Nanoparticules d'albumine conjuguées à un colorant et chargées d'artésunate et dans le proche infrarouge en tant qu'agent photo-chimiothéranostique à haute efficacité ciblant les tumeurs

Contexte

Au cours de ces dernières décennies, la photochimiothérapie guidée par imagerie (IGPC) a suscité un grand intérêt de la part de nombreux chercheurs, car il s'agit d'une stratégie prometteuse pour réaliser une thérapie tumorale personnalisée [1, 2]. L'IGPC permet la localisation exacte de la tumeur et trace le médicament in vivo, garantissant une thérapie efficace et réduisant les effets secondaires [3, 4]. Pour être efficace, l'IGPC doit avoir les caractéristiques suivantes :(i) un agent théranostique multifonctionnel avec à la fois des fonctions d'imagerie et thérapeutiques est nécessaire; (ii) l'agent théranostique doit être biocompatible, stable et spécifique contre la tumeur [5,6,7,8]. La modalité de diagnostic par imagerie dans l'IGPC comprend généralement l'imagerie par résonance magnétique, l'imagerie photoacoustique et l'imagerie par fluorescence [9,10,11,12,13,14]. En raison de la sensibilité élevée, de la résolution temporelle favorable et du rapport signal sur fond élevé, l'imagerie par fluorescence était généralement appliquée à la recherche fondamentale et à la pratique clinique [15, 16].

Les méthodes de photo-chimiothérapie comprennent principalement la thérapie photothermique (PTT), la thérapie photodynamique (PDT) et la chimiothérapie. Étant donné que l'irradiation proche infrarouge (NIR) est la même, les fonctions PTT et PDT peuvent être intégrées en une seule, permettant une destruction sélective et efficace de la tumeur grâce à un faisceau laser. Cependant, il a été rapporté que la thérapie photothermique et photodynamique (PTT-PDT) a souvent la limitation d'une suppression tumorale incomplète, ce qui peut potentiellement générer une rechute tumorale [17,18,19]. La chimiothérapie, une méthode de traitement largement utilisée contre le cancer, peut tuer efficacement les cellules tumorales par administration systémique, bien que la toxicité pour les cellules normales voisines en raison de sa non-spécificité limite son application [20,21,22]. Par conséquent, la combinaison IGPC pourrait être une excellente stratégie pour surmonter les limitations ci-dessus.

Avec le développement de la nanomédecine, des agents théranostiques IGPC ont été développés, notamment le vert d'indocyanine (ICG), des nanoparticules à base de métal, des nanomatériaux de carbone et des nanomatériaux polymères [23,24,25,26,27]. Parmi eux, l'ICG a été approuvé par la FDA et son utilisation en pratique clinique est signalée pour détecter le débit cardiaque, la fonction hépatique, le flux sanguin et l'angiographie ophtalmique [28, 29]. De plus, l'ICG a une efficacité d'absorption élevée dans la région NIR, induisant ainsi un effet PTT-PDT élevé sous une seule irradiation NIR [30]. Cependant, les inconvénients suivants, tels que l'instabilité en solution aqueuse, la clairance rapide dans le corps, la tendance à l'auto-blanchiment et le manque de ciblage, entravent gravement son application étendue [31, 32]. Pour surmonter ces limitations, les molécules d'ICG libres sont généralement transportées par des véhicules comprenant des micelles, des nanoparticules de polymère et des nanostructures de protéines auto-assemblées, pour former des nanocomposites [33, 34]. Bien que des travaux connexes soient disponibles, des nanocomposites à base d'ICG plus biocompatibles et plus innovants sont toujours demandés pour l'imagerie et la photothérapie in vivo.

Dans ce travail, nous avons rapporté un agent IGPC ciblé qui conjugue de manière covalente l'acide folique (FA) et l'ICG avec des nanoparticules d'albumine sérique humaine (HSA) qui encapsulent également le médicament anticancéreux artésunate (Arte) (FA-IHA NPs). Il a été rapporté que l'AF liait les nanoparticules pour augmenter leur efficacité d'absorption cellulaire via l'endocytose médiée par les récepteurs [17]. La HSA est une protéine endogène. En raison de sa bonne biocompatibilité, de sa non-toxicité et de sa non-immunogénicité, la HSA est devenue l'un des vecteurs les plus intéressants pour délivrer des médicaments anticancéreux insolubles [12, 17, 31]. Arte, une drogue naturelle extraite de Artemisia annua , a démontré une efficacité significative dans le traitement de divers cancers, tels que le cancer du foie, le cancer du poumon et le cancer du sein [35]. Les NP FA-IHA préparées se composaient de ces quatre matériaux approuvés en clinique et ont montré une grande biocompatibilité et stabilité. En tant que nanocomposite théranostique multifonctionnel, l'ICG a été appliqué en tant qu'agent d'imagerie par fluorescence NIR et agent de photothérapie en raison de ses propriétés PTT-PDT. Arte a été fortement chargé dans les NP et libéré par irradiation NIR pour la chimiothérapie. Guidé par les résultats de l'imagerie NIR, l'effet élevé de la combinaison IGPC ciblée a été démontré à la fois in vitro et in vivo. D'après nos résultats, nous pensons que les NP FA-IHA pourraient être un agent théranostique polyvalent potentiel dans l'administration contrôlée de médicaments et la photochimiothérapie combinatoire ciblant les tumeurs guidée par imagerie.

Méthodes

Matériaux

Le chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC), le N-hydroxysuccinimide (NHS) et l'artésunate (Arte, 99 %) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (États-Unis). Le 4', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ont été achetés auprès d'Aladdin (Shanghai, Chine). NH₂ –PEG₂₀₀₀ –COOH et NH₂ –PEG₂₀₀₀ -FA ont été achetés à Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Chine). Les milieux DMEM et le tampon phosphate salin (PBS) ont été fournis par Gibco BRL (NY, USA). Le dérivé sulfo-NHS de l'ICG (ICG-NHS) a été acheté aux laboratoires Dojindo (Kumamoto, Japon).

Synthèse et caractérisation des NP FA-IHA

L'artésunate a été dissous dans du DMSO puis ajouté dans 15 ml d'eau. 10 mg de poudre de HSA ont été ajoutés à la solution ci-dessus et légèrement agités pendant 3 h à température ambiante. Après agitation, le mélange a été traité par réticulation avec 150 μL de glutaraldéhyde à 0,5 %. Afin d'éliminer les réactifs chimiques redondants, le mélange a été dialysé contre de l'eau distillée (seuil de MW = 8 000-12 000 Da) pendant 1 jour, ce qui a donné un nanocomposites HSA chargé d'Arte (Arte-HSA).

Pour activer les groupes carboxyliques de la HSA, les réactifs chimiques EDC et NHS ont été ajoutés à la solution Arte-HSA. Après cela, le mélange a réagi avec NH₂ –PEG₂₀₀₀ -FA pendant 3 h à 4°С. Ensuite, l'ICG-NHS a été ajouté au mélange sous légère agitation pendant 30 min à température ambiante. Les nanoparticules HSA purifiées et conjuguées à l'ICG (FA-ICG-HSA@Arte, FA-IHA NPs) ont été obtenues par dialyse dans l'eau déminéralisée pendant 24 h. La quantité d'Arte et d'ICG chargés a été détectée par un spectrophotomètre UV-vis. L'efficacité de chargement = W1 / W2 × 100 %, où W1 représente le poids d'Arte ou d'ICG dans les NP FA-IHA, et W2 est le poids d'Arte ou d'ICG ajouté.

La microscopie électronique à transmission (Hitachi, Tokyo, Japon) a été utilisée pour détecter la morphologie des échantillons. Un Zetasizer (Zetasizer 3000; Malvern Instruments, Worcestershire, Royaume-Uni) a été utilisé pour mesurer la taille et le potentiel zêta des échantillons. Un spectrophotomètre UV-vis (UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japon) a été appliqué pour mesurer les spectres d'absorbance. Le laser à onde continue à longueur d'onde unique de 808 nm (Beijing Laserwave Optoelectronics Technology Co. Ltd) a été utilisé pour mener des expériences photothermiques, et la température a été détectée par un thermomètre à thermocouple (Fluke, États-Unis).

Libération d'arte thermique et déclenchée par le pH

Pour déterminer la libération d'Arte déclenchée par la chaleur et le pH, les NP de FA-IHA (50 μg/mL) ont été divisées en trois groupes :(a) pH 6,5, (b) pH 7,4 et (c) pH 6,5 avec irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² , 1 min d'impulsion) à des moments sélectionnés pendant 36 h. La quantité libérée d'Arte a été déterminée en fonction de l'absorption UV-vis d'Arte à 287 nm dans le surnageant.

Détection de la production d'oxygène singulet

1, 3-diphénylisobenzofurane (DPBF) a été utilisé pour détecter l'oxygène singulet. 15 μL de solution d'acétonitrile DPBF ont été ajoutés à une solution immaculée d'ICG ou de FA-IHA NPs (1,0 mL, 10 μg/mL) et soigneusement mélangés, suivis de 5 min d'irradiation (808 nm, 1,0 W/cm ² ). Les spectres d'absorption UV-vis ont été enregistrés à différents moments, et la diminution du taux d'absorption à 410 nm est proportionnelle à la production d'oxygène singulet.

Culture cellulaire et absorption cellulaire

Les cellules HepG2 ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection et en 25 cm ² flacon de culture cellulaire respectivement, avec du milieu de culture DMEM en ajoutant 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS). Les cellules HepG2 ont été conservées à 37 °C dans une chambre à 5 % de CO₂ ambiance.

Pour observer l'absorption cellulaire, les cellules HepG2 ont été cultivées avec des ICG libres, des IHA NPs et des FA-IHA NPs (avec 0,05 mg/mL d'ICG) pendant 6 h. Après cela, du PBS a été utilisé pour laver les cellules traitées trois fois. Les cellules ont ensuite été fixées avec 200 μL de glutaraldéhyde et colorées au DAPI pendant 10 min. Les signaux de fluorescence des nanoparticules dans les cellules ont été détectés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (FV300, Olympus, Japon).

Pour évaluer davantage l'absorption cellulaire, un cytomètre en flux (FCM, BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis) a été appliqué. Comme décrit ci-dessus, les cellules traitées par ICG-, IHA NPs- et FA-IHA NPs libres ont été lavées trois fois avec du PBS et digérées par de la trypsine-EDTA. Les cellules en suspension ont été directement introduites dans le FCM pour analyser le taux d'absorption cellulaire.

Génération de ROS intracellulaires

Les cellules HepG2 ont été cultivées dans des plaques 12 puits avec une densité de 2 × 10 ⁵ cellules par millilitre et incubées pendant 24 h, suivies de l'ajout de 1 mL de divers échantillons comprenant (1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA-NPs, (4) ICG libre, (5) IHA- NPs, et (6) solution de NPs FA-IHA. Après une nouvelle incubation pendant 12 h, les cellules ont été irradiées pendant 5 min (808 nm, 1,0 W/cm ² ), suivi d'un traitement au DCFH-DA (5 μg/mL) pendant 30 min supplémentaires. Enfin, les cellules ont été soigneusement lavées avec du PBS et la production de ROS intracellulaires a été détectée quantitativement à l'aide d'un cytomètre et qualitativement avec une microscopie à fluorescence inversée Leica.

Thérapie combinatoire de photochimiothérapie tumorale in vitro

Les cellules HepG2 ont été ensemencées dans des plaques 96 puits (2 × 10 ⁴ cellules par puits) pour une incubation de 24 heures. Des ICG libres, Arte, IHA NPs et FA-IHA NPs (avec 0, 5, 10, 20 et 30 μg/mL d'Arte) ont été ajoutés dans les cellules. Après une incubation de 6 h, les anciens milieux ont été jetés. Les cellules traitées ont été irradiées avec ou sans laser 808 nm (1,0 W/cm ² , 5 min) et mis en culture pendant les 24 h suivantes. La viabilité cellulaire a été mesurée par un dosage CCK-8 classique selon le protocole.

Afin de confirmer davantage les cellules vivantes et mortes après traitement NIR, les cellules traitées ont été co-colorées par calcéine-AM/PI. Les cellules HepG2 ont été pré-ensemencées dans des plaques de 35 mm à une densité de 1 × 10 ⁶ cellules par plaque et ont été traités avec PBS, PBS + NIR, FA-IHA NPs, ou FA-IHA NPs + NIR. Après 6 h d'incubation, les cellules ont été irradiées pendant 5 min par un laser à 808 nm (1 W/cm ² ) et cultivées pendant les 24 h suivantes. Les cellules ont été colorées avec de la calcéine-AM/PI pendant 30 min, lavées avec du PBS pour éliminer l'excès de solution de colorant, puis imagées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (calcéine-AM lex = 488 nm, lem = 515 nm ; PI lex = 535 nm , lem = 617 nm).

Modèle animal et imagerie par fluorescence in vivo

Des souris nudes Balb/c ont été obtenues auprès du Centre des sciences animales de laboratoire de la province du Guangdong et utilisées selon des protocoles approuvés par l'Université médicale de Guangzhou. Afin d'établir des tumeurs sous-cutanées HepG2, 1 × 10 ⁶ Des cellules HepG2 (dans 100 μL de PBS) ont été injectées dans le dos d'une souris nude Balb/c.

Souris porteuses de tumeurs (n = 5) ont été imagés par un système IVIS Spectrum disponible dans le commerce (Caliper LifeSciences, USA) avant et à 10 min, 6 h, 12 h, 24 h et 48 h après l'injection intraveineuse d'ICG libre, de NP d'IHA et de FA- IP de l'IHA.

Thérapie combinée de photochimiothérapie tumorale in Vivo

Les souris porteuses de tumeurs ont été réparties au hasard en différents groupes (n = 5) et ont été traités par PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA NPs + NIR et FA-IHA NPs + NIR (avec une dose d'Arte libre égale), respectivement. Laser NIR de cinq minutes (808 nm, 1 W/cm ² ) a été utilisé pour irradier la région tumorale à 24 h (jour 0) et 48 h (jour 1) après l'injection intraveineuse de ces échantillons. Les images thermiques et la température des souris irradiées ont été enregistrées. Pendant le traitement, la taille de la tumeur a été enregistrée tous les 4 jours et calculée selon l'équation :volume = (longueur de la tumeur) × (largeur de la tumeur) ² / 2. Les résultats ont été montrés par le volume tumoral relatif qui était le volume tumoral divisé par le volume tumoral initial. Après le traitement, les principaux organes, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins de ces souris des groupes PBS et FA-IHA NPs + NIR ont été récoltés, fixés dans du formol à 4 %, inclus dans de la paraffine, colorés avec H&E et enregistrés par un microscope numérique.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des NP FA-IHA

La figure 1 illustre l'utilisation schématique des NP FA-IHA et leur application pour la photochimiothérapie combinatoire ciblant les tumeurs guidée par imagerie. Les agents théranostiques multifonctionnels FA-IHA NPs ont été préparés par une méthode d'auto-assemblage simple et biocompatible. L'ICG conjugué a été utilisé comme agent d'imagerie par fluorescence NIR et agent de photothérapie pour ses propriétés PTT-PDT. De plus, l'Arte chargé a exercé l'effet chimiothérapeutique.

Représentation schématique de l'utilisation des NP FA-IHA pour la photochimiothérapie combinatoire ciblant les tumeurs guidée par imagerie in vitro et in vivo

L'image MET des NP FA-IHA montre une structure sphérique monodispersée d'un diamètre d'environ 131,2 nm (Fig. 2a). Ce diamètre hydrodynamique a été confirmé comme ayant une longueur de 131 ± 2,3 nm dans l'eau, le tampon phosphate salin (PBS) et le milieu cellulaire (Fig. 2b), selon l'analyse DLS. Le potentiel zêta de 131,2 ± 2,12 a également été détecté comme - 29,2 ± 1,13 mV dans ces trois milieux (Fig. 2c). De plus, le diamètre des NPs FA-IHA n'a eu aucun changement significatif sur 7 jours dans ces trois milieux (Fig. 2d). Ces résultats ont indiqué que les NP FA-IHA préparées avaient une bonne stabilité, probablement en raison du revêtement PEG et HSA. Le spectre UV-vis-NIR des NP FA-IHA a affiché le pic d'absorption d'Arte et d'ICG (Fig. 2e), démontrant l'existence d'Arte et d'ICG dans les NP FA-IHA. Le taux de charge d'Arte était de 98,6 ± 3,1%, et le taux de charge ICG était de 56,9 ± 2,4%. La figure 2f montre que les NP FA-IHA avaient une propriété de fluorescence similaire à celle de l'ICG libre.

un Image MET des NPs FA-IHA. b , c Distribution de la taille et du potentiel zêta des NP FA-IHA dans l'eau, le milieu cellulaire et le PBS. d Changement de taille des NPs FA-IHA dans l'eau, le milieu cellulaire et le PBS. e Spectres d'absorbance des NP libres d'ICG, d'Arte et de FA-IHA. f Spectres de fluorescence des ICG libres et des NP FA-IHA

Encouragée par la forte absorption optique NIR des NP FA-IHA, la propriété photothermique des NP FA-IHA a été évaluée. L'eau, l'ICG libre et les NP FA-IHA (avec une concentration d'ICG égale) ont été irradiés avec un laser de 808 nm (1 W/cm ² ). La température des NP de FA-IHA et de l'ICG libre a augmenté d'environ 36 °C dans les 5 min d'irradiation (Fig. 3a), tandis que l'eau a donné un incrément de température inférieur à 4 °C, démontrant que les nanoparticules contenues dans l'ICG ont un effet photothermique important. effet et ont le potentiel pour le traitement du cancer. De plus, fichier supplémentaire 1 :la figure S1 montre les courbes de chauffage photothermique des NP FA-IHA sous 5 min d'irradiation laser à 808 nm avec 0,5, 1 et 1,5 W/cm ² , indiquant que l'intensité laser optimale est de 1 W/cm ² . Les tests de photostabilité sur les NPs FA-IHA et les ICG libres ont été réalisés. L'ICG libre a montré une diminution significative de la température après cinq cycles par rapport aux NP FA-IHA (Fig. 3b). La figure 3c montre le changement d'intensité d'absorption des NPs ICG et FA-IHA libres avant et après cinq cycles d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ). Les résultats suggèrent que l'intensité d'absorbance à 808 nm d'ICG libre diminue après cinq cycles d'irradiation NIR, tandis que les NP FA-IHA maintiennent l'intensité d'absorbance vierge. De plus, nous avons comparé la stabilité de fluorescence des ICG libres et des NP FA-IHA (Fig. 3d). Après 30 jours de stockage à 4 °C, l'intensité de fluorescence des NPs FA-IHA à 800 nm était de 0,72 par rapport à son intensité initiale de 1, tandis que la fluorescence de l'ICG libre a chuté à 0,12 par rapport à son intensité initiale, en raison de l'agrégation induite. -photoblanchiment [36]. Ces résultats ont indiqué que l'ICG conjugué de manière covalente était plus stable que l'ICG libre, probablement en raison de l'auto-assemblage de la HSA et du PEG protégeant l'ICG de l'agrégation induite par l'environnement interne, telle que la chaleur ou la lumière. Ainsi, ces résultats suggèrent que les NP FA-IHA ont un excellent effet photothermique et une excellente stabilité photothermique.

un Courbes de chauffage photothermique de l'eau, de l'ICG et des NP FA-IHA sous 5 min 808 nm d'irradiation laser (1 W/cm ² ). b Variations de température des NPs ICG et FA-IHA après 5 min d'irradiation continue avec un laser à 808 nm pendant 5 cycles. c Le changement d'absorption des NPs FA-IHA à 780 nm avant et après irradiation avec un laser NIR 808 nm pendant 5 cycles. d Variation de fluorescence des NPs ICG et FA-IHA sur 30 jours

Ensuite, une sonde spécifique aux ROS 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF) a été utilisée pour détecter la production de ROS par les NP FA-IHA après irradiation NIR. Comme le montre la figure 4a, les NP FA-IHA ont produit une quantité significative de ROS (0,58 dans l'absorbance standard) dans les 5 minutes d'irradiation NIR par rapport à l'ICG libre (0,35), ce qui pourrait être attribué à la thérapie combinée des NP FA-IHA.

un Absorbance DPBF normalisée en présence d'ICG, de NP FA-IHA et d'un échantillon à blanc sous irradiation laser à 808 nm (1 W/cm ² ). b Cinétique de libération d'Arte des NPs FA-IHA sous pH = 7,4 et pH = 6,5 avec ou sans irradiation laser NIR, respectivement

Sous irradiation laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² ) et des conditions de pH, les performances de libération ont été étudiées (Fig. 4b). En revanche, sans irradiation NIR, les NPs FA-IHA ont montré une libération d'Arte de 11,61 % et 34,2 % à pH 7,4 et pH 6,5, respectivement, tandis que sous irradiation NIR à six reprises, les NPs FA-IHA ont montré une libération totale d'Arte de 68,4 % à pH 6,5, ce qui suggère que l'irradiation NIR et les conditions acides pourraient tous deux déclencher de manière significative la libération d'Arte à partir des NP FA-IHA. L'irradiation NIR et la libération de médicament sensible à l'acide étaient probablement dues à l'expansion induite par la chaleur des nanoparticules de HSA, et en plus, dans un environnement acide, le H ⁺ pourrait modifier la charge de surface de la HSA qui modifie l'équilibre hydrophile/hydrophobe des nanoparticules [37, 38].

Captation cellulaire et détection des ROS intracellulaires

Grâce aux propriétés de fluorescence de l'ICG, l'absorption des NPs FA-IHA a été directement observée dans les cellules HepG2 à l'aide d'un microscope à fluorescence. Comme le montre la figure 5a, après traitement des cellules avec les NP FA-IHA, le cytoplasme a montré une fluorescence ICG rouge plus forte que celle observée dans les cellules traitées avec les NP ICG et IHA libres. De plus, le taux d'absorption cellulaire des FA-IHA NPs a été quantifié par le FCM à 52,3 %, ce qui était supérieur à celui des IHA NPs (25,2 %) et de l'ICG libre (3,9 %) (Fig. 5b). Les résultats ont démontré que l'AF conjugué permettait aux nanoparticules de cibler les récepteurs d'AF sur les cellules tumorales et ainsi d'améliorer l'absorption des cellules FA-IHA NPs [39, 40, 41].

un Images fluorescentes confocales de cellules HepG2 après incubation avec des NP ICG et IHA libres et des NP FA-IHA. Les couleurs rouge et bleue représentent respectivement la fluorescence ICG et les noyaux cellulaires colorés au DAPI. b Mesure par cytométrie de flux des intensités de fluorescence ICG dans les cellules HepG2 après incubation avec des NP ICG et IHA libres et des NP FA-IHA

En utilisant un microscope à fluorescence, nous avons observé l'activité photodynamique intrinsèque des cellules traitées par Arte, ICG et FA-IHA avec ou sans irradiation NIR. Une sonde ROS 2, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate a été utilisée pour visualiser la production cellulaire de ROS. Les résultats ont montré que les NP FA-IHA pouvaient induire une production de ROS significativement améliorée par rapport à d'autres échantillons après 5 min d'irradiation NIR (Fig. 6a). Les valeurs de fluorescence correspondantes sont indiquées sur la figure 6b.

un Images de fluorescence de la production de ROS dans des cellules cancéreuses traitées avec divers médicaments, et b intensité de fluorescence correspondante :(1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA NPs, (4) ICG + NIR libres, (5) IHA NPs + NIR, et (6) FA-IHA NPs + NIR

Thérapie combinatoire de photochimiothérapie tumorale in vitro

La figure 7a montre le changement de température des cellules traitées avec du PBS, des ICG libres, des IHA NPs et des FA-IHA NPs (avec une concentration d'ICG égale) après 5 min d'irradiation NIR (1,0 W/cm ² ). La température des cellules traitées avec les NPs FA-IHA a montré la plus forte augmentation (ΔT = 31 °C) par rapport à celui des cellules traitées avec du PBS, de l'ICG libre et des IHA NPs. La viabilité des cellules traitées avec Arte, IHA NPs et FA-IHA NPs à différentes concentrations pendant 24 h sans irradiation NIR diminuait avec l'augmentation de la concentration, tandis que l'ICG libre à ces concentrations n'a montré aucune cytotoxicité (Fig. 7b). Pendant ce temps, les NP du transporteur de médicament FA-IH (NPs FA-IHA sans Arte) n'ont également montré aucune cytotoxicité significative (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). En revanche, après irradiation NIR (1,0 W/cm ² , 5 min), une mort cellulaire significative dépendante de la concentration a été observée dans les cellules traitées avec de l'ICG libre, des IHA NP et des FA-IHA NP (Fig. 7c). L'effet était particulièrement significatif dans les cellules traitées par FA-IHA NPs. L'excellent effet anticancéreux pourrait être attribué à la photochimiothérapie combinatoire ciblée, telle que l'effet chimiothérapeutique de l'Arte libéré et l'effet thérapeutique PTT-PDT de l'ICG. De plus, la cytotoxicité des NPs FA-IHA avec ou sans irradiation NIR a été étudiée par double coloration calcéine-AM/PI. Les cellules traitées avec les NP FA-IHA et l'irradiation étaient presque complètement mortes par rapport aux autres groupes traités (Fig. 7d).

un Courbes de changement de température des cellules traitées avec du PBS, des ICG libres, des IHA NPs et des FA-IHA NPs dans des plaques à 96 puits après 5 min d'irradiation NIR. b, c Viabilité cellulaire des cellules traitées avec ICG libre, Arte, IHA NPs et FA-IHA NPs sans ou avec irradiation laser 808 nm (5 min, 1 W/cm ² ), respectivement. d Images à double coloration AM/PI du calcium des cellules après traitement avec du PBS (contrôle), du PBS + NIR, des NP FA-IHA et des NPs FA-IHA + NIR, respectivement

Imagerie par fluorescence in vivo

Comme le montrent les figures 8a et b 0,1 h après l'injection d'ICG libre, de NP IHA et de NP FA-IHA, un fort signal de fluorescence a pu être observé dans tout le corps des souris porteuses de tumeurs. Les signaux de fluorescence ont augmenté dans la région tumorale avec le temps, atteignant le pic 24 h après l'injection. Les signaux de fluorescence tumorale dans le groupe NPs FA-IHA étaient les plus élevés par rapport à ceux des groupes NPs ICG et IHA à tous les points testés (Fig. 8b), indiquant que les NPs FA-IHA pourraient fortement s'accumuler dans la région tumorale en raison de la FA. -effet ciblé sur la tumeur. De plus, la biodistribution dans les principaux tissus, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, a été réalisée par une analyse quantitative de fluorescence ex vivo 24 h après l'injection. Dans tous les groupes testés, de forts signaux de fluorescence ont été détectés dans le tissu hépatique (Fig. 8c), indiquant que la principale conversion métabolique de ces composés suit une voie hépatique. Ces résultats ont démontré que les NP de FA-IHA pouvaient s'accumuler sélectivement dans les tumeurs in vivo, probablement induites par l'effet ciblé sur FA [37].

un Images de fluorescence représentatives de souris porteuses de tumeurs après injection dans la veine caudale avec des ICG libres, des IHA NP et des FA-RIPNP. Les cercles en pointillés noirs indiquent la région tumorale. b Analyse quantitative in vivo du signal de fluorescence dans les régions tumorales de souris traitées par ICG libre, IHA NPs et FA-IHA NPs en fonction du temps d'injection. c Le signal de fluorescence des principaux organes, notamment le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins

Thérapie combinée de photochimiothérapie tumorale in Vivo

Comme le montrent les Fig. 9a et b, la température de la tumeur chez les souris porteuses de tumeurs après traitement avec du PBS, de l'ICG libre, des NPs IHA et des NPs FA-IHA à 24 h après l'injection sous 5 min d'irradiation NIR (1 W/ cm ² ) a été enregistrée par une caméra thermique. Une augmentation d'environ 22,1 °C de la région tumorale a été détectée dans le groupe traité par FA-IHA NPs, qui était la plus élevée que celle des autres groupes. Après deux cycles d'irradiation NIR (jour 0 et jour 2), le groupe FA-IHA NPs + NIR présentait une suppression significative de la croissance tumorale sans rechute (Fig. 9c), tandis que les groupes traités avec PBS, Arte, FA-IHA NPs, PBS + NIR, ICG + NIR et IHA NPs + NIR n'ont montré aucune indication claire de suppression tumorale. De plus, après 90 jours, les souris du groupe FA-IHA NPs + NIR ont montré un taux de survie de 100 % (Fig. 9d). Ces résultats indiquent que les NP FA-IHA avec irradiation NIR avaient une excellente efficacité thérapeutique tumorale in vivo, probablement en raison de la photochimiothérapie active ciblée et combinée.

un Températures de la région tumorale chez les souris porteuses de tumeurs après injection dans la veine caudale de PBS, ICG, IHA NPs et FA-RIPNPs à 24 h sous 5 min d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ). b Images thermiques de souris porteuses de tumeurs après injection dans la veine caudale de PBS, ICG, IHA NPs et FA-RIPNPs à 24 h sous 5 min d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ). c Profil de croissance des tumeurs de la xénogreffe HepG2 après injection intraveineuse de PBS, Arte, ICG, IHA NPs et FA-RIPNPs avec ou sans 5 min d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ). d Taux de survie des souris porteuses de tumeurs après injection dans la veine caudale avec du PBS, Arte libre, ICG, IHA NPs et FA-RIPNPs avec ou sans 5 min d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² )

Enfin, la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) a été utilisée pour évaluer la toxicité des NPs FA-IHA. Les images de coupe n'ont montré aucune lésion histologique significative par rapport au groupe traité par PBS (Fig. 10), indiquant que les NP de FA-IHA avaient une toxicité négligeable, probablement due à la sécurité des ingrédients des NP de FA-IHA, étant ainsi bénéfique pour leur utilisation future dans la pratique clinique.

Coupes de tissus colorées par H&E des principaux organes, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins de souris traitées avec du PBS et des NP FA-IHA

Conclusions

En conclusion, un agent théranostique multifonctionnel a été préparé, conjuguant de manière covalente FA et ICG, et encapsulant Arte pour une photochimiothérapie combinatoire ciblant les tumeurs in vitro et in vivo. Les NP FA-IHA préparées ont montré d'excellentes stabilités colloïdales et thermiques et une propriété de fluorescence. Sous irradiation NIR, les NP FA-IHA ont montré un grand effet photothermique qui pourrait déclencher la libération d'Arte et produire beaucoup plus de ROS après irradiation NIR que l'ICG libre qui présentait des performances photodynamiques. L'AF conjugué a facilité une absorption cellulaire très efficace et une accumulation tumorale in vitro et in vivo. De plus, l'efficacité anticancéreuse hautement efficace des NPs FA-IHA combinait une chimiothérapie thermique à ciblage actif, telle que la thérapie PTT-PDT, qui a été démontrée in vitro et in vivo. Dans l'ensemble, les résultats obtenus ont indiqué que les NP FA-IHA pourraient être un système prometteur ciblant les tumeurs, réalisable pour de futures applications en nanomédecine.

Abréviations

Arte :

Artésunate

FA :

Acide folique

HSA :

Sérum albumine humaine

ICG :

Vert d'indocyanine

NIR :

Proche infrarouge

PDT :

Thérapie photodynamique

PEG :

Polyéthylène glycol

PTT :

Thérapie photothermique