Nouvelle détection par immunodétection-fluorescence du fragment de cytokératine-19 marqueur tumoral (CYFRA 21-1) via un nanocomposite Carbon Quantum Dots/oxyde de zinc

Introduction

Le cancer du poumon est le type de cancer le plus répandu et le plus agressif avec de grands défis dans le traitement médical. La récidive tumorale et les métastases sont considérées comme les principales causes de décès chez les patients atteints de cancer du poumon [1]. Le fragment cytokératine 19 marqueur tumoral (CYFRA 21-1) est un fragment qui existe dans de nombreuses cellules épithéliales normales et malignes [2]. Elle peut être estimée à l'aide d'un dosage immunoradiométrique sandwich. Les premières études ont clarifié que dans les stades malins du cancer du poumon, le CYFRA 21-1 est libéré dans la circulation sanguine des patients et élevé dans leur sérum [3]. Par conséquent, il est possible d'améliorer la survie des patients atteints de cancer du poumon par une détection précoce et par conséquent une réaction chirurgicale rapide [4].

Peu de techniques ont été précédemment rapportées pour la détection de CYFRA 21-1, y compris le dosage immunoenzymatique [5], le dosage immunologique par électrochimioluminescence [6] et le dosage immunoradiométrique [7]. Une stratégie avantageuse pour augmenter et améliorer la sensibilité de CYFRA 21-1 dans le sérum humain est toujours une préoccupation.

Ces dernières années, des progrès majeurs et une croissance explosive de la nanotechnologie ont été réalisés dans presque tous les domaines de la vie [8]. Parmi ces domaines figurent les systèmes d'administration de médicaments [9], l'analyse pharmaceutique [10], les réactions d'activité catalytique [11], les applications médicinales [12], les marqueurs de tumeurs cancéreuses [13] et l'imagerie tissulaire [14].

De nos jours, les techniques de détection basées sur la fluorescence (FL) ont attiré de nombreux chercheurs en raison de leur conception simple et de leur excellente sensibilité. Divers matériaux sensoriels FL ont été conçus et synthétisés pour la surveillance biologique. Les systèmes FL pour la détermination biologique sont hautement luminescents, dispersibles dans l'eau, chimiquement stables et non toxiques [15]. Il existe diverses sondes d'immunodétection basées sur la fluorescence pour la détection de biomarqueurs. L'essai compétitif hétérogène est réalisé en immobilisant des molécules de capture sur la surface, puis incubé avec des biomarqueurs conjugués à des fluorophores. La compétition entre les biomarqueurs libres et conjugués pour la liaison aux molécules de capture diminue l'intensité de fluorescence avec la concentration de biomarqueurs [16]. Le test sandwich hétérogène est basé sur l'incubation de molécules de capture et de solution d'intérêt formant un complexe avec des biomarqueurs. Par conséquent, l'intensité de la fluorescence augmente avec la concentration du biomarqueur [17].

Dans l'essai compétitif homogène, deux molécules de capture différentes conjuguées au fluorophore A conjuguées à des biomarqueurs conjugués au fluorophore B et la solution augmentant la fluorescence avec les concentrations de biomarqueurs [18]. Cependant, ces techniques présentaient certains inconvénients, notamment leur longue durée d'expérimentation, le manque de détection multiplexée, leur complexité et parfois des résultats relativement faux. Les progrès de la nanotechnologie ont permis aux chercheurs de développer de nouvelles sondes d'immunodétection par fluorescence dotées de caractéristiques optiques uniques [19]. Depuis la première utilisation des points quantiques dans la détection de biomolécules, ils ont suscité un grand intérêt car leurs caractéristiques optiques offrent une grande flexibilité dans la sélection de la longueur d'onde appropriée, d'excellents marqueurs pour la détection multiplexée, la biocompatibilité et la capacité de ciblage [20].

Les points quantiques de carbone (CQD) ont démontré d'excellentes propriétés chimiques, physiques, optiques, magnétiques et électriques. Les CQD peuvent être synthétisés à l'aide de différentes techniques, notamment des méthodes hydrothermales, d'électro-oxydation, d'ablation laser et micro-ondes [21,22,23,24]. En raison de leurs caractéristiques de faible toxicité, les chercheurs scientifiques ont considéré les CQD comme des candidats puissants dans de nombreuses sondes fluorescentes. De plus, ils ont une forte capacité à manipuler à travers différentes réactions chimiques contrôlables dans diverses demandes telles que les systèmes biochimiques, photochimiques, de biodétection, de bioimagerie et d'administration de médicaments [25,26,27], ainsi que dans la détection par immunoessai [28]. Des études antérieures sur la synthèse des CQD ont révélé certains inconvénients en utilisant des sources de carbone coûteuses, des produits chimiques et des réactifs toxiques, ou en utilisant des procédés non sélectifs [29]. Pour limiter ces inconvénients, les chercheurs ont commencé à utiliser des jus de fruits comme source de carbone nouvelle et bon marché [30]. Étant donné que l'utilisation de jus de fruits ne fournit pas l'objectif optimal d'utilisation des ressources, des CQD fluorescents ont récemment été obtenus à partir d'écorces de fruits [31]. L'utilisation d'écorces de fruits offre une voie prometteuse pour la synthèse écologique et verte des CQD.

L'oxyde de zinc (ZnO) est l'un des oxydes métalliques les plus importants, potentiellement actifs, stables et peu toxiques qui sont largement utilisés dans les dispositifs laser ultraviolets, le domaine biomédical, divers types de capteurs et la photocatalyse [32,33,34,35]. Les nanoparticules de ZnO (ZnONP) ont présenté des propriétés photoluminescentes proches des gammes de spectre UV et Vis. Ceci peut être attribué à l'émission excitonique qui est basée sur la recombinaison directe de paires électron-trou [36] ou à l'émission vert-jaune à 520 nm résultant de la transition électronique du bord de la bande de conduction à un niveau piège [37].

Généralement, les points de carbone sont des nanoparticules quasi-sphériques amorphes ou nanocristallines contenant sp ² et sp ³ carbone, groupes à base d'O/N et groupes chimiques post-modifiés. De plus, les CQD ont la capacité d'exciter avec des longueurs d'onde plus élevées et peuvent modifier l'efficacité des surfaces combinées des paires électron-trou et traiter l'extinction dans les systèmes analysés, ce qui peut faciliter la détermination quantitative des biomolécules [38]. Ils ont la capacité d'être décorés par des oxydes métalliques tels que TiO₂ et ZnO pour former un nanocomposite optiquement actif qui peut être exploité dans la détection de biomarqueurs dans le sérum humain. Le ZnO est un matériau à large bande interdite (3,37  eV), qui peut être luminescent dans les régions UV et bleue de la lumière visible en raison de la présence d'une grande densité de niveaux de défauts dans la bande interdite [39]. La formation de nanocomposite CQDs/ZnO augmente l'absorption de la lumière visible en raison de l'hybridation du ZnO avec les CQD, et le décalage vers le bleu de l'absorption de la luminescence à 520 nm peut être attribué à la recombinaison radiative des lacunes d'O ionisé. En plus de l'augmentation de l'absorption de la lumière visible, une meilleure séparation électron-trou et une réduction du temps de transfert d'électrons interfacial peuvent être envisagées pour les performances optiques plus élevées des CQD hybrides avec des nanoparticules de ZnO [40]. De plus, l'augmentation significative des radicaux -OH*, générés à partir des nanocomposites CQD/ZnO dans l'interface eau, peut provoquer une élévation significative des signaux de fluorescence du système d'analyse. Ainsi, le nanocomposite CQDs/ZnO combiné améliore la modification des propriétés optoélectroniques et de photoluminescence de la surface du ZnO et produit un fort défaut de surface avec une photoluminescence accordable [41]. De plus, les CQD immobilisés avec des anticorps de bio-reconnaissance formant un système de détection de FL anticorps-antigène-anticorps fournissent une sonde viable avec une spécificité et une sensibilité élevées à l'analyte cible [42].

L'étude suggérée proposait un nouveau système de détection de fluorescence par immunoessai simple et ultrasensible basé sur des CQD décorés de nanocomposite de ZnO pour déterminer le marqueur tumoral CYFRA 21-1 dans le sérum humain. Le péricarpe citronné a été utilisé comme précurseur de carbone pour dériver les CQD en utilisant des conditions hydrothermales. De plus, il a été utilisé comme agent réducteur et stabilisant pour la synthèse de nanocomposite ZnO conjugué CQDs. Le nanocomposite CQDs/ZnO préparé a été immobilisé par un anticorps monoclonal (mAb) BM 19.21 non conjugué et les puits de microtitrage ont été recouverts d'un autre anticorps monoclonal KS 19.1 pour former un système d'immunodétection à coiffage en sandwich.

Méthodes

Instruments

Les spectres spectrophotométriques des CQD ainsi que des nanocomposites CQD/ZnO ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, Royaume-Uni). La morphologie de la surface et la distribution de la taille des particules des CQDs synthétisés verts et du nanocomposite CQDS/Zn ont été évaluées à l'aide d'un instrument modèle JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Allemagne) et d'un microscope électronique à balayage (SEM) JSM-7610F. (JEOL, États-Unis). Les spectres infrarouges de fluorescence et de transformée de Fourier (FT-IR) du système d'immunodétection suggéré ont été vérifiés à l'aide du lecteur multimode Biotek Synergy H1 (Biotek, Tokyo, Japon) et du spectrophotomètre Perkin Elmer FT-IR (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japon) , respectivement. Les spectres Raman, la spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) et le diagramme de diffraction des rayons X sur poudre (XRD) ont été mesurés à l'aide d'un spectromètre micro-Raman (CRAIC Technologies, CA, USA), du système de spectroscopie à rayons X Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd. , Manchester, Royaume-Uni) et le diffractomètre Siemens D-5000 (Siemens, Erfurt, Allemagne), respectivement.

Produits chimiques et réactifs

L'instrument SG-2000-10090 (Barsbuttel, Allemagne) a été utilisé pour acquérir l'eau déminéralisée utilisée dans toutes les expériences. Les anticorps monoclonaux (mAb) non conjugués CYFRA 21-1 BM 19.21 et KS 19.1 pour former le système d'immunodétection à coiffage sandwich ont été obtenus auprès d'Abcam (Cambridge, Royaume-Uni). Citrus Citron les fruits étaient fournis par les marchés locaux. Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de pH =7,4 a été préparée en utilisant du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, de l'hydroxyde de sodium, du phosphate monopotassique et du phosphate disodique (BHD Ltd. Co. Poole, Royaume-Uni). Randox Laboratories (Irlande du Nord-Royaume-Uni) a aimablement fourni les sérums normaux du commerce. Des échantillons de sang aléatoires ont été prélevés sur des volontaires sains, et avant de commencer cette étude, un consentement éclairé a été obtenu. De plus, Sigma-Aldrich (Hambourg, Allemagne) a fourni une qualité pure de chlorhydrate de carbodiimide (EDC) et de N-hydroxysuccinimide (NHS). Le comité d'éthique de la recherche de l'Université King Saud, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) a approuvé l'étude.

Préparation hydrothermale verte de points quantiques de carbone (CQD)

Citrus Citron le péricarpe a été utilisé pour synthétiser les CQD dans des conditions hydrothermales. Environ 20 g de Citrus Citron le péricarpe et 200 mL d'eau déminéralisée ont été transférés dans un ballon rond et chauffés au reflux à 100 °C sous agitation magnétique continue pendant 6 h. Après refroidissement à température ambiante, l'extrait obtenu a été centrifugé à 3500 rpm et 20 mL de la solution extraite supérieure ont été autoclavés et chauffés dans des conditions hydrothermales dans la plage de température de 100 à 200 °C pour différents intervalles de 6 à 120  h. Après refroidissement à température ambiante, la liqueur supérieure représente les CQD (Schéma 1).

Synthèse verte de CQD à l'aide de Citrus Citron péricarpe à solution CQD fluorescente et sphères de carbone

Préparation du nanocomposite Carbon Quantum Dots-Zinc Oxyde

Pour préparer un nanocomposite CQD/ZnO, une simple réaction de réduction chimique a été réalisée en utilisant des CQD comme agent réducteur et stabilisant. Le nanocomposite CQDs/ZnO a été obtenu en ajoutant 20 mL de CQDs à 50 mL de 5.0 × 10 ⁻² mol L ⁻¹ d'acétate de zinc à 60 °C sous agitation continue pendant 10 min. Lorsque la couleur du mélange est passée du jaunâtre au crémeux, le mélange a été laissé de côté pendant 30 min pour terminer le processus de réduction et stocké à 4 °C. Pour assurer la stabilité et vérifier l'agglomération du nanocomposite CQDs/ZnO préparé, la spectrométrie UV-Vis a été utilisée pour enregistrer l'absorbance dans les 20 jours à 390 nm. Les résultats des résultats ont révélé une stabilité élevée et aucun changement significatif dans l'absorbance des nanocomposites CQD/ZnO.

Caractérisation du nanocomposite Carbon Quantum Dots-Zinc Oxyde

Pour assurer la formation de nanocomposite CQDs/ZnO, différentes techniques microscopiques et spectroscopiques ont été utilisées. L'uniformité et la morphologie de surface des CQD et des nanocomposites CQD/ZnO ont été étudiées au microscope électronique à transmission à haute résolution (HRTEM) et au MEB. Les spectres optiques ont été étudiés en utilisant les spectroscopies UV-Vis, FT-IR, XPS et Raman. La structure cristalline des CQD tels que préparés a été évaluée à l'aide d'un modèle XRD.

Processus d'immobilisation

Un anticorps monoclonal BM 19.21 non conjugué a été immobilisé à la surface du nanocomposite CQDs/ZnO synthétisé par une simple liaison amide peptidique entre l'amine et les groupes carboxyliques actifs. Le processus d'immobilisation a été réalisé en ajoutant 5,0 mL de chaque équimolaire 3.0 × 10 ⁻³ mol L ⁻¹ NHS et EDC à 5.0 mL de solution nanocomposite CQDs/ZnO sous agitation continue pendant 1 h. Environ 5 mg d'anticorps monoclonal BM 19.21 non conjugué ont été dissous dans 1,0 mL de 0,01 mol L ⁻¹ une solution saline tamponnée au phosphate (pH  =7,4) et ajoutée à la solution de détection ci-dessus. L'anticorps monoclonal BM 19.21 non conjugué a été immobilisé à la surface d'une solution nanocomposite CQDs/ZnO après incubation à 37°C pendant 12h (Schéma 2). La spectrophotométrie a été utilisée pour confirmer le succès du processus d'immobilisation.

Immobilisation de l'anticorps monoclonal BM 19.21 à la surface de nanocomposite CQDs/ZnO

Principe général de la méthode de dosage immunologique

Une réaction de coiffage en sandwich anticorps-antigène-anticorps a été obtenue en utilisant un autre anticorps monoclonal KS 19.1 recouvrant la surface des puits de microtitrage (Schéma 3). Dans des conditions optimales de dosage immunologique, la concentration de l'antigène CYFRA 21-1 a été déterminée en fonction d'une augmentation de l'intensité du signal de fluorescence.

Le schéma illustré représente une réaction anticorps-antigène-anticorps d'immunodétection coiffant en sandwich

La procédure d'immunodétection

La collection d'échantillons de sérums humains a été fournie par des volontaires choisis au hasard. La coagulation complète a été assurée avant centrifugation à température ambiante et conservée à 4°C. La technique de dopage a été utilisée pour préparer des échantillons standard contenant l'antigène CYFRA 21-1 dans la plage de concentration de 0,01 à 500 ng mL ⁻¹ . Environ 50 μL des échantillons enrichis ont été distribués dans des puits de microtitrage et mélangés avec 50 μL d'anticorps monoclonal KS 19.1 fraîchement dilué en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate de pH = 7,4 pendant 30 min, puis incubés sans couvrir la plaque pendant 1 h à 37 °C. Le contenu des puits a été secoué vivement et les puits ont été rincés trois fois en utilisant de l'eau déminéralisée (300 μL) pour chaque puits. Environ 50 μL de la solution nanocomposite CQDs/ZnO-BM 19.21 immobilisée ont été ajoutés à chaque puits, mélangés doucement et incubés pendant 30 min à 37 °C. Les échantillons préparés ont été soumis à une analyse de fluorescence à l'aide d'un lecteur de microtitration pour enregistrer les intensités.

Résultats et discussion

Évaluation morphologique des points quantiques de carbone et de son nanocomposite

Un microscope électronique à transmission (MET) a été utilisé pour caractériser la morphologie de surface et la distribution des CQD dans les échantillons. Pour accomplir l'examen sous MET, environ 4 L de la suspension de CQD préparée ont été déposés sur la surface de la grille de carbone de TEM. Dans l'image HRTEM (Fig. 1a), les points noirs uniformes observés avec un espacement de réseau (0,36  nm) indiquaient la formation de CQD. Un graphique de distribution de la taille des particules a été tracé et la taille moyenne des particules variait de 1,5 ± 0,5 à 5,0 ± 0,5 nm (Fig. 1b). La taille des particules obtenue a prouvé que les CQD formés sont bien des nanomatériaux de taille quantique. De plus, une diffusion dynamique de la lumière (DLS) a été réalisée et la taille moyenne des particules s'est avérée être d'environ 20 ± 0,2 nm. Une différence entre les deux mesures précédentes a été observée. Des études antérieures ont révélé que HRTEM ne montre pas la structure en réseau cristallin des CQD formés à des grossissements plus élevés en raison de leur nature amorphe [43]. De même, dans cette étude, le précurseur naturel du carbone est le Citrus citron le péricarpe et les CQD dérivés présentaient également une nature amorphe. Par conséquent, la différence dans les mesures de la taille des particules peut être attribuée à l'agglomération des CQD formés, à la nature amorphe des points de carbone formés, au mécanisme impliqué dans chaque expérience et à la dynamique d'hydratation des particules.

un Image au microscope électronique à transmission à haute résolution (HRTEM) de CQD de diamètre 5 nm et b graphique de distribution de taille des CQD basé sur le TEM

Le nanocomposite CQDs/ZnO préparé a été étudié à l'aide de MET et SEM. Dans l'image MET (Fig. 2a), la présence de particules hexagonales attachées aux CQD indiquait la formation de nanocomposite CQD/ZnO. En SEM, l'échantillon nanocomposite a été recouvert d'or pour empêcher l'absorption d'électrons par l'échantillon et l'accumulation de charge. La tension accélérée appliquée était de 15 kV au grossissement ×   30 000 (Fig. 2b).

un et b représentent les images au microscope électronique à transmission et au microscope électronique à balayage de nanocomposite CQD/ZnO

Les spectres UV-Vis et de fluorescence des CQD ont été étudiés, et les spectres enregistrés ont montré deux pics significatifs à 224 et 280  nm qui peuvent être attribués à p ~p* et n ~P* transition de C=C et C=O, respectivement. De plus, le spectre de fluorescence des CQD affichait deux signaux au maximum λ_ex = 360 et λ_em = 453 nm (Fig. 3a, b). De plus, le spectre UV-Vis du nanocomposite CQDs/ZnO a été étudié. Un pic d'absorption significatif a été observé à 370 nm affichant un décalage bleu-vert (Fig. 4a). Les propriétés de photoluminescence (PL) des nanocomposites CQD/ZnO ont été étudiées. La taille et les défauts de surface des CQD affectent grandement leurs propriétés de luminescence. En fonction de la longueur d'onde d'excitation, l'émission (PL) des CQD variait [38]. De plus, les particules de taille nanométrique de ZnO présentaient une émission liée à un défaut dans la région visible d'absorption du bleu au vert [41]. Par conséquent, les ZnONP décorés par CQD ont produit un excellent nanocomposite pour l'émission de PL. Comme le montre la figure 4b, le spectre PL des CQD/ZnO présentait un décalage vers le bleu avec un pic significatif à 520  nm après la longueur d'onde d'excitation de 470  nm. Le décalage observé peut être attribué au chevauchement entre les bandes d'énergie des CQD et des ZnONP. Le décalage vers le bleu affiché correspond au niveau d'émission de défaut de 2,1  eV.

Spectres spectroscopiques des CQD (a ) Spectre UV-Vis à 224 et 280  nm et (b ) spectre de fluorescence des CQD à λ_ex = 360 et λ_em = 452 nm

Spectres spectroscopiques des CQD/ZnONP a Spectre UV-Vis au pic d'absorption à 370 nm et b spectre de photoluminescence des CQD/ZnONP à λ_ex = 470 et λ_em = 520 nm

Pour confirmer la formation de nanocomposite CQD/ZnO et de nanocomposite CQD/ZnO immobilisé avec un anticorps monoclonal BM 19.21 non conjugué, une étude comparative FT-IR a été réalisée. Le spectre FT-IR enregistré des CQD a révélé la présence de différents pics distincts correspondant à certains groupes fonctionnels, y compris l'étirement des pics vibrationnels à 3462 cm ⁻¹ et 2932 cm ⁻¹ pour les groupes C–OH et C–H, respectivement. De plus, trois bandes d'absorption des vibrations ont été observées à 1749 cm ⁻¹ , 1375 cm ⁻¹ , et 1246 cm ⁻¹ correspondant à la présence de groupes fonctionnels C=O, C–N et C–O–C, respectivement (Fig. 5a). Un nouveau pic à 436 cm ⁻¹ correspondant à une bande de vibration d'étirement de Zn–O a été observée. Les propriétés réductrices et stabilisantes des CQD ont été acquises grâce à la présence de groupes -OH et COOH à leur surface. Ces groupes fonctionnels agissent comme des donneurs d'électrons et ont une forte affinité pour la formation de nanocomposite CQDs/ZnO. Par conséquent, les CQD ont réduit et stabilisé le nanocomposite formé (Fig. 5b). Comme le montre la figure 5c, il a été remarqué que deux nouveaux pics se sont formés à 3254 cm ⁻¹ et 1675 cm ⁻¹ . Ces pics ont été attribués à l'étirement des vibrations de N-H et C=O, respectivement, et à la confirmation de l'immobilisation des CQD/ZnO-BM 19.21 via des liaisons peptidiques.

Spectres FT-IR de a CQD, b Nanocomposite CQD/ZnO, et c nanocomposite CQD/ZnO-BM 19.21 immobilisé

Les spectres de spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) des CQD synthétisés en vert ont été examinés. Le spectre obtenu des CQD (Fig. 6a) a montré différents groupes fonctionnels à 288 et 286  eV pour C=O et COOH, respectivement. De plus, deux pics d'énergie de liaison significatifs ont été observés à 1044,4 et 1021,5  eV pour le Zn 2p_1/2 et Zn 2p_3/2 , respectivement (Fig. 6b). De plus, le spectre XPS haute résolution du nanocomposite CQDs/ZnO a confirmé la présence de différents pics d'énergie de liaison à 560, 385, 350, 246 et 200 eV pour O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p et Zn 3d, respectivement (Fig. 6c). Toutes les données mentionnées précédemment ont prouvé la présence de ZnO à la surface des CQD formant des nanocomposites CQD/ZnO.

Spectres de spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) de a CQD, b ZnO et c Nanocomposite CQD/ZnO

Une étude comparative entre les modèles XRD de CQDs et CQDs/ZnO nanocomposite a été réalisée. Un large pic à 20° (2Ɵ) pour les points de carbone a été remarqué dans le modèle XRD des CQD (Fig. 7a). Cependant, différents pics nets ont été reconnus à 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° et 80° (2Ɵ) pour Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) et (202), respectivement. Les pics observés reflétaient la distribution du ZnO à la surface des CQD formant un nanocomposite CQD/ZnO (Fig. 7b).

Diagramme de diffraction des rayons X de a CQD et b Nanocomposite CQD/ZnO

Les spectres Raman des nanocomposites CQDs, CQDs/ZnO et CQDs/ZnO-BM 19.21 immobilisés ont été étudiés. Les signaux Raman sont couramment utilisés pour étudier la structure cristalline et ses défauts. La figure 8a montre deux bandes D et G typiques à 1 300 et 1 520 cm ⁻¹ pour les nanoparticules de carbone, respectivement. Comme indiqué précédemment, la bande D représente généralement sp ³ défauts, et la bande G est une caractéristique de la vibration plane de sp ² -carbones liés [44]. Le Je _D /Je _G rapport a été calculé pour les CQD préparés, et il s'est avéré être 1,02 ± 0,03. De nouveaux pics aigus ont été observés à 440 et 520 cm ⁻¹ pour les nanoparticules de ZnO et les pics typiques de CQD ont été observés à 1364 et 1595 cm ⁻¹ . Le rapport de I _D /Je _G s'est avéré être 1,2 ± 0,01 indiquant la formation de nanocomposite CQDs/ZnO (Fig. 8b). Le spectre Raman du nanocomposite CQDs/ZnO-BM 19.21 immobilisé a affiché de nombreux pics qui peuvent être facilement reconnus comme des signes de confirmation des structures secondaires et tertiaires. Les pics observés dans la région 1007-1128 cm ⁻¹ ont été assignés pour représenter la structure secondaire majeure de l'anticorps monoclonal. Le Raman culmine à 550-682 cm ⁻¹ région ont été assignées pour représenter les conformations disulfure, tandis que les 867-797 cm ⁻¹ ceux-ci ont été assignés pour représenter l'état de liaison hydrogène des résidus de tyrosine. En outre, le décalage significatif du pic du spectre Raman à 1630 cm ⁻¹ peut être attribuée à la présence d'une structure tertiaire de l'anticorps immobilisé [45] (Fig. 8c). Le rapport de I _D /Je _G a été augmenté à 1,4 ± 0,04, révélant une meilleure structure cristalline en raison de la formation de nanocomposite CQD/ZnO-BM 19.21 immobilisé.

Décalage du spectre Raman de a CQD, b Nanocomposite CQD/ZnO, et c nanocomposite CQD/ZnO-BM 19.21 immobilisé

Optimisation des conditions d'immunodétection par fluorescence

La sélection et l'optimisation des conditions d'immunodétection de fluorescence suggérées ont été menées en étudiant divers paramètres. Généralement, la quantité de nanocomposite immobilisé, le pH et la concentration du tampon utilisé, le temps d'incubation entre l'analyte cible dans les échantillons de sérum et les réactifs d'immunodétection doivent être étudiés et optimisés. Afin de sélectionner la quantité appropriée de nanocomposite CQD/ZnO-BM 19.21 immobilisé, différentes quantités de l'ordre de 10 à 100  μL ont été testées. L'intensité de fluorescence maximale a été observée en ajoutant 50 μL du nanocomposite CQDs/ZnO-BM 19.21 immobilisé (Fig. 9a). Quatre solutions salines tamponnées au phosphate de pH 7,2–7,5 ont été préparées et testées en fonction de l'intensité de fluorescence. Un léger changement dans l'intensité du signal de fluorescence a été observé en changeant les valeurs de pH. À pH 7,2 et 7,3, le signal de fluorescence a diminué en raison de l'instabilité chimique du nanocomposite CQDs/ZnO immobilisé. Le signal de fluorescence a augmenté à pH   7,4 à 7,5 en raison de l'excellente interaction entre les molécules monoclonales à la surface du nanocomposite (Fig. 9b). Il a été trouvé que 7,4 est la valeur de pH la plus appropriée pour maintenir l'activité de l'antigène cible qui peut être décomposé en augmentant le pH de plus de 7,5. Par conséquent, un pH 7,4 a été sélectionné pour d'autres études.

Optimisation de la détermination de la fluorescence de l'antigène CYFRA 21-1 à λ_ex = 470 et λ_em = 520 nm. un Effet du nanocomposite CQDs/ZnO-BM 19.21 immobilisé ajouté, b effet du tampon phosphate salin de pH compris entre 7,3 et 7,5, c effet de la concentration du tampon en utilisant du PBS dans la plage de concentration de 0,01 à 0,05 mol L ⁻¹ , et d effet du temps d'immunoréaction en utilisant 10–60 min

L'influence de la concentration de solution saline tamponnée au phosphate sur l'intensité de fluorescence a été estimée en utilisant une plage de concentration de 0,01 à 0,05 mol L ⁻¹ . The maximum fluorescence intensity signal was obtained using the buffer concentration of 0.01 mol L ⁻¹ . At higher buffer concentrations, the immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposite was aggregated, and the instability of the immunosensing solution may cause a decrease in fluorescence intensity (Fig. 9c). To calculate the immunoreaction time, the analytical procedure was repeated using reaction time ranging from 10 to 60 min. The maximum fluorescence intensity signal was observed by maintaining the reaction between the tested antigen and the immunosensing solution for at least 30 min (Fig. 9d).

Analytical Quantification

Under optimized conditions, the suggested immunoassay method was performed using 12 serum samples containing CYFRA 21-1 antigen in concentration range of 0.01–500 ng mL ¹ . The outcome results were plotted to construct the calibration graph which was linear over a concentration range of 0.01–100 ng mL ⁻¹ with a detection limit of 0.008 ng mL ⁻¹ . The calculated equation was found to be I _F  = 7.933C + 181.24 (r ²  = 0.9992). After six repetitions, the percentage of the relative standard deviation (%RSD) was 1.3%. The acceptable results revealed a high sensitivity of the immunosensing fluorescence method for the quantification of CYFRA 21-1 antigen in serum samples.

System Suitability

System suitability was investigated by carrying out a comparative study between the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing method and the previously addressed methods. The suggested fluorescence system provided significant advantages such as simplicity, eco-friendly, and easy to detect the target analyte in serum samples. The recorded results revealed high sensitivity with a wide linear detection range of 0.01–100 ng mL ¹ and lower detection limit of 0.008 ng mL ¹ (Tableau 1).

Accuracy, Precision, and Selectivity of the Immobilized Immunosensing System

To ensure the accuracy of the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescence immunosensing system for the determination of CYFRA 21-1 antigen in serum samples, 12 serum samples were tested. The outcome data were compared with another previously reported technique [6], which was based on electrochemiluminescence assay using tris 2,2′-bipyridyl ruthenium (II) complex to be excited by tripropylamine. Acceptable results were obtained as indicated in Table 2. Intra-day and inter-day assay were used to investigate the precision of the suggested method. The test was carried out using a serum sample containing 10 ng mL ^− 1 of CYFRA 21-1 antigen. The mean relative standard deviations were 1.1% and 1.3% for both intra- and inter-day assay, respectively, which revealed high precision. Furthermore, the selectivity of the suggested method towards the determination of CYFRA 21-1 antigen was evaluated using some possible interfering species such as amino acids (cysteine, lysine, serine, tyrosine, and glycine), some cations (K ⁺ , Na ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , et Zn ²⁺ ) and some other bio-markers such as CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, and CA 125. The test was carried out under optimum conditions using human serum containing 10 ng mL ⁻¹ CYFRA 21-1 antigen in the presence of 10 ng mL ⁻¹ coexisting species. The outcome data were calculated as relative percentage error (Er%) and the corresponding result did not exceed ± 5% for each interfering species (Table 3). The calculated tolerance values (F-F ⁰ /F ⁰ ) were found to be with the tolerance limits (< 5%). Therefore, the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescence system displayed high selectivity towards the determination of CYFRA 21-1 antigen in human serum.

Analysis of Real Specimens

In real human specimens, the suggested immunosensing fluorescence system based on immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution was exploiting to detect and quantify the percentage (%) recoveries of the tumor marker CYFRA 21-1 antigen. As previously mentioned in the immunosensing procedure, the suggested system was used to determine the CYFRA 21-1 antigen by finding the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of CYFRA 21-1 antigen in serum samples. Certain amounts of the target antigen (0.5, 1.0, and 2.0 ng mL ⁻¹ ) were added to the estimated samples, and the increase in signal intensities was evaluated. After six determinations, the percentage relative standard deviations (%RSD) were calculated. The outcome percentage recoveries were found to be ranged from 96.7 ± 0.7 to 100.0 ± 1.3%. The calculated %RSD was in the range of 0.2–1.4%. The tested serum samples were analyzed using a previously reported method [6] and the percentage recoveries were found to be ranged from 96.1 ± 1.6 to 100.0 ± 0.4% with %RSD 0.3–1.7%. In order to ensure the suitability of the suggested immunosensing fluorescence technique using an immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution, a comparative statistical study using Student’s t test and F test [46] was carried out between the present results and those obtained by others from previously conducted methods (Table 4). The obtained t test and F test values were found to be ranged from 0.354 to 2.181 (2.228)* and 1.16 to 4.0 (5.05)* with respect to the tabulated values of P  = 0.05, respectively. The results revealed good agreement between the suggested method and the previously published procedures. Also, all detected quantities of CYFRA 21-1 antigen in serum samples were within the normal limit indicating no lung cancer was diagnosed in the investigated serum samples.

Conclusion

The present study concerned with the preparation of green synthesis CQDs conjugated with ZnO nanocomposite using Citrus lemon as a precursor. The CQDs/ZnO nanocomposite was employed to form a new fluorescence immunosensing system by immobilizing a monoclonal BM 19.21 antibody through simple peptide bonds. The highly sensitive fluorescence system was used to determine the tumor marker of lung cancer (CYFRA 21-1) in human serum. CYFRA 21-1 antigen was determined via sandwich capping antibody-antigen-antibody reaction using another monoclonal antibody KS 19.1 coating the microtiter wells. The unique features and high sensitivity of the suggested system facilitate the determination of the target tumor marker with high stability and reproducibility. A comparative study was carried out and the outcome results confirmed the suitability and high sensitivity of the suggested immunosensing system, and the results were in agreement with a previously reported conventional technique.

Disponibilité des données et des matériaux

The only outcome data from this study was presented in the manuscript.

Abréviations

%RSD:

Percentage relative standard deviation

BM 19–21:

Specific monoclonal antibody

CQDs:

Carbon quantum dots

CQDs/ZnO:

Carbon quantum dots/zinc oxide

CYFRA-21-1:

Cytikeratin-19 fragment

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

EDC :

Carbodiimide hydrochloride

eV:

Electron volt

FT-IR :

Transformée de Fourier infrarouge

HRTEM :

Microscope électronique à transmission haute résolution

KS 19-1:

Monoclonal cytokeratin 19-specific antibody

Ltd. Co:

Limited company

mAb:

Monoclonal antibody

NHS :

N-hydroxysuccinimide

P:

Degree of confidence

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

SEM :

Microscope électronique à balayage

TEM :

Microscope électronique à transmission

UK:

Unite Kingdom

USA:

United States of America

UV-Vis :

Ultraviolet-visible

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

XRD :

Diffraction des rayons X sur poudre

ZnO :

Oxyde de zinc

ϴ:

Theta degree

λ_max :

Wavelength