Évaluation de nouvelles nanosondes théranostiques à base de gadolinium marquées au 64Cu chez des souris nues porteuses de tumeurs HepG2

Contexte

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l'une des tumeurs malignes les plus courantes dans le monde. Il y avait 782 500 nouveaux cas de cancer du foie diagnostiqués et 745 500 décès par cancer du foie en 2012, dont 70 à 90 % étaient des CHC [1]. La plupart des patients atteints de CHC sont classés à un stade avancé ou à un stade terminal lorsqu'ils sont diagnostiqués pour la première fois, de sorte que seulement 20 à 25 % des patients sont aptes à un traitement curatif [2, 3]. Par conséquent, le traitement du cancer du foie nécessite un traitement multidisciplinaire complet qui inclut la radiothérapie comme une technique cliniquement viable majeure [4].

L'une des principales limites de la radiothérapie pour les patients atteints de CHC est la toxicité liée aux rayonnements pour le tissu hépatique normal environnant. Avec l'augmentation de la posologie, l'incidence des complications de la radiothérapie, y compris la maladie hépatique induite par les rayonnements (RILD), est une menace sérieuse pour la vie des patients [5]. L'une des stratégies pour éviter ce problème consiste à utiliser des radiosensibilisateurs qui peuvent s'accumuler dans le tissu tumoral pour augmenter la sensibilité des cellules tumorales aux rayonnements afin que les cellules tumorales soient plus susceptibles d'être tuées par des doses de rayonnement plus faibles [6].

En 2013, Mignot et al. construit un nouveau type de nanoparticule multifonctionnelle de gadolinium, AGuIX, de petit diamètre (environ 5 nm), qui serait rapidement excrétée par les reins [7], et qui peut être conjuguée à des marqueurs radioactifs ou fluorescents pour la SPECT, la TEP, l'IRM, ou imagerie par fluorescence. Parce que ces nanoparticules sont porteuses d'un nombre élevé de gadolinium (numéro atomique 64), elles peuvent être utilisées comme sensibilisateurs en radiothérapie tumorale [8]. Un certain nombre d'études ont montré que les nanoparticules AGuIX augmentaient la sensibilité des cellules tumorales à la radiothérapie dans diverses cellules tumorales (y compris les lignées cellulaires résistantes aux radiations) in vitro. Des ratios de rehaussement sensibilisant (SER) ont été observés entre 1,1 et 2,5 [8]. Compte tenu du fond hépatique beaucoup plus faible d'AGuIX par rapport à l'absorption tumorale élevée d'AGuIX dans la plupart des modèles de tumeur en raison de l'effet de perméabilité et de rétention améliorés (EPR), ce type de nanoparticule a un grand potentiel pour être développé en un sensibilisateur de radiothérapie idéal pour le CHC [9].

Ces nanoparticules AGuIX ont été principalement développées pour la radiothérapie guidée par IRM (RT); cependant, la pharmacocinétique d'AGuIX n'a ​​pas été entièrement comprise. Pour déterminer quantitativement l'effet dose pour la radiothérapie, il est essentiel de définir la biodistribution et la pharmacocinétique de ces nanoparticules. ⁶⁴ Cu, l'un des radio-isotopes les plus couramment utilisés en tomographie par émission de positons (TEP), a des caractéristiques de désintégration (T _1/2 = 12,4 h) qui lui offrent la flexibilité nécessaire pour imager de petites molécules et de grandes protéines et nanoparticules à clairance lente. Dans cette étude, nous avons radiomarqué AGuIX avec ⁶⁴ Cu pour l'évaluation initiale de sa biodistribution in vivo chez des souris nudes porteuses de tumeurs HepG2 afin de mesurer plus précisément l'ampleur et la durée de sa rétention dans le microenvironnement tumoral. Pour poursuivre les études de preuve de concept avec AGuIX en tant que sensibilisateur aux rayonnements chez des souris nudes porteuses de tumeurs HepG2, nous avons utilisé ¹⁸ F-FDG PET/CT, une technologie d'imagerie cliniquement prouvée pour le métabolisme tumoral pour surveiller la réponse thérapeutique et évaluer le métabolisme du glucose de la tumeur HepG2 avant et après radiothérapie avec ou sans AGuIX.

Méthodes

Informations générales

Des nanoparticules de gadolinium déshydratées, sphériques et inférieures à 5 nm (AGuIX) ont été obtenues à partir de Nano-H (Lyon, France) et utilisées sans purification. Les nanoparticules sont constituées d'atomes de gadolinium attachés à une enveloppe de polysiloxane via des chélateurs DOTA intégrés. Les nanoparticules ont été réhydratées dans de l'eau stérile traitée au DEPC (Invitrogen, États-Unis) et conservées à 4 °C jusqu'à utilisation conformément aux instructions du fabricant. L'acétate de mégestrol a été acheté auprès de Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA). La lignée cellulaire HCC humaine, HepG2, a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, University of Virginia, VA, USA). ⁶⁴ L'isotope Cu a été acheté à l'Université du Wisconsin. D'autres produits chimiques et réactifs ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA) et utilisés sans autre purification ou traitement. Des souris nude athymiques mâles BALB/c âgées de six semaines pesant entre 16 et 18 g ont été achetées auprès de Charles River. L'étude sur les animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Virginie.

Microscopie électronique à transmission (MET)

Des nanoparticules AGuIX à une concentration de 0,5 mM dans les solutions ci-dessus ont été incubées avec des cellules HepG2 pendant 1 h [10]. Ensuite, les nanoparticules résiduelles ont été lavées avec 0,1 M de tampon phosphate salin et purifiées par centrifugation. Des culots cellulaires contenant des nanoparticules ont été colorés avec 4 % de formaldéhyde et 1 % de glutaraldéhyde dans 0,1 M de plomb pour l'imagerie.

⁶⁴ Radiomarquage Cu

Les nanoparticules AGuIX ont été radiomarquées avec le ⁶⁴ isotope Cu. Nous avons d'abord mélangé 200 μl de solution de nanoparticules AGuIX (10 μmole d'AGuIX) avec 100 μl de 0,5 M de NH₄ Tampon OAc (pH = 5,5). Après incubation pendant 5 min, 1 à 3 mCi de ⁶⁴ CuCl₂ dans 0,1 N de HCl ont été ajoutés et le mélange réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 1 h. Le mélange réactionnel a ensuite été stérilisé par filtration à travers un filtre ultracentrifuge Amicon 3k (Merck Millipore). La pureté radiochimique a été déterminée par iTLC en utilisant 20 mM d'acide citrique comme phase mobile, comme décrit précédemment [11].

Modèles de tumeurs

Les cellules HepG2 ont été cultivées dans du MEM contenant 1 mM de pyruvate de sodium, 1 mM d'acides aminés non essentiels et 10 % de FCS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA). Les cellules ont été maintenues dans une atmosphère humidifiée d'air/CO₂ (19/1), et ils ont été repiqués tous les 2-3 jours.

Cellules HepG2 (5 × 10 ⁶ ) ont été recueillies dans 0,1 ml de HBSS, et ces suspensions cellulaires ont ensuite été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de chaque souris nude à l'aide d'une aiguille de calibre 27. Les oreilles des souris nude qui ont reçu des injections cellulaires ont été marquées pour identification. Généralement, les tumeurs solides ont commencé à devenir visibles 2 semaines après l'injection de cellules HepG2.

Biodistribution chez les souris porteuses de tumeurs de ⁶⁴ Cu-AGuIX

Des souris nudes porteuses de tumeurs (5 souris mâles et 4 souris femelles) ont été réparties au hasard en trois groupes et injectées par voie intrapéritonéale avec le ⁶⁴ Cu-AGuIX, avec une activité d'environ 0,9 MBq, dans un volume de 0,2 mL. Les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale sous anesthésie avec inhalation d'isofluorane à 9, 21 et 40 h après l'injection. Les organes d'intérêt (le cœur, les muscles, les poumons, les reins, la rate, le foie et la tumeur, etc.) ont été disséqués et pesés, et 100 μL de sang ont été prélevés dans la cavité ventriculaire. L'activité pour chaque échantillon a été déterminée en utilisant un compteur (CRC-7, Capintec Inc., NJ, USA). La distribution de la radioactivité dans différents tissus et organes a été calculée et exprimée en pourcentage de dose d'injection par gramme (% ID/g).

Imagerie Micro-PET de ⁶⁴ Cu-AGuIX chez des souris nues

Les ⁶⁴ Du Cu-AGuIX (22,2 MBq) dans 0,2 mL de solution saline a été injecté par voie intrapéritonéale à chaque souris nude porteuse de tumeur. Chaque animal a été placé à plat ventre sur le lit d'un système TEP (SuperArgus, Sedecal, Espagne). Les images TEP ont été acquises pour différentes périodes de temps à 9 et 21 h après l'injection de ⁶⁴ Cu-AGuIX sous anesthésie de 4 à 5 % d'isoflurane pour l'induction et de 1 à 2 % pour l'entretien, tous deux équilibrés par de l'oxygène.

Configuration de l'irradiation et ¹⁸ Évaluation TEP F-FDG des xénogreffes

Pour les études d'imagerie TEP visant à évaluer la radiosensibilisation d'AGuIX pendant la radiothérapie, 12 souris nude portant des tumeurs HepG2 ont été divisées en trois groupes, avec quatre souris assignées au hasard par groupe. Pour l'imagerie TEP de base, les souris ont reçu une injection de ¹⁸ F-FDG (16,4 ± 4,7 MBq) à travers la veine caudale et maintenu sous anesthésie générale pendant 10 min d'imagerie statique TEP à 30 min p.i. (post-injection) avec un scanner PET pour petits animaux (Madiclab, Shandong, CN). Les images TEP ont été reconstruites à l'aide de l'algorithme OSEM 3D, une taille de voxel de 0,91   × 0,90  ×   0,90 mm et une résolution spatiale au centre du champ de vision de 1,3 mm.

Pour l'étude d'irradiation, chaque groupe a reçu des injections par la veine caudale avec 0,1 mL de solution saline normale, 1 mg (0,1 mL) d'AGuIX et 10 mg (0,1 mL) d'AGuIX. À 1 h après l'injection, ces souris nude ont été irradiées à l'aide d'une source de rayons X (X-RAD 320, Precision X-Ray, North Branford, CT, USA), qui a fonctionné à 250 kV et 8 mA, avec un 2- Filtre mm Al à un débit de dose de 1,2 Gy/min pour une dose totale de 6 Gy. Le lendemain, le même protocole d'irradiation a été répété avec les souris. À 1 jour après deux traitements d'irradiation, ces souris ont été imagées avec ¹⁸ F-FDG (11,1 ± 1,0 MBq) en utilisant le même protocole que le premier PET scan. La valeur d'absorption standard max (SUVmax) a été déterminée en dessinant des régions d'intérêt (ROI) dans les zones tumorales (Madiclab, Shandong, CN).

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple et les résultats ont été exprimés en moyenne   ± erreur standard (SE). Les différences statistiquement significatives ont été calculées à l'aide d'un t bilatéral non apparié test ou analyse unidirectionnelle de la variance ; p les valeurs de < 0,05(*) et < 0,01(**) ont été considérées comme significatives.

Résultats et discussion

Alors que l'IRM à contraste amélioré a été largement utilisée dans la radiothérapie guidée par l'image basée sur AGuIX, la limite de détection de la concentration des nanoparticules est une préoccupation en raison de la mesure plus longue de la pharmacocinétique des nanoparticules. Avec une capacité quantitative beaucoup plus sensible et plus élevée, la TEP étend la plage dynamique des concentrations à des concentrations nanomolaires beaucoup plus faibles qui sont indétectables par l'IRM à contraste amélioré. Dans ce rapport, nous avons décrit l'étiquetage et l'évaluation de la biodistribution et de la pharmacocinétique d'AGuIX avec ⁶⁴ Cu pour une potentielle radiothérapie guidée par imagerie TEP.

Étude TEM

Pour les études d'incubation cellulaire, une concentration de 0,5 mM de nanoparticules AGuIX a été choisie sur la base des données publiées et les nanoparticules AGuIX ont été incubées avec des cellules HepG2 pendant 1 h [10]. L'absorption dans le cytoplasme des cellules HepG2 a été observée (Fig. 1). Ce résultat est en accord avec des études précédemment publiées dans lesquelles des nanoparticules AGuIX ont été incubées avec d'autres types de lignées cellulaires [12, 13]. Nous avons également observé qu'AGuIX présentait une excellente forme de dispersion dans les cellules HepG2, suggérant qu'AGuIX était stable dans les cellules.

Localisation d'AGuIX au sein des cellules HepG2. un . Les images MET (× 6500) illustrent l'absorption d'AGuIX dans les cellules HepG2. b . L'image MET agrandie (× 52000) montre la distribution des nanoparticules AGuIX dans le cytoplasme

Étiquetage radio

Le marquage a été commodément effectué avec la forme actuelle d'AGuIX avec le chélateur intégré DOTA en une seule étape pour un rendement radiochimique>   98 %. En utilisant le test iTLC pour identifier les nanoparticules radiomarquées qui ont été retenues dans les spots d'origine, le marquage a entraîné une activité spécifique et une pureté radiochimique d'environ 3 à 10 MBq/μmol et 98 %, respectivement. Une moyenne de 50 à 100 MBq du produit final a été obtenue par chaque synthèse.

Études de biodistribution

⁶⁴ Des nanoparticules de Cu-AGuIX ont été injectées par voie intrapéritonéale, la biodistribution a été déterminée chez des souris nudes porteuses de tumeurs HepG2 et elle a été comparée à celles rapportées précédemment. Comme le montre la figure 2, la biodistribution dans chaque organe/tissu est présentée en pourcentage d'activité administrée (dose injectée) par gramme de tissu (% ID/g). Les résultats ont clairement montré que ⁶⁴ Cu-AGuIX s'est accumulé dans la tumeur avec une excellente rétention de 9, 21 et 40 h p.i. avec une absorption de 7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23 et 6,84 ± 1,40 % ID/g, respectivement. Cette rétention à long terme peut être attribuée à l'absorption des nanoparticules AGuIX à l'intérieur des cellules et est donc liée à ⁶⁴ Cu résidence dans les cellules. En accord avec d'autres rapports [11, 14], bien que différentes voies de radiomarquage et d'injection d'isotopes aient été utilisées, le ⁶⁴ Les nanosondes radiomarquées au Cu ont montré une absorption beaucoup plus faible (inférieure à 1% ID/g) dans d'autres organes et tissus normaux et une clairance rapide. Collectivement, ces données suggèrent l'utilisation potentielle de ⁶⁴ AGuIX marqué au Cu comme outil de mesure de la biodistribution et de la pharmacocinétique d'AGuIX pour aider à guider le plan de radiothérapie dans lequel ces nanoparticules sont utilisées comme radiosensibilisateurs. Dans cette étude, l'absorption rénale est beaucoup plus faible que d'autres l'ont signalé, car cette étude a utilisé une injection intrapéritonéale [11, 14].

Biodistribution de ⁶⁴ Cu-AGuIX chez des souris nudes porteuses de tumeurs HepG2. L'absorption de la radioactivité dans chaque tissu/organe a été présentée en %ID/g à 9, 21 et 40 h après l'injection intrapéritonéale de ⁶⁴ Cu-AGuIX (moyenne ± SD, n = 3)

Imagerie Micro-PET chez des souris nues

L'imagerie micro-TEP a montré que l'absorption élevée de ⁶⁴ Cu-AGuIX a été observé dans la tumeur, les reins et le foie chez des souris nudes porteuses de tumeurs (Fig. 3). La tumeur était clairement visible après administration de ⁶⁴ Cu-AGuIX à 9 h et même plus clairement jusqu'à 21 h après l'injection à mesure que le bruit de fond diminue.

Images micro-TEP de souris tumorales. Images TEP (en haut, vue coronale ; en bas, vue transversale) de souris nude avec des tumeurs (flèche rouge ) ont été acquises à 9 h (gauche) et 21 h (droite) après injection intrapéritonéale de ⁶⁴ Cu-AGuIX

¹⁸ Évaluation PET/CT F-FDG de xénogreffes irradiées avec ou sans AGuIX

Pour évaluer les différentes réponses de radiothérapie avec ou sans administration d'AGuIX, ¹⁸ L'imagerie F-FDG PET/CT a été réalisée pour surveiller les changements métaboliques après irradiation avec ou sans injection d'AGuIX à deux dosages différents. La baisse de ¹⁸ L'absorption de F-FDG dans les xénogreffes a été observée chez toutes les souris irradiées (Fig. 3). SUVmax (B/A), le principal indicateur d'efficacité de la radiosensibilisation, était de 1,03 ± 0,03, 1,04 ± 0,04 et 1,24 ± 0,02 pour les souris recevant une solution saline normale, 1 mg d'AGuIX et 10 mg d'AGuIX, respectivement (Fig. 4). Pour le groupe 10 mg d'AGuIX, le T/L (B/A) a été significativement augmenté par rapport au groupe 1 mg d'AGuIX (p < 0.001, test d'échantillon indépendant) et avec le groupe salin normal (p < 0,001, test d'échantillon indépendant). Il n'y avait pas de différence significative pour T/L (B/A) entre les groupes recevant 1 mg d'AGuIX et une solution saline normale (p =  0,83, test d'échantillon indépendant) (Fig. 5). Ces résultats suggèrent que le métabolisme du glucose des xénogreffes a été supprimé principalement chez les souris irradiées qui ont reçu une injection de 10 mg d'AGuIX; bien que la radiothérapie puisse induire une inflammation qui peut également conduire à une absorption de FDG. Dans cette étude, nous choisissons la même dose de rayonnement et le même moment de traitement post-RT pour tous les groupes afin de compenser toute erreur systémique. Par conséquent, l'étendue de l'inflammation causée par la RT devrait être à peu près la même pour les trois groupes et la contribution à l'absorption de FDG induite par l'inflammation devrait également être à peu près du même niveau. D'autres sondes d'imagerie TEP peuvent être utilisées pour éviter ce problème. Néanmoins, ces résultats fournissent une preuve de concept selon laquelle AGuIX peut être utilisé comme sensibilisateur aux radiations tumorales chez les souris porteuses de tumeurs HepG2.

¹⁸ Images PET F-FDG des souris avant et après irradiation. ¹⁸ Les images TEP F-FDG ont été comparées dans chaque panneau avant (à gauche) et 1 jour (à droite) après l'irradiation, et les trois panneaux ont montré les images de souris injectées par injection dans la veine caudale de solution saline normale (panneau de gauche), 1 mg d'AGuIX ( panneau du milieu) et 10 mg d'AGuIX (panneau de droite), respectivement. La même échelle de couleurs a été appliquée à chacune des images

¹⁸ Évaluation quantitative du F-FDG PET avant et après irradiation. T/L (B), le rapport SUVmax (tumeur) sur SUVave (foie) avant irradiation ; T/L (A), le rapport SUVmax (tumeur) sur SUVave (foie) après irradiation ; T/L (B/A), le rapport de T/L (B) à T/L (A) ; AGuIX (1 mg), 1 mg d'AGuIX injecté ; AGuIX (10 mg), 10 mg AGuIX injecté

Enfin, la dose de rayonnement absorbée par la sonde d'imagerie nucléaire elle-même est également une préoccupation critique lorsqu'on envisage une transition vers une utilisation clinique. La forme actuelle des nanoparticules AGuIX a été minutieusement étudiée pour le métabolisme et la toxicité in vivo et approuvée pour des études humaines par la FDA [15]. En étiquetant soit ⁶⁸ Ga (demi-vie de désintégration d'environ 1 h) ou ⁸⁹ Zr (demi-vie de désintégration de 78 h), les résultats de l'étude de biodistribution chez la souris par injection intraveineuse ont montré une absorption extrêmement élevée dans les reins à plus de 20 % ID/g dès 30 min par ⁶⁸ Ga jusqu'à 72 h avant ⁸⁹ Zr [11, 14]. Bien que l'excrétion rapide par les reins soit généralement bénéfique, en raison de la sensibilité des reins aux radiations, on ignore si les reins peuvent tolérer cette absorption élevée et le mécanisme de rétention pendant une si longue période. Dans cette étude, l'absorption rénale était d'environ 5 % ID/g, inférieure à celle du foie et de la tumeur pendant toute la période de l'enquête. On peut supposer que cette différence est due aux différentes voies d'injection. Par injection intrapéritonéale, les nanoparticules AGuIX étaient absorbées en continu par le péritoine, alors qu'en injection intraveineuse, les nanoparticules étaient excrétées rapidement par les reins. Étant donné que la sensibilité aux rayonnements de chaque organe et tissu est différente, la détermination finale des sondes théranostiques radioactives pour la traduction en usage clinique nécessite des études de dosimétrie plus détaillées.

Conclusions

Les nanoparticules AGuIX ont été étiquetées avec succès avec ⁶⁴ Cu avec un rendement élevé. Les études de biodistribution ont indiqué que le radiotraceur ⁶⁴ Cu-AGuIX a affiché une accumulation élevée dans les tumeurs et a été retenu pendant une longue période dans la xénogreffe HepG2 des souris nude, suggérant qu'il s'agit de nanosondes théranostiques potentielles pour la radiothérapie guidée par l'image dans le CHC. La réduction significative de ¹⁸ L'absorption de F-FDG après radiothérapie dans le groupe de souris nudes tumorales injectées avec AGuIX a fourni la preuve que AGuIX peut être utilisé comme sensibilisateur aux radiations tumorales pour améliorer la radiothérapie chez les souris porteuses de tumeurs HepG2. D'autres investigations sur la dosimétrie sont nécessaires pour déterminer la toxicité des rayonnements pour une traduction potentielle dans des applications cliniques.