force atomique (AFM)

La figure 5a montre une image AFM des AuNPs dispersés. La vue en deux dimensions (Fig. 5a) montre que les particules avaient une épaisseur de surface presque similaire. Les hauteurs de ces particules ont été visualisées avec un AFM 3D à surface unique (Fig. 5b). Le graphique AFM 2D des AuNPs se trouvant sur une zone linéaire aléatoire (marquée par une ligne pointillée, Fig. 5c) montre des hauteurs allant de 1 à 4 nm. La bande de plasmon de surface plane indiquait que l'épaisseur des particules était inférieure à la longueur du bord.

AFM et diffraction des rayons X des AuNPs. un Image AFM :vue de dessus. b Image AFM :vue en trois dimensions. c Une image AFM des AuNPs et un profil graphique pour les hauteurs des nanoparticules se trouvant sur la ligne pointillée dans le champ. d Diagramme de diffraction des rayons X des nanoparticules montrant des pics typiques de l'or

Études de diffraction des rayons X (XRD)

Le modèle XRD du film mince des particules a révélé la présence de seulement AuNPs. Un fort pic de diffraction à environ 38° est généralement attribué à la facette {111} de la structure cubique à faces centrées (FCC) [3]. Le modèle XRD ici a montré un pic de diffraction dominant à 38,23 attribué à la structure FCC. Les pics de diffraction des quatre autres facettes étaient plus faibles. Les quatre pics de diffraction de Bragg distincts à 38,23, 44,31, 64,60, 77,58 et 81,63 correspondaient étroitement à ceux des AuNP (Fig. 5d, fichier supplémentaire 1 :tableau S1).

Calcul de la concentration d'AuNPs

La concentration des nanoparticules [15] s'est avérée être de 15,56 mg/L pour les particules produites avec un filtrat cellulaire de 24 h incubé avec 1 mM de HAuCl₄ .

Dosage antimicrobien des AuNPs utilisant des bactéries et des champignons pathogènes

Les AuNPs présentaient de fortes activités antimicrobiennes contre les bactéries humaines ainsi que les bactéries et les champignons phytopathogènes. L'activité antimicrobienne des nanoparticules a été testée à l'aide de disques de papier avec des quantités croissantes d'AuNP, c'est-à-dire 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 et 1,245 μg. Bactéries humaines E. coli (DH5α), la bactérie phytopathogène A. tumefaciens (LBA4404) et le champignon phytopathogène M. oryzae ont été utilisées. Les AuNP étaient inhibiteurs pour tous ces micro-organismes, même aux concentrations les plus faibles, et les zones d'inhibition augmentaient proportionnellement à l'augmentation de la concentration en particules (Fig. 6). La figure 6a–c montre que les zones d'inhibition pour E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) et M. oryzae , respectivement. La figure 6f–h montre le graphique des zones d'inhibition de ces trois microbes en fonction de la quantité d'AuNPs utilisée. L'extrait fongique seul n'a eu aucun effet inhibiteur. La tendance comparative de l'inhibition pour les trois microbes indique un effet inhibiteur plus important sur DH5α par rapport à celui de LBA4404 et M. oryzae (Fichier supplémentaire 2 : Fig. S1a).

Dosage des propriétés antimicrobiennes des AuNPs sur les bactéries pathogènes, les champignons et les bactéries multirésistantes (MDR). un , f Plaques et graphiques correspondants montrant le test de diffusion sur disque des nanoparticules avec des zones d'inhibition croissantes pour E. coli . Zones d'inhibition obtenues dans des essais similaires avec b , g Agrobacterium tumefaciens . c , h Magnaporthe oryzae . d , je MDR E. coli . e , j MDR A. tumefaciens . Toutes les expériences ont été réalisées avec des quantités croissantes d'AuNPs sur des disques de papier ; dans le sens des aiguilles d'une montre à partir du haut :0,249 μg (20 %), 0,498 μg (40 %), 0,747 μg (60 %), 0,996 μg (80 %) et 1,245 μg (100 %) d'AuNP. Les données sont des moyennes  ± SE de trois répétitions. Des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives entre les échantillons (P < 0,05, test HSD de Tukey). Effet des AuNPs sur la courbe de croissance de k E. coli , l A. tumefaciens , m MDR E. coli , et n MDR A. tumefaciens . Les astérisques indiquent des différences significatives à contrôler (t de l'étudiant essai, P < 0,05). o Microscopie du contrôle A. tumefaciens cellules. p A. tumefaciens montrant une perte d'intégrité cellulaire après traitement avec les AuNPs

Dosage de l'activité antimicrobienne des AuNP à l'aide de bactéries pathogènes humaines et végétales multirésistantes

DH5α et LBA4404 portant des plasmides multirésistants (MDR) avec des gènes de résistance ont été fabriqués. Le MDR DH5α portant pUC19 était résistant à 100 µg/ml d'ampicilline et 35 µg/ml de chloramphénicol. LBA4404 transformé avec pCAMBIA2301 était résistant à 25 ug/ml de rifampicine et 50 ug/ml de kanamycine. Les AuNPs ont montré une puissante activité inhibitrice contre MDR DH5α et MDR LBA4404 (Fig. 6d, e). Les figures 6i, j sont les graphiques montrant l'augmentation de l'inhibition avec l'augmentation de la concentration des nanoparticules. La tendance comparative de l'inhibition pour les deux bactéries MDR indique des zones inhibitrices plus importantes pour A. tumefaciens par rapport à celui de E.coli (Fichier supplémentaire 2 : Fig. S1b).

Test de croissance bactérienne au cours du temps en présence d'AuNPs

La courbe de croissance de DH5α traité avec AuNPs était significativement différente de l'ensemble de contrôle (Fig. 6k, m). Dans les ensembles témoins de DH5α et MDRDH5α, la phase logarithmique de la courbe de croissance a commencé dans les 2 h suivant l'inoculation, tandis que dans les DH5α et MDR DH5α traités par AuNP, aucune croissance n'a été observée jusqu'à 6 h après l'inoculation. Les courbes de croissance ont atteint la phase stationnaire après 12 h dans les cellules témoins et traitées, mais la croissance a été significativement réduite dans le cas des bactéries traitées. La courbe de croissance LBA4404 a montré l'initiation de la phase log à 4 h après l'inoculation dans le groupe témoin contre 6 h dans le groupe traité AuNP. Un effet similaire sur la courbe de croissance du MDR LBA4404 a été observé bien que dans le témoin MDR LBA4404, la phase logarithmique ait commencé dans les 2 h (Fig. 6l, n).

Effet des AuNPs sur la morphologie et la viabilité des cellules bactériennes

En général, la plupart des nanoparticules peuvent adhérer efficacement aux membranes cellulaires, s'adsorber et ensuite affecter l'intégrité cellulaire [31]. Normal A. tumefaciens les bactéries sont en forme de bâtonnet avec des contours clairs (Fig. 6o). Les bactéries incubées avec les AuNPs présentaient une morphologie déformée, une désintégration de la membrane externe entraînant un contour irrégulier et une perte d'intégrité de la forme et de la taille des cellules (Fig. 6p). Ceci est conforme à celui observé précédemment dans E. coli cellules traitées avec des nanoparticules de silice [32]. Nous avons découvert que l'incubation de cellules bactériennes avec les nanoparticules pendant des périodes plus longues montrait une désintégration complète des cellules.

Test de germination de spores fongiques

Les AuNPs étaient un puissant suppresseur de virulence du champignon phytopathogène Alternaria solani . Le traitement des conidies fongiques avec des doses croissantes d'AuNPs pour différentes périodes d'incubation a montré une diminution progressive des fréquences de germination et de la longueur des tubes germinatifs (Fig. 7a). The representative pictures of conidia (Fig. 7a) and graphs show that the percentage of germination (Fig. 7b) and average lengths of the germ tubes (Fig. 7c) emerging from the fungal conidia decreased with increasing doses of the particles and increasing incubation periods. Thus, these AuNPs had significant antifungal property which is mediated through the suppression of germination of spores and retardation in the growth of hyphae.

Effect of the AuNPs on the spore germination of plant pathogenic fungus Alternaria solani; un Spores after treatment with AuNPs (bar = 30 μm). Rows top to bottom:control spores followed by spores treated with different dilutions of AuNPs (15.56 mg/L stock). Columns left to right:increasing time of incubation with AuNPs showing least germination at 6 h incubation with 100% AuNPs. b Spore germination frequency (%) at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Asterisks indicate significant differences to control (Student’s t test, P < 0,05). c Average germ tube length at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Duncan’s multiple range test). Spore germination frequency and the average germ tube length decreased with increasing doses of the AuNPs and increasing incubation period

Thus, these AuNPs have antimicrobial functions on bacteria as well as fungi, which is rarely reported for AuNPs. These AuNPs being toxic to multi-drug-resistant human bacteria can be utilized in treatment of MDR or extensively drug-resistant (XDR) bacteria-related human diseases which are difficult to treat. Furthermore, the antimicrobial effect against typical phytopathogens like Agrobacterium and fungi, it makes the particles suitable for as bacteriocides and fungicides in the form of nano-agrochemicals. These would enable sustainable management of crop loss through elimination of excessive and indiscriminate use of agrochemicals causing deterioration of soil health, degradation of agro-ecosystem, environmental pollution, and resistance in pathogens [33].

The AuNPs have potent apoptogenic properties

The single cell gel electrophoretic assay or comet assay is a sensitive method to compare apoptoic effects of materials [34, 35]. Treatment of tobacco leaf cells with 7.78 mg/L of AuNPs for a period of 15, 20, and 30 min resulted in gradual increase in apoptosis indicated by increase in percentage of DNA in tail (Fig. 8a, ‘A’, ‘B’, ‘C’, ‘D’). The maximum migration of DNA occurred after 30 min of treatment showing a tail DNA value 28.44 ± 0.74% which was significantly higher than that of untreated control cells (1.7 ± 0.59%). The incubation periods of 15 and 20 min caused less DNA migration with tail DNA values of 7.25 ± 2.56 and 19.19 ± 1.54%, respectively (Fig. 8b). Therefore, these AuNPs have the capacity to induce apoptosis in eukaryotic cells in higher doses. Recently, nanoparticles are being used in novel strategies to target and kill cancer cells. As illustrated by dynamic and quantitative imaging, successful application of nanoparticles as an alternative therapy for cancer depends on the apoptotic properties of the particles [36]. Hence, the present finding shows potent apoptogenic properties of these AuNPs which holds promise in future cancer therapy.

Assay of apoptotic properties of the AuNPs. un Comet assay and fluorescent microscopic images of nuclei of tobacco leaves treated with AuNPs for A 0 min. B 15 min, C 20 min, and D 30 min (bar = 5 μm). In the control sets (0 min incubation), most of the DNA is located in the head of the comet while cells subjected to longer treatment show increasing DNA damage and longer comet tails. b Mean of % tail DNA ± SE after different periods of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P < 0.05, Tukey’s HSD test). c Assay of threshold dosage of AuNPs for apoptosis showing images of nuclei of tomato leaf cells treated with A 0% (control), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% of AuNP suspension for 24 h (bar = 10 μm). d Mean % tail DNA ± SE after 24 h treatment with different concentration of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test). Dosage below 10% show negligible DNA damage while higher than 20% show start of DNA damage

These AuNPs are non-apoptogenic at lower doses

Safe application of metal nanoparticles as therapeutic agent needs a pre-determination of biological effect of the particles at the borderline toxicity [37]. A threshold level of nanoparticles required for apoptosis was obtained through treatment of tomato leaf cells with different concentration of AuNP for 24 h (Fig. 8c). Low concentration, e.g., 5% v /v of AuNP stock suspension (15.56 mg/L) did not show significant apoptogenic effect on tomato cells even after 24 h of exposure. The nuclei after 10% AuNP treatment showed 6.52 ± 0.63 percentage of DNA in tail which was higher than untreated control nuclei (0.95 ± 0.66 percentage of DNA in tail) and those treated with 5% AuNP suspension (1.04 ± 0.89 percentage of DNA in tail). Treatment of tomato leaf cells with 15 and 20% AuNP resulted in a slight rise in DNA damage showing 7.15 ± 1.70 and 13.47 ± 2.16 percentage of DNA in tail, showing significant apoptogenic effect (Fig. 8d). Thus, in lower doses apoptogenic effect is negligible holding the possibility for these nanoparticles to be used as antimicrobial agent or drug/gene delivery vehicle in eukaryotic cells.

The AuNPs are protein-coated

A few previous studies have mentioned nanoparticles coated with protein of natural origin [15]. Lower magnification TEM showed that the AuNPs are surrounded by protein-like material (Fig. 9a, b). In order to confirm the nature of the material, the AuNPs were washed and run on SDS-PAGE along with cell-free extracts in other lanes (Fig. 9c). Boiling in SDS served to detach the surface bound proteins from the nanoparticles. The boiled nanoparticles (lane 4) showed the presence of a single intense band of 40 kDa which was similar to a protein band present in lane 2 (cell filtrate). However, in the sample that was not boiled (lane 3), a faint protein band bound to AuNP was seen at the 116 kDa level. Although another faint band did appear at the 40 kDa level due to dissociation of the capping proteins from the particles. Protein coats are known to promote stability of nanoparticles in solution and their catalytic activity [28, 38]. The naturally formed protein coat around the nanoparticles makes them functionally efficient for biomedical uses including easy adsorption and delivery of DNA or hydrophobic drugs [39]. Peptides and protein-aided delivery of AuNPs have been successfully used to overcome blood-brain barrier in treatment of central nervous system disorders [14]. Hence, these biocompatible AuNPs can be potentially suitable for several biomedical applications due to the small size, unique physico-chemical properties, and other advantages.

Protein cap analysis. un , b TEM images showing capping protein layer (arrows) around AuNPs. c SDS-PAGE of extracellular protein secreted from T. crassum and protein associated with nanoparticles. Lane 1, molecular size marker. Lane 2, total extracellular protein. Lane 3, nanoparticles loaded without boiling show faint protein band bound to the AuNPs at 116 kDa mark. There is also a band of detached protein at 40 kDa mark. Lane 4, nanoparticles after boiling with 1% SDS loading buffer showing disappearance of the 116 kDa band and a distinct 40 kDa band. Arrow indicates 40 kDa

The AuNPs could deliver green fluorescence protein (GFP) gene into Sarcoma 180 cancer cell lines

Plasmid DNA pCAMBIA1302 harboring gfp marker gene, complexed with AuNPs, was used to treat Sarcoma 180 cells. The cells produced green fluorescence indicating uptake of plasmid DNA/AuNPs complex and subsequent expression of the gene in the cancer cell, while the cells treated only with naked plasmid DNA did not show the fluorescence (Fig. 10a, b). This confirms the high potential of these particles to not only deliver genes into cancer cells, the genes were stably expressed and remained functional once delivered into the cells.

Gene delivery using AuNPs into Sarcoma 180 cancer cells and hemolysis assay with human erythrocytes; fluorescence microscopic image of a cancer cells expressing green fluorescence protein after uptake of DNA-AuNP complex and b control cells treated with free plasmid DNA (bars = 20 μm). c Percentage hemolysis with different dilutions of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test)

Earlier metallic nanoparticles have been shown to exhibit immense therapeutic potential in treating variety of diseases like retinal neovascularization, HIV, Dalton’s lymphoma, and exhibited activity against hepatitis virus, respiratory syncytial virus, and herpes simplex virus [18]. Congruent to these reports, gold nanocarrier-based drug delivery in present study using AuNPs can be considered as a prospective mediator in numerous medical applications including diagnostics, drug delivery, and cancer therapeutics.

Compatibility of the AuNPs with human erythrocytes and toxicity assay

Erythrocytes are simple and convenient model of the cell membrane system and used for studying nanoparticle-membrane interactions [40]. The hemolytic assay elucidates membrane-lytic activity of the AuNPs at different concentrations. Figure 10c shows that membrane-lytic activity of the nanoparticles was negligible at low concentrations. The highest hemolytic activity found at higher concentrations of nanoparticle suspension (up to 20 μl/mL) was less than 8% which indicates very low blood toxicity. The gradually increasing hemolytic activity with increasing concentration of AuNPs is likely due to increased affinity and adhesion of larger number of particles with the erythrocytes. This affinity of the particles to cell membranes is expected to facilitate their cellular transport. Low hemolytic activity along with effective cellular uptake render nanoparticles highly suitable for the development of safe and efficient theranostic agents [41].

Conclusions

Use of edible mycorrhizal fungus to synthesize AuNPs of different geometric shapes in short reaction time with natural protein coat make this method simple and unique. The protein coat coming from the edible fungus did not have appreciable toxic effects and favor easy attachment of DNA onto the surface of the particles. Overall, these AuNPs show promise as antimicrobial, apoptotic agents for gene delivery into cancer cells.

Since filamentous fungi can withstand flow pressure or agitation [15], T. crassum can be cultured in fermentors to produce AuNPs on a large-scale using non-toxic agricultural wastes, allowing for easy withdrawal of product and system replenishing options [2]. Since the AuNPs are of different geometric shapes, there is the scope shape-based assortment with mechanical means such as centrifugation [42] and can be utilized according to their specific shape-based properties.