Nanoparticules à base de laminarine libérant la protoporphyrine IX pour une photothérapie dynamique améliorée : absorption cellulaire, génération de ROS et efficacité in vivo

Nous rapportons la synthèse d'un système micellaire hématine-laminarine-acide dithiodipropionique-MGK (HLDM) à double sensibilité pH/redox encapsulant la Pp IX, visant à améliorer la solubilité, l'accumulation tumorale et la cytotoxicité médiée par les ROS.

Méthodes

Matériaux

Laminarine (Sigma-Aldrich), DMSO, L-glutathion, Hoechst 33342, DMEM, FBS, kit de dosage ROS (Beyotime), réactifs H&E, Pp IX (Aladdin) et tous les autres réactifs étaient de grade analytique. Les cellules de cancer du sein humain MCF-7 provenaient de l'Université de Yantai, et des souris nues femelles (14–18 g) de Beijing Vital River.

Synthèse et caractérisation de HLDM

HLDM a été synthétisé par acylation séquentielle de l'acide dithiodipropionique avec MGK, suivie d'une estérification médiée par EDC/DMAP avec la laminarine. Le produit a été vérifié par RMN ¹H, IR et spectroscopie UV-vis.

Préparation des micelles HLDM chargées en Pp IX

HLDM et Pp IX ont été co-dissous dans un solvant organique, puis dialysés contre de l'eau déionisée (PMCO 2000 Da) sous agitation (600 tr/min). Les micelles ont été récupérées à température ambiante.

Caractérisation

La taille des particules et le potentiel zêta ont été mesurés avec un analyseur Beckman Coulter ; la morphologie a été examinée par MET (Hitachi H-600). L'efficacité d'encapsulation (EE) et la charge en médicament (DL) ont été calculées à partir de l'absorbance UV-vis à 630 nm.

Culture cellulaire et études d'absorption

Les cellules MCF-7 ont été cultivées dans DMEM/FBS. Pour l'absorption, les cellules ont été incubées avec Pp IX libre, micelles LH ou micelles HLDM (20 µg mL⁻¹) pendant 1–4 h. La fluorescence a été observée par microscopie inversée (Nikon Eclipse E400).

Localisation subcellulaire

Après 4 h d'incubation, les cellules ont été fixées, contre-colorées avec Hoechst 33342 et imageries pour déterminer la distribution de Pp IX.

Détection des ROS

Les cellules MCF-7 ont été traitées avec les formulations (20 µg mL⁻¹) pendant 2 h, irradiées à 630 nm pendant 30 min, puis incubées avec DCFH-DA (10 µmol L⁻¹). La fluorescence (exc 488 nm, em 525 nm) indiquait la production de ROS.

Phototoxicité et test de viabilité

Les cellules ont été ensemencées en plaques 96 puits, exposées à des concentrations variables (1–10 µg mL⁻¹) de chaque formulation, irradiées (630 nm, 30 min) et incubées 24 h. Le MTT (5 mg mL⁻¹) a été ajouté et l'absorbance à 490 nm mesurée pour calculer la viabilité.

Morphologie nucléaire

Après 4 h de traitement, les cellules ont été fixées, colorées avec un colorant nucléaire et imageries pour évaluer la condensation de la chromatine.

Efficacité et sécurité in vivo

Des cellules MCF-7 (1,5 × 10⁶) ont été injectées sous-cutanément chez des souris nues. Une fois les tumeurs atteintes 70–100 mm³, les souris ont reçu l'un de cinq traitements : sérum physiologique, Pp IX libre (5 mg kg⁻¹), micelles HLDM (5 mg kg⁻¹ équivalents Pp IX), Pp IX libre + lumière 630 nm, ou micelles HLDM + lumière 630 nm. Le volume tumoral et le poids corporel ont été surveillés tous les deux jours ; les souris ont été euthanasiées au jour 20 pour histologie (H&E).

Analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± ET (n = 3). Les différences ont été évaluées par ANOVA à un facteur, avec *P < 0,05 considéré significatif.

Résultats et discussion

Caractérisation de HLDM

La RMN ¹H a confirmé la conjugaison réussie de MGK, acide dithiodipropionique, hématine et laminarine, avec des pics caractéristiques à δ 0,8 ; 2,8 ; 6,5 et 3–4 ppm. Les spectres IR ont montré la bande carbonyle d'ester attendue, et l'UV-vis a révélé une absorption distincte à 580 nm correspondant à l'hématine dans HLDM.

Propriétés des micelles

La diffusion dynamique de la lumière a révélé un diamètre moyen de 149,3 ± 35 nm et un potentiel zêta quasi neutre. Les images MET ont confirmé une morphologie sphérique avec une agrégation occasionnelle à concentrations plus élevées. EE et DL étaient de 68 % et 12 %, respectivement, indiquant un chargement efficace.

Absorption cellulaire

L'imagerie par fluorescence a démontré une accumulation temps- et dose-dépendante de Pp IX dans les cellules MCF-7, les micelles HLDM montrant une absorption nettement supérieure à la Pp IX libre ou aux micelles LH. L'absorption accrue est attribuée au mécanisme de libération sensible au pH/redox.

Distribution subcellulaire

Les études de colocalisation ont révélé une accumulation prédominante cytoplasmique et mitochondriale de Pp IX délivrée par les micelles HLDM, cohérente avec le ciblage organellaire connu de Pp IX.

Génération de ROS

La fluorescence DCFH-DA était significativement plus élevée dans les cellules traitées avec micelles HLDM plus lumière comparé à Pp IX libre, confirmant une production robuste de ROS uniquement sous illumination.

Phototoxicité

Sous irradiation, les micelles HLDM ont atteint >80 % de mort cellulaire à 5 µg mL⁻¹, tandis que Pp IX libre nécessitait >10 µg mL⁻¹ pour un effet comparable. Dans l'obscurité, toutes les formulations ont présenté une cytotoxicité minimale.

Morphologie nucléaire

Les micelles chargées en Pp IX ont induit une condensation de chromatine et une fragmentation nucléaire dose-dépendantes, indiquant l'apoptose.

Efficacité in vivo

Seul le groupe micelles HLDM recevant la lumière 630 nm a montré une inhibition significative de la croissance tumorale (≈ 70 % de réduction au jour 20). Pp IX libre avec lumière a produit une suppression modeste, tandis que les groupes sérum physiologique et non irradiés continuaient à croître. Le poids corporel est resté stable dans tous les groupes, et la coloration H&E a révélé une nécrose extensive dans le groupe HLDM + lumière.

Conclusions

Nous avons conçu une micelle à base de laminarine, à double sensibilité pH/redox, qui encapsule efficacement la Pp IX, améliore sa solubilité et facilite une libération tumorale-spécifique. Le système délivre une phototoxicité puissante médiée par les ROS in vitro et atteint une activité antitumorale prononcée in vivo sans toxicité systémique. Ces résultats positionnent les micelles HLDM comme une plateforme prometteuse pour la future photothérapie dynamique du cancer du sein et d'autres tumeurs solides.

Disponibilité des données et matériaux

Les jeux de données soutenant les conclusions de cet article sont inclus dans l'article.

Abréviations

HLDM

Hématine-Laminarine-Acide dithiodipropionique-MGK

LH

Laminarine-Hématine

Pp IX

Protoporphyrine IX

PDT

Photothérapie dynamique

ROS

Espèces réactives de l'oxygène