Immunodosage par fluorescence rapide et sensible du CYFRA 21-1 utilisant un nanocomposite points quantiques de carbone/oxyde de zinc

Résumé

La détection rapide du cancer du poumon aux stades précoces en utilisant l'antigène fragment de cytokeratine-19 (CYFRA 21-1) comme marqueur tumoral dans le sérum humain joue un rôle crucial dans la survie des patients et une intervention chirurgicale rapide. Cette étude visait à employer des points quantiques de carbone (PQC) conjugués à l'oxyde de zinc (ZnO) synthétisés de manière écologique comme solution d'immunodétection par fluorescence hautement sensible pour la détermination rapide de l'antigène CYFRA 21-1 dans le sérum humain. La méthode proposée utilise une méthode hydrothermale pour préparer les PQC à partir de péricarpe de Citrus lemon. Les PQC formés ont servi d'agent réducteur et stabilisant pour synthétiser le nanocomposite PQC-ZnO. Pour former un système immunosenseur « sandwich » anticorps-antigène-anticorps, un antigène CYFRA 21-1 a été piégé en immobilisant un anticorps monoclonal non conjugué BM 19.21 sur la surface du nanocomposite PQC-ZnO, tandis qu'un autre anticorps monoclonal KS 19.1 était enduit sur la surface des puits de microplaques. Ce système présente une fluorescence réglable enregistrée à l'excitation et l'émission λ_ex = 470 nm et λ_em = 520 nm. Le système d'immunodétection par fluorescence basé sur le nanocomposite PQC-ZnO a affiché une relation linéaire de 0,01 à 100 ng mL⁻¹ avec une limite de détection de 0,008 ng mL⁻¹. Ce système immunosenseur offre une approche prometteuse pour le diagnostic rapide du cancer du poumon par la détection du CYFRA 21-1 dans le sérum humain.

Introduction

Le cancer du poumon est le type de cancer le plus fréquent et agressif, posant d'énormes défis thérapeutiques. La récidive tumorale et les métastases sont les principales causes de décès chez les patients [1]. Le marqueur tumoral fragment de cytokeratine 19 (CYFRA 21-1) est un fragment présent dans de nombreuses cellules épithéliales normales et malignes [2]. Il peut être dosé par immunoessai radiométrique « sandwich ». Les études initiales ont montré qu'aux stades malins du cancer du poumon, le CYFRA 21-1 est libéré dans la circulation sanguine et élevé dans le sérum [3]. Il est donc possible d'améliorer la survie par une détection précoce et une réaction chirurgicale rapide [4].

Peu de techniques ont été rapportées pour la détection du CYFRA 21-1, notamment l'immunoessai enzymatique [5], l'immunoessai par électrochimiluminescence [6] et l'immunoessai radiométrique [7]. Une stratégie avantageuse pour améliorer la sensibilité de détection du CYFRA 21-1 dans le sérum humain reste une préoccupation majeure.

Ces dernières années, des progrès majeurs et une croissance explosive de la nanotechnologie ont été réalisés dans presque tous les domaines de la vie [8]. Parmi eux : systèmes d'administration de médicaments [9], analyse pharmaceutique [10], réactions d'activité catalytique [11], applications médicales [12], marqueurs tumoraux cancéreux [13], et imagerie tissulaire [14].

De nos jours, les techniques de détection basées sur la fluorescence (FL) attirent de nombreux chercheurs grâce à leur conception simple et leur excellente sensibilité. Divers matériaux sensoriels fluorescents ont été conçus et synthétisés pour le monitoring biologique. Les systèmes FL pour la détermination biologique sont hautement luminescents, dispersibles dans l'eau, chimiquement stables et non toxiques [15]. Il existe diverses sondes immunosensibles basées sur la fluorescence pour la détection de biomarqueurs. L'essai compétitif hétérogène consiste à immobiliser des molécules de capture sur la surface, puis à incuber avec des biomarqueurs conjugués à un fluorophore. La compétition entre biomarqueurs libres et conjugués pour la liaison aux molécules de capture diminue l'intensité de fluorescence avec la concentration en biomarqueur [16]. L'essai « sandwich » hétérogène repose sur l'incubation de molécules de capture et de la solution d'intérêt formant un complexe avec les biomarqueurs. Par conséquent, l'intensité de fluorescence augmente avec la concentration en biomarqueur [17].

Dans l'essai compétitif homogène, deux molécules de capture conjuguées à différents fluorophores A et biomarqueurs conjugués au fluorophore B sont mis en compétition dans la solution, augmentant la fluorescence avec la concentration en biomarqueur [18]. Cependant, ces techniques présentent certains inconvénients : temps expérimental long, absence de détection multiplexée, complexité, et parfois résultats relativement faux. Les avancées en nanotechnologie ont permis de développer de nouvelles sondes immunosensibles par fluorescence aux caractéristiques optiques uniques [19]. Depuis la première utilisation de points quantiques en détection de biomolécules, ils ont suscité un grand intérêt car leurs propriétés optiques offrent une grande flexibilité dans le choix de longueurs d'onde appropriées, d'excellents marqueurs pour la détection multiplexée, une biocompatibilité et une capacité de ciblage [20].

Les points quantiques de carbone (PQC) ont démontré d'excellentes propriétés chimiques, physiques, optiques, magnétiques et électriques. Ils peuvent être synthétisés par diverses techniques : hydrothermale, électro-oxydation, ablation laser, micro-ondes [21,22,23,24]. En raison de leur faible toxicité, les chercheurs les considèrent comme de puissants candidats pour de nombreuses sondes fluorescentes. De plus, ils ont une forte capacité de manipulation par réactions chimiques contrôlables pour diverses demandes : biochimique, photochimique, biosensing, bioimagerie, systèmes d'administration de médicaments [25,26,27], et immunoessai [28]. Les études antérieures sur la synthèse des PQC ont révélé certains inconvénients : sources de carbone coûteuses, produits chimiques et réactifs toxiques, ou procédés non sélectifs [29]. Pour limiter ces inconvénients, les chercheurs ont commencé à utiliser des jus de fruits comme sources de carbone novatrices et bon marché [30]. Comme l'utilisation de jus de fruits n'optimise pas l'utilisation des ressources, des PQC fluorescents ont été récemment obtenus à partir d'écorces de fruits [31]. L'utilisation d'écorces offre une voie prometteuse pour la synthèse écologique et verte des PQC.

L'oxyde de zinc (ZnO) est l'un des oxydes métalliques les plus importants, potentiellement actif, stable et peu toxique, largement utilisé dans les dispositifs laser UV, le domaine biomédical, divers capteurs et la photocatalyse [32,33,34,35]. Les nanoparticules de ZnO (ZnONP) présentent des propriétés photoluminescentes près des gammes UV et visible. Cela peut être attribué à l'émission excitonique basée sur la recombinaison directe des paires électron-trou [36] ou à l'émission jaune-vert à 520 nm due à la transition électronique du bord de la bande de conduction vers un niveau de piégeage [37].

Généralement, les points de carbone sont des nanoparticules quasi-sphériques amorphes ou nanocristallines contenant du carbone sp² et sp³, des groupements à base O/N, et des groupements chimiques post-modifiés. De plus, les PQC peuvent s'exciter à des longueurs d'onde plus élevées et modifier l'efficacité des surfaces combinées des paires électron-trou, traitant le quenching dans les systèmes analysés, ce qui peut faciliter la détermination quantitative de biomolécules [38]. Ils peuvent être décorés par des oxydes métalliques comme TiO₂ et ZnO pour former des nanocomposites optiquement actifs exploitables dans la détection de biomarqueurs dans le sérum humain. Le ZnO est un matériau à large bande interdite (3,37 eV), luminescent dans les régions UV et bleue de la lumière visible en raison de la présence d'une grande densité de niveaux de défauts dans la bande interdite [39]. La formation du nanocomposite PQC/ZnO augmente l'absorption de la lumière visible par hybridation du ZnO avec les PQC, et le décalage bleu de l'absorption de luminescence à 520 nm peut être attribué à la recombinaison radiative des lacunes d'oxygène ionisées. En plus de l'augmentation de l'absorption de lumière visible, une meilleure séparation électron-trou et une réduction du temps de transfert électronique interfacial peuvent expliquer la performance optique supérieure du PQC hybridé avec les nanoparticules de ZnO [40]. Par ailleurs, l'augmentation significative des radicaux –OH* générés par le nanocomposite PQC/ZnO à l'interface aqueuse peut provoquer une élévation significative des signaux de fluorescence du système d'analyse. Ainsi, le nanocomposite PQC/ZnO combiné améliore la modification des propriétés optoélectroniques et photoluminescentes de la surface du ZnO et produit un défaut de surface fort avec photoluminescence réglable [41]. De plus, les PQC immobilisés avec des anticorps de bio-reconnaissance formant un système de détection FL anticorps-antigène-anticorps fournissent une sonde viable avec haute spécificité et sensibilité pour l'analyte cible [42].

L'étude proposée présente un nouveau système d'immunoessai par fluorescence simple et ultrasensible basé sur des PQC décorés de nanocomposite ZnO pour déterminer le marqueur tumoral CYFRA 21-1 dans le sérum humain. Le péricarpe de Citrus lemon a été utilisé comme précurseur de carbone pour dériver les PQC par conditions hydrothermales. De plus, il a servi d'agent réducteur et stabilisant pour la synthèse du nanocomposite PQC-ZnO conjugué. Le nanocomposite PQC/ZnO préparé a été immobilisé par un anticorps monoclonal non conjugué BM 19.21 et les puits de microplaques ont été enduits d'un autre anticorps monoclonal KS 19.1 pour former un système immunosenseur « sandwich ».

Matériels et méthodes

Instruments

Les spectres spectrophotométriques des PQC et du nanocomposite PQC/ZnO ont été enregistrés avec un spectrophotomètre Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, UK). La morphologie de surface et la distribution de taille des PQC et du nanocomposite PQC/ZnO synthétisés écologiquement ont été évaluées par microscopie électronique à transmission (MET) modèle JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Allemagne) et microscopie électronique à balayage (MEB) modèle JSM-7610F (JEOL, USA). Les spectres de fluorescence et de transformée de Fourier infrarouge (TFIR) du système immunosenseur suggéré ont été vérifiés avec un lecteur multimode Biotek Synergy H1 (Biotek, Tokyo, Japon) et un spectrophotomètre TFIR Perkin Elmer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japon), respectivement. Les spectres Raman, la spectroscopie photoélectronique par rayons X (XPS) et le motif de diffraction des rayons X (DRX) ont été mesurés avec un spectromètre micro-Raman (CRAIC Technologies, CA, USA), un système de spectroscopie X-ray Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd., Manchester, UK) et un diffractomètre Siemens D-5000 (Siemens, Erfurt, Allemagne), respectivement.

Produits chimiques et réactifs

L'instrument SG-2000-10090 (Barsbuttel, Allemagne) a fourni l'eau déionisée utilisée dans toutes les expériences. Les anticorps monoclonaux non conjugués CYFRA 21-1 (AcM) BM 19.21 et KS 19.1 pour former le système immunosenseur « sandwich » ont été obtenus d'Abcam (Cambridge, UK). Des fruits Citrus lemon ont été fournis par des marchés locaux. Le tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 a été préparé avec chlorure de sodium, chlorure de potassium, hydroxyde de sodium, phosphate de monopotassium et phosphate de disodium (BHD Ltd. Co. Poole, UK). Les sérums normaux commerciaux ont été aimablement fournis par Randox Laboratories (Irlande du Nord-UK). Des échantillons sanguins aléatoires ont été prélevés sur des volontaires sains, avec consentement éclairé obtenu avant l'étude. Sigma-Aldrich (Hambourg, Allemagne) a fourni du carbodiimide hydrochloride (EDC) et du N-hydroxysuccinimide (NHS) de grade pur. Le comité d'éthique de la recherche de l'Université King Saud, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) a approuvé l'étude.

Préparation verte hydrothermale des points quantiques de carbone (PQC)

Le péricarpe de Citrus lemon a été employé pour synthétiser les PQC sous conditions hydrothermales. Environ 20 g de péricarpe et 200 mL d'eau déionisée ont été transférés dans un ballon à fond rond et refluxés à 100 °C sous agitation magnétique continue pendant 6 h. Après refroidissement à température ambiante, l'extrait résultant a été centrifugé à 3500 tr/min et 20 mL de la solution surnageante extraite a été autoclavée et chauffée sous conditions hydrothermales entre 100 et 200 °C pendant des intervalles de 6 à 120 h. Après refroidissement, le surnageant supérieur représente les PQC (Schéma 1).

Synthèse verte des PQC utilisant le péricarpe de Citrus lemon pour obtenir une solution fluorescente de PQC et des sphères de carbone

Préparation du nanocomposite points quantiques de carbone-oxyde de zinc

Pour préparer le nanocomposite PQC/ZnO, une simple réaction de réduction chimique a été réalisée en utilisant les PQC comme agent réducteur et stabilisant. Le nanocomposite a été obtenu en ajoutant 20 mL de PQC à 50 mL d'acétate de zinc 5,0 × 10⁻² mol L⁻¹ à 60 °C sous agitation continue pendant 10 min. Lorsque la couleur du mélange a changé de jaunâtre à crème, le mélange a été laissé au repos 30 min pour compléter la réduction et stocké à 4 °C. Pour assurer la stabilité et vérifier l'agglomération du nanocomposite PQC/ZnO, la spectrométrie UV-Vis a été employée pour enregistrer l'absorbance sur 20 jours à 390 nm. Les résultats ont révélé une haute stabilité et aucun changement significatif d'absorbance.

Caractérisation du nanocomposite points quantiques de carbone-oxyde de zinc

Pour confirmer la formation du nanocomposite PQC/ZnO, différentes techniques microscopiques et spectroscopiques ont été utilisées. L'uniformité et la morphologie de surface des PQC et du nanocomposite ont été étudiées par MET à haute résolution (HRTEM) et MEB. Les spectres optiques ont été étudiés par UV-Vis, TFIR, XPS et spectroscopie Raman. La structure cristalline des PQC préparés a été évaluée par motif DRX.

Processus d'immobilisation

Un anticorps monoclonal non conjugué BM 19.21 a été immobilisé sur la surface du nanocomposite PQC/ZnO synthétisé par une simple liaison amide peptidique entre les groupements amine et carboxyliques actifs. Le processus a été conduit en ajoutant 5,0 mL de chaque NHS et EDC équimolaires 3,0 × 10⁻³ mol L⁻¹ à 5,0 mL de solution de nanocomposite PQC/ZnO sous agitation continue pendant 1 h. Environ 5 mg d'anticorps monoclonal non conjugué BM 19.21 ont été dissous dans 1,0 mL de PBS 0,01 mol L⁻¹ (pH 7,4) et ajoutés à la solution de détection. L'anticorps a été immobilisé sur la surface du nanocomposite PQC/ZnO après incubation à 37 °C pendant 12 h (Schéma 2). La spectrophotométrie a confirmé le succès de l'immobilisation.

Immobilisation de l'anticorps monoclonal BM 19.21 sur la surface du nanocomposite PQC/ZnO

Principe général de la méthode d'immunoessai

Une réaction « sandwich » anticorps-antigène-anticorps a été obtenue en utilisant un autre anticorps monoclonal KS 19.1 enduit sur la surface des puits de microplaques (Schéma 3). Sous conditions optimales d'immunoessai, la concentration de l'antigène CYFRA 21-1 a été déterminée en fonction de l'augmentation de l'intensité du signal de fluorescence.

Schéma illustré représentant une réaction immunosenseur « sandwich » anticorps-antigène-anticorps

Procédure d'immunodétection

La collecte d'échantillons de sérum humain a été fournie par des volontaires aléatoires. La coagulation complète a été assurée avant centrifugation à température ambiante et stockage à 4 °C. La technique de spike a été utilisée pour préparer des échantillons standards contenant l'antigène CYFRA 21-1 dans une gamme de concentration de 0,01 à 500 ng mL⁻¹. Environ 50 μL des échantillons spikés ont été distribués dans les puits de microplaques et mélangés avec 50 μL d'anticorps monoclonal KS 19.1 fraîchement dilué dans du PBS pH 7,4 pendant 30 min, puis incubés sans couvrir la plaque pendant 1 h à 37 °C. Le contenu des puits a été vigoureusement secoué, et les puits rincés trois fois avec de l'eau déionisée (300 μL par puits). Environ 50 μL de la solution de nanocomposite CQDs/ZnO-BM 19.21 immobilisé a été ajoutée à chaque puits, mélangée délicatement, et incubée 30 min à 37 °C. Les échantillons préparés ont été soumis à l'analyse de fluorescence par lecteur de microplaques pour enregistrer les intensités.

Résultats et discussion

Évaluation morphologique des points quantiques de carbone et de leur nanocomposite

Un microscope électronique à transmission (MET) a été utilisé pour caractériser la morphologie de surface et la distribution des PQC dans les échantillons. Pour l'examen au MET, environ 4 μL de suspension de PQC préparée a été déposée sur la grille de carbone du MET. Sur l'image HRTEM (Fig. 1a), les taches noires uniformes avec un espacement de réseau (0,36 nm) indiquaient la formation des PQC. Un graphique de distribution de taille a été tracé et la taille moyenne variait de 1,5 ± 0,5 à 5,0 ± 0,5 nm (Fig. 1b). La taille obtenue prouvait que les PQC formés sont bien des nanomatériaux de taille quantique. De plus, une diffusion dynamique de la lumière (DDL) a été réalisée, et la taille moyenne a été trouvée à ~ 20 ± 0,2 nm. Une différence entre les deux mesures a été observée. Des études antérieures ont révélé que le HRTEM ne montre pas la structure de réseau cristallin des PQC formés à de forts grossissements en raison de leur nature amorphe [43]. De même, dans cette étude, le précurseur de carbone naturel est le péricarpe de Citrus lemon et les PQC dérivés présentent aussi une nature amorphe. La différence dans les mesures de taille peut donc être attribuée à l'agglomération des PQC formés, leur nature amorphe, le mécanisme impliqué dans chaque expérience, et la dynamique d'hydratation des particules.

a Image HRTEM des PQC avec diamètre 5 nm et b graphique de distribution de taille des PQC basé sur le MET

Le nanocomposite PQC/ZnO préparé a été examiné par MET et MEB. Sur l'image MET (Fig. 2a), la présence de particules hexagonales attachées aux PQC indiquait la formation du nanocomposite PQC/ZnO. En MEB, l'échantillon a été enduit d'or pour prévenir l'absorption d'électrons et l'accumulation de charge. La tension d'accélération appliquée était de 15 kV au grossissement × 30 000 (Fig. 2b).

a et b représentent les images MET et MEB du nanocomposite PQC/ZnO

Les spectres UV-Vis et de fluorescence des PQC ont été étudiés. Les spectres enregistrés montraient deux pics significatifs à 224 et 280 nm attribuables aux transitions p~p* et n~P* de C=C et C=O, respectivement. Le spectre de fluorescence des PQC affichait deux signaux aux maxima λ_ex = 360 nm et λ_em = 453 nm (Fig. 3a, b). Le spectre UV-Vis du nanocomposite PQC/ZnO a été étudié. Un pic d'absorption significatif a été observé à 370 nm montrant un décalage bleu-vert (Fig. 4a). Les propriétés de photoluminescence (PL) du nanocomposite PQC/ZnO ont été étudiées. La taille et les défauts de surface des PQC affectent grandement leurs propriétés de luminescence. En fonction de la longueur d'onde d'excitation, l'émission PL des PQC variait [38]. De plus, les particules nano de ZnO présentaient une émission liée aux défauts dans la région d'absorption visible bleu-vert [41]. Par conséquent, les PQC décorant les ZnONP ont produit un excellent nanocomposite pour l'émission PL. Comme montré en Fig. 4b, le spectre PL du PQC/ZnO présentait un décalage bleu avec un pic significatif à 520 nm après excitation à 470 nm. Le décalage observé peut être attribué au chevauchement entre les bandes d'énergie des PQC et ZnONP. Le décalage bleu affiché se situait au niveau d'émission de défaut 2,1 eV.

Spectres spectroscopiques des PQC (a) spectre UV-Vis à 224 et 280 nm et (b) spectre de fluorescence des PQC à λ_ex = 360 et λ_em = 452 nm

Spectres spectroscopiques des PQC/ZnONP a spectre UV-Vis au pic d'absorption 370 nm et b spectre de photoluminescence des PQC/ZnONP à λ_ex = 470 et λ_em = 520 nm

Pour confirmer la formation du nanocomposite PQC/ZnO et du nanocomposite immobilisé PQC/ZnO-BM 19.21, une étude comparative TFIR a été réalisée. Le spectre TFIR enregistré des PQC révélait la présence de pics distincts correspondant à certains groupements fonctionnels, incluant des pics d'étirement vibrationnel à 3462 cm⁻¹ et 2932 cm⁻¹ pour les groupes C–OH et C–H, respectivement. Trois bandes d'absorption vibrationnelle étaient observées à 1749 cm⁻¹, 1375 cm⁻¹ et 1246 cm⁻¹ correspondant à la présence des groupements fonctionnels C=O, C–N et C–O–C, respectivement (Fig. 5a). Un nouveau pic à 436 cm⁻¹ correspondant à une bande de vibration d'étirement Zn–O était observé. Les propriétés réductrices et stabilisantes des PQC provenaient de la présence de groupements –OH et COOH sur leur surface. Ces groupements fonctionnels agissent comme donneurs d'électrons et ont une forte affinité pour la formation du nanocomposite PQC/ZnO. Par conséquent, les PQC ont réduit et stabilisé le nanocomposite formé (Fig. 5b). Comme montré en Fig. 5c, deux nouveaux pics se formaient à 3254 cm⁻¹ et 1675 cm⁻¹, attribués aux vibrations d'étirement N–H et C=O, confirmant l'immobilisation du PQC/ZnO-BM 19.21 via liaisons peptidiques.

Spectres TFIR de a PQC, b nanocomposite PQC/ZnO, et c nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé

Les spectres de spectroscopie photoélectronique par rayons X (XPS) des PQC synthétisés écologiquement ont été examinés. Le spectre obtenu (Fig. 6a) montrait différents groupements fonctionnels à 288 et 286 eV pour C=O et COOH, respectivement. Deux pics significatifs d'énergie de liaison étaient observés à 1044,4 et 1021,5 eV pour Zn 2p_1/2 et Zn 2p_3/2 (Fig. 6b). De plus, le spectre XPS haute résolution du nanocomposite PQC/ZnO confirmait la présence de différents pics d'énergie de liaison à 560, 385, 350, 246 et 200 eV pour O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p et Zn 3d, respectivement (Fig. 6c). Toutes ces données prouvaient la présence de ZnO sur la surface des PQC formant le nanocomposite PQC/ZnO.

Spectres XPS de a PQC, b ZnO, et c nanocomposite PQC/ZnO

Une étude comparative entre les motifs DRX des PQC et du nanocomposite PQC/ZnO a été réalisée. Un pic large à 20° (2θ) pour les points de carbone était noté dans le motif DRX des PQC (Fig. 7a). Cependant, différents pics nets étaient reconnus à 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° et 80° (2θ) pour Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) et (202), respectivement. Les pics observés reflétaient la distribution du ZnO sur la surface des PQC formant le nanocomposite PQC/ZnO (Fig. 7b).

Motif de diffraction des rayons X de a PQC et b nanocomposite PQC/ZnO

Les spectres Raman des PQC préparés, PQC/ZnO et nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé ont été étudiés. Les signaux Raman sont couramment utilisés pour étudier la structure cristalline et ses défauts. La Fig. 8a montrait deux bandes D et G typiques à 1300 et 1520 cm⁻¹ pour les nanoparticules de carbone. Comme rapporté antérieurement, la bande D représente communément les défauts sp³, et la bande G est une caractéristique de vibration plane de carbones sp² liés [44]. Le ratio I_D/I_G a été calculé pour les PQC préparés, trouvé à 1,02 ± 0,03. De nouveaux pics nets étaient observés à 440 et 520 cm⁻¹ pour les nanoparticules de ZnO et les pics typiques des PQC à 1364 et 1595 cm⁻¹. Le ratio I_D/I_G était de 1,2 ± 0,01 indiquant la formation du nanocomposite PQC/ZnO (Fig. 8b). Le spectre Raman du nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé affichait de nombreux pics facilement reconnaissables comme signes confirmatoires des structures secondaire et tertiaire. Les pics dans la région 1007–1128 cm⁻¹ étaient assignés à la structure secondaire majeure de l'anticorps monoclonal. Les pics Raman à 550–682 cm⁻¹ étaient assignés aux conformations disulfure, tandis que ceux à 867–797 cm⁻¹ à l'état de liaison hydrogène des résidus tyrosine. Le décalage significatif du pic Raman à 1630 cm⁻¹ pouvait être attribué à la présence de la structure tertiaire de l'anticorps immobilisé [45] (Fig. 8c). Le ratio I_D/I_G augmentait à 1,4 ± 0,04 révélant une meilleure structure cristalline due à la formation du nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé.

Décalage des spectres Raman de a PQC, b nanocomposite PQC/ZnO, et c nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé

Optimisation des conditions d'immunodétection par fluorescence

La sélection et l'optimisation des conditions d'immunodétection par fluorescence suggérées ont été menées en étudiant divers paramètres. Généralement, la quantité de nanocomposite immobilisé, le pH et la concentration du tampon utilisé, le temps d'incubation entre l'analyte cible dans les échantillons de sérum et les réactifs immunosenseurs doivent être investigués et optimisés. Pour sélectionner la quantité appropriée de nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé, différentes quantités de 10 à 100 μL ont été testées. L'intensité de fluorescence maximale a été observée en ajoutant 50 μL de nanocomposite immobilisé (Fig. 9a). Quatre solutions de PBS de pH 7,2 à 7,5 ont été préparées et testées en fonction de l'intensité de fluorescence. Une légère variation du signal a été observée en changeant le pH. Aux pH 7,2 et 7,3, le signal diminuait en raison de l'instabilité chimique du nanocomposite PQC/ZnO immobilisé. Le signal augmentait aux pH 7,4 à 7,5 grâce à l'excellente interaction entre les molécules monoclonales sur la surface du nanocomposite (Fig. 9b). Il a été trouvé que 7,4 est le pH le plus approprié pour maintenir l'activité de l'antigène cible qui peut se décomposer en augmentant le pH au-delà de 7,5. Le pH 7,4 a donc été sélectionné pour les études ultérieures.

Optimisation de la détermination par fluorescence du CYFRA 21-1 à λ_ex = 470 et λ_em = 520 nm. a Effet de la quantité de nanocomposite PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé ajouté, b effet du PBS pH 7,3–7,5, c effet de la concentration du tampon PBS 0,01–0,05 mol L⁻¹, d effet du temps d'immunoréaction 10–60 min

L'influence de la concentration du PBS sur l'intensité de fluorescence a été estimée avec une gamme de 0,01 à 0,05 mol L⁻¹. L'intensité maximale a été obtenue avec 0,01 mol L⁻¹. À des concentrations plus élevées, le nanocomposite immobilisé s'agrégait, et l'instabilité de la solution immunosenseur pouvait causer une diminution de l'intensité (Fig. 9c). Pour calculer le temps d'immunoréaction, la procédure analytique a été répétée avec des temps de réaction de 10 à 60 min. L'intensité maximale a été observée en maintenant la réaction entre l'antigène testé et la solution immunosenseur pendant au moins 30 min (Fig. 9d).

Quantification analytique

Sous conditions optimisées, la méthode d'immunoessai suggérée a été réalisée avec 12 échantillons de sérum contenant l'antigène CYFRA 21-1 dans une gamme de 0,01 à 500 ng mL⁻¹. Les résultats ont été tracés pour construire le graphique d'étalonnage, linéaire sur 0,01–100 ng mL⁻¹ avec une limite de détection de 0,008 ng mL⁻¹. L'équation calculée était I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). Après six répétitions, l'écart-type relatif (%RSD) était de 1,3 %. Les résultats acceptables révèlent une haute sensibilité de la méthode immunosenseur par fluorescence pour la quantification du CYFRA 21-1 dans les échantillons de sérum.

Aptitude du système

L'aptitude du système a été investiguée par une étude comparative entre la méthode immunosenseur PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisée suggérée et les méthodes antérieures. Le système de fluorescence suggéré offrait des avantages significatifs : simplicité, respect de l'environnement, facilité de détection de l'analyte cible dans les échantillons de sérum. Les résultats montraient une haute sensibilité avec une large gamme linéaire de 0,01–100 ng mL⁻¹ et une limite de détection inférieure de 0,008 ng mL⁻¹ (Tableau 1).

Exactitude, précision et sélectivité du système immunosenseur immobilisé

Pour assurer l'exactitude du système de fluorescence immunosenseur PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé pour la détermination du CYFRA 21-1 dans les échantillons de sérum, 12 échantillons ont été testés. Les données ont été comparées avec une technique antérieurement rapportée [6], basée sur un essai par électrochimiluminescence utilisant le complexe tris(2,2'-bipyridyl)ruthénium(II) excité par la tripropylamine. Des résultats acceptables ont été obtenus (Tableau 2). Les essais intra-jour et inter-jour ont investigué la précision. Le test a utilisé un échantillon de sérum contenant 10 ng mL⁻¹ de CYFRA 21-1. Les écarts-types relatifs moyens étaient de 1,1 % et 1,3 % pour les essais intra- et inter-jour, révélant une haute précision. De plus, la sélectivité envers la détermination du CYFRA 21-1 a été évaluée avec des espèces interférentes possibles : acides aminés (cystéine, lysine, sérine, tyrosine, glycine), cations (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺) et autres biomarqueurs (CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, CA 125). Le test a été réalisé sous conditions optimales avec du sérum humain contenant 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 en présence de 10 ng mL⁻¹ d'espèces coexistantes. Les données étaient calculées en pourcentage d'erreur relative (Er%) et ne dépassaient pas ± 5 % pour chaque espèce interférente (Tableau 3). Les valeurs de tolérance calculées (F-F⁰/F⁰) étaient dans les limites de tolérance (< 5 %). Le système immunosenseur par fluorescence PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisé affichait donc une haute sélectivité pour la détermination du CYFRA 21-1 dans le sérum humain.

Analyse de spécimens réels

Dans de vrais spécimens humains, le système immunosenseur par fluorescence basé sur la solution PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisée a été exploité pour détecter et quantifier les pourcentages de récupération du marqueur tumoral CYFRA 21-1. Comme mentionné dans la procédure immunosenseur, le système a déterminé l'antigène CYFRA 21-1 en trouvant la relation entre l'intensité de fluorescence et la concentration dans les échantillons de sérum. Certaines quantités de l'antigène cible (0,5, 1,0 et 2,0 ng mL⁻¹) ont été ajoutées aux échantillons estimés, et l'augmentation des intensités de signal évaluée. Après six déterminations, les écarts-types relatifs (%RSD) ont été calculés. Les pourcentages de récupération variaient de 96,7 ± 0,7 à 100,0 ± 1,3 %. Le %RSD calculé était entre 0,2 et 1,4 %. Les échantillons de sérum testés ont été analysés par une méthode antérieurement rapportée [6] avec des récupérations de 96,1 ± 1,6 à 100,0 ± 0,4 % et %RSD 0,3–1,7 %. Pour assurer la pertinence de la technique immunosenseur par fluorescence suggérée utilisant la solution PQC/ZnO-BM 19.21 immobilisée, une étude statistique comparative avec le test de Student t et le test F [46] a été réalisée entre les résultats présents et ceux obtenus par des méthodes antérieures (Tableau 4). Les valeurs t et F obtenues variaient de 0,354 à 2,181 (2,228)* et 1,16 à 4,0 (5,05)* par rapport aux valeurs tabulées pour P = 0,05. Les résultats révèlent un bon accord entre la méthode suggérée et les procédures publiées précédemment. De plus, toutes les quantités détectées de CYFRA 21-1 dans les échantillons de sérum étaient dans les limites normales, indiquant qu'aucun cancer du poumon n'a été diagnostiqué dans les échantillons étudiés.

Conclusion

L'étude porte sur la préparation de PQC à synthèse verte conjugués au nanocomposite ZnO en utilisant Citrus lemon comme précurseur. Le nanocomposite PQC/ZnO a servi à former un nouveau système immunosenseur par fluorescence en immobilisant un anticorps monoclonal BM 19.21 par simples liaisons peptidiques. Le système de fluorescence hautement sensible a déterminé le marqueur tumoral du cancer du poumon (CYFRA 21-1) dans le sérum humain. L'antigène CYFRA 21-1 a été déterminé via réaction « sandwich » anticorps-antigène-anticorps utilisant un autre anticorps monoclonal KS 19.1 enduit sur les puits de microplaques. Les caractéristiques uniques et la haute sensibilité du système suggéré facilitent la détermination du marqueur tumoral cible avec haute stabilité et reproductibilité. Une étude comparative a confirmé la pertinence et la haute sensibilité du système immunosenseur suggéré, les résultats étant en accord avec une technique conventionnelle antérieurement rapportée.

Disponibilité des données et matériaux

Les seules données issues de cette étude ont été présentées dans le manuscrit.

Abréviations

%RSD :

Pourcentage d'écart-type relatif

BM 19–21 :

Anticorps monoclonal spécifique

PQC :

Points quantiques de carbone

PQC/ZnO :

Points quantiques de carbone/oxyde de zinc

CYFRA-21-1 :

Fragment de cytokeratine-19

DDL :

Diffusion dynamique de la lumière

EDC :

Carbodiimide hydrochloride

eV :

Électron-volt

TFIR :

Transformée de Fourier infrarouge

HRTEM :

Microscopie électronique à transmission à haute résolution

KS 19-1 :

Anticorps monoclonal spécifique de la cytokeratine 19

Ltd. Co :

Société à responsabilité limitée

AcM :

Anticorps monoclonal

NHS :

N-hydroxysuccinimide

P :

Degré de confiance

PBS :

Tampon phosphate salin

MEB :

Microscopie électronique à balayage

MET :

Microscopie électronique à transmission

UK :

Royaume-Uni

USA :

États-Unis d'Amérique

UV-Vis :

Ultraviolet-visible

XPS :

Spectroscopie photoélectronique par rayons X

DRX :

Diffraction des rayons X en poudre

ZnO :

Oxyde de zinc

θ :

Degré thêta

λ_max :

Longueur d'onde