Immunofluorescence à base de nanoparticules d'or pour la détection rapide et sensible de biomarqueurs cancéreux associés à l'inflammation

Résumé

La détection précoce du cancer repose sur l'identification de signaux inflammatoires qui précèdent la malignité. Nous avons évalué des nanoparticules d'or (AuNP) conjuguées à des anticorps primaires comme agents de contraste ciblés pour l'inflammation chronique dans des modèles de colite ulcéreuse (CU) et de stéatohépatite, conditions qui prédisposent aux cancers colorectal et hépatique. Des AuNP (7,1 nm) ont été synthétisées via une voie rentable et écologique et conjuguées avec des anti-COX-2, anti-MIF et Alexa Fluor® 488 (ALEXA). Trois protocoles d'immunofluorescence (IF) — incubation 30 min et overnight, plus un protocole d'amplification — ont été comparés au flux de travail IF standard ALEXA. La cytométrie de flux (FC) a utilisé des AuNP pour marquer les macrophages M2. La conjugaison a été réalisée par adsorption directe, confirmée par une intensité de fluorescence comparable à ALEXA. Le protocole AuNP 30 min a réduit le temps total IF de 23 h à 5 h et le temps FC de 4 h à 1 h, offrant une alternative économisant la main-d'œuvre, cliniquement viable pour le diagnostic du cancer induit par l'inflammation.

Introduction

Les nanoparticules d'or (AuNP) ont émergé comme sondes polyvalentes pour l'imagerie optique, offrant des propriétés optiques ajustables par la taille, une haute biocompatibilité et une facilité de fonctionnalisation. Les conjugués anticorps-AuNP permettent la détection en temps réel de l'absorption d'or dans les cellules vivantes, facilitant la quantification précise de la distribution des nanoparticules dans les états pathologiques. Historiquement, l'or colloïdal a été employé pour la microscopie électronique des antigènes bactériens, puis étendu à diverses applications biomédicales, y compris la génomique, la biosenseur et la thérapie photothermique. En oncologie, les AuNP amplifient les signaux de fluorescence et l'atténuation des rayons X, améliorant la sensibilité de l'imagerie tumorale.

S'appuyant sur nos travaux antérieurs démontrant des anticorps conjugués aux AuNP pour l'imagerie du carcinome colorectal, cette étude introduit trois protocoles IF qui remplacent les fluorophores conventionnels par des AuNP, accélérant ainsi la coloration et réduisant la consommation de réactifs. Nous validons également les AuNP en FC pour le marquage des macrophages M2, acteurs clés de l'inflammation associée aux tumeurs.

Méthodes

Objectif

Démontrer que les AuNP peuvent remplacer les fluorophores conventionnels en IF et FC, fournissant une coloration plus rapide et tout aussi fiable pour les biomarqueurs du cancer induit par l'inflammation.

Réactifs

AuCl₃, PVP (PM 10 000), NaOH, glycérol, PBS, BSA (5 %), anti-COX-2, anti-MIF, anticorps secondaire Alexa Fluor® 488, et Fluoroshield avec DAPI.

Synthèse et caractérisation des AuNP

Des AuNP sphériques (7,1 nm) ont été préparées par réduction d'AuCl₃ en présence de PVP, glycérol et NaOH, produisant un colloïde rouge foncé. Les spectres UV-vis et les mesures de fluorescence ont confirmé la monodispersité et la résonance de plasmon de surface. Les anticorps ont été adsorbés directement sur les AuNP, réalisant des conjugués stables.

Modèles animaux

La CU induite par l'acide acétique chez des rates Wistar femelles (n = 5) et la stéatohépatite induite par l'alcool chez des rats Wistar mâles (n = 5) ont été établies selon des protocoles standards. Les tissus ont été fixés, inclus et coupés en sections (4 µm) pour l'IF.

Protocoles d'immunofluorescence

Trois protocoles basés sur les AuNP ont été évalués :

• NP1 (30 min) : Incubation de l'anticorps primaire (1:500 COX-2, 1:400 MIF) 30 min, suivie de 30 min d'ajout d'AuNP.
• NP2 (overnight) : Incubation de l'anticorps primaire 18 h, puis 1 h d'incubation AuNP.
• NP3 (amplification) : ALEXA dilué (1:200–1:800) mélangé avec AuNP ; incubation 1 h.

Les protocoles ALEXA standards (A1 overnight, A2 30 min) ont servi de contrôles. Les sections ont été imagées sur un Zeiss Observer z.1 avec analyse quantitative de fluorescence pixel par pixel.

Marquage des macrophages M2 et cytométrie de flux

Des cellules RAW 264.7 ont été polarisées en M2 avec IL-4 (20 ng mL⁻¹) pendant 48 h. Les cellules ont été incubées avec les anticorps primaires COX-2/MIF et marquées soit avec ALEXA, soit avec AuNP (protocole N1). Après fixation, les échantillons ont été analysés sur un BD FACSCanto II ; les données ont été traitées avec FlowJo.

Analyse statistique

ANOVA avec post-hoc Bonferroni (IF) et test de Dunn (FC) ont évalué la significativité ; p < 0,05 considéré significatif.

Résultats

Microscopie

Les images H&E ont confirmé la pathologie inflammatoire attendue. L'intensité de fluorescence de NP1 et NP2 correspondait à A1, et NP3 a amplifié le signal, permettant une dilution double d'ALEXA sans perte de luminosité. Les protocoles à temps court (30 min) (A2, NP1) ont produit une coloration comparable aux standards overnight, démontrant la faisabilité pour le diagnostic rapide.

Cytométrie de flux

Les cellules RAW polarisées par IL-4 ont exhibé une élévation de CD163 (marqueur M2) et CD86 (M1) inchangé. Les COX-2/MIF marqués par AuNP ont produit des intensités de fluorescence comparables à ALEXA, confirmant une liaison de surface efficace et une utilisation minimale de réactifs.

Spectroscopie de fluorescence

Les AuNP ont exhibé une émission à 650–900 nm sous excitation 320 nm. L'adsorption d'anticorps a augmenté la fluorescence de ~12 a.u., indiquant une conjugaison réussie et un signal amplifié dû à la réduction du quenching par l'oxygène.

Discussion

Les AuNP possèdent une fluorescence intrinsèque et agissent comme amplificateurs de signal en bloquant l'accès de l'oxygène aux électrons de surface, amplifiant ainsi la résonance de plasmon de surface. La conjugaison par adsorption directe fournit une approche simple, évolutive, évitant la chimie covalente et préservant l'activité des anticorps. Le protocole NP1 réduit le flux de travail IF total de 18 h, tandis que le temps FC passe de 4 h à 1 h, offrant des gains d'efficacité substantiels. Important, les AuNP conservent la sensibilité pour COX-2 et MIF, biomarqueurs clés dans le cancer colorectal associé à la CU et le carcinome hépatocellulaire lié à la stéatohépatite alcoolique. Étant donné la prévalence élevée de l'inflammation chronique dans le risque de cancer, des méthodes de détection rapides et rentables sont essentielles.

Conclusions

Les protocoles IF et FC basés sur les AuNP délivrent des intensités de fluorescence à la hauteur des fluorophores conventionnels, tout en réduisant drastiquement les temps d'incubation et la consommation de réactifs. Ces résultats ouvrent la voie à l'adoption clinique des AuNP en pathologie diagnostique et potentiellement en ciblage thérapeutique des macrophages M2.

Abréviations

A1

Protocole standard ALEXA

A2

Protocole ALEXA modifié

ALD

Maladie hépatique alcoolique

ALEXA

Alexa Fluor® 488®

AuNP

Nanoparticules d'or

BSA

Albumine sérique bovine

COX-2

Cyclooxygénase-2

FC

Cytométrie de flux

FI

Imagerie de fluorescence

IF

Immunofluorescence

MDA

Malondialdéhyde

MIF

Facteur inhibiteur de migration des macrophages

NP1

Protocole nanoparticules 1

NP2

Protocole nanoparticules 2

NP3

Protocole nanoparticules 3

SPR

Résonance de plasmon de surface

UC

Colite ulcéreuse