Cytotoxicité et internalisation cellulaire dépendantes de la forme de nanoparticules d'or réduites par thé vert dans les cellules cancéreuses

Résumé

Dans ce rapport, trois formes différentes de nanoparticules d'or (AuNPs) capsulées par chitosane (nanosphères, nanoétoiles et nanobâtonnets) ont été synthétisées pour investiguer les effets de la forme sur la cytotoxicité et l'internalisation cellulaire dans des cellules cancéreuses. L'extrait de thé vert a été utilisé comme agent réducteur pour réduire les sels d'or en nanosphères d'or. Les nanoétoiles ont été préparées en utilisant une solution de nanosphères comme solution de semence. Les nanobâtonnets ont été synthétisés par une méthode conventionnelle. Les trois types d'AuNPs ont montré leurs bandes de résonance plasmonique de surface caractéristiques par spectrophotométrie UV-visible. En imagerie MET à haute résolution, des structures de réseau étaient clairement observées dans les trois formes, confirmant la nature cristalline des nanoparticules. Les trois solutions colloïdales d'AuNPs ont conservé leur stabilité colloïdale dans diverses solutions. Pour évaluer la cytotoxicité, le test 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT) a été effectué sur quatre lignées de cellules cancéreuses. La cytotoxicité était la plus élevée pour les nanobâtonnets, suivie des nanoétoiles et enfin des nanosphères. L'internalisation cellulaire des AuNPs dans les cellules d'hépatocarcinome humain (HepG2) a été mesurée, et les résultats suivaient l'ordre nanosphères > nanobâtonnets > nanoétoiles. Les résultats de cette étude peuvent aider dans la conception de forme d'AuNPs pour applications thérapeutiques comme véhicules de délivrance de médicaments en nanomédecine.

Introduction

Les plantes contiennent des métabolites primaires et secondaires naturels, incluant flavonoïdes, saponines, alcaloïdes, stéroïdes, coumarines, tanins, phénols, terpénoïdes, glucides, protéines et acides aminés. Récemment, les extraits de plantes ont été utilisés pour la synthèse de nanomatériaux, spécifiquement nanoparticules métalliques comme or, argent, dioxyde de titane, cuivre, palladium, oxyde de zinc et platine [1]. Divers phytochimiques participent activement à la conversion de sels métalliques en nanoparticules métalliques comme agents réducteurs. De plus, les extraits de plantes jouent un rôle d'agents stabilisants pour maintenir la stabilité colloïdale des nanoparticules métalliques en solution. Les agents réducteurs chimiques sont généralement nocifs et toxiques pour les organismes vivants. En contraste, l'utilisation d'extraits de plantes dans la synthèse de nanoparticules métalliques est verte, éco-responsable et durable. Diverses parties de plantes, comme tiges, fruits, graines, feuilles et fleurs, sont utilisées pour synthétiser des nanoparticules métalliques [1, 2]. Des revues exhaustives ont examiné la synthèse verte d'AuNPs utilisant des extraits de plantes comme agents réducteurs [2,3,4]. En utilisant cette stratégie verte, l'étape de synthèse est effectuée en une seule étape et en un seul pot. De plus, le processus est simple, facile, rentable et éco-responsable. La taille, la forme et la topographie des AuNPs dépendent des concentrations de sels d'or et d'extraits, du temps de réaction, de la température de réaction et du pH de la solution. Les techniques spectroscopiques et microscopiques sont employées pour caractériser les AuNPs, incluant spectrophotométrie UV-visible, diffraction des rayons X, spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), microscopie électronique en transmission (MET), microscopie à force atomique (AFM), microscopie électronique à balayage (MEB), et mesures de taille hydrodynamique et potentiel zêta. Ces AuNPs verts sont appliqués comme catalyseurs, antioxydants, agents antimicrobiens et anticancéreux [5,6,7,8].

Au laboratoire des auteurs, des extraits de plantes (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum, et Garcinia mangostana) ont été utilisés comme agents réducteurs pour synthétiser vertement des AuNPs et nanoparticules d'argent (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. La partie aérienne d'A. capillaris a été extraite et utilisée pour la synthèse d'AgNPs et AuNPs [9, 15, 16]. Les AgNPs préparés ont exercé une excellente activité antibactérienne contre Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes et Klebsiella oxytoca comparé à l'extrait seul [15]. Ce résultat indiquait que l'effet synergique de la combinaison AgNPs et extrait contribuait à l'activité antibactérienne améliorée. Intéressant, des AgNPs synthétisés utilisant A. capillaris en présence de bromure de cétyltriméthylammonium ont montré une activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline [16]. De plus, des AuNPs synthétisés utilisant A. capillaris ont montré une activité catalytique vers la réaction de réduction du 4-nitrophénol [9]. L'extrait de L. japonicus a été utilisé pour la synthèse d'AgNPs présentant des améliorations remarquables de l'activité antibactérienne [10]. On a observé que l'activité antibactérienne vers les bactéries Gram-négatives était supérieure à celle contre les bactéries Gram-positives. L'extrait de racine de P. tenuifolia a aussi été utilisé pour la synthèse d'AuNPs et AgNPs [11, 17]. Une activité anticoagulante améliorée et une activité antibactérienne ont été observées dans les AuNPs et AgNPs respectivement, synthétisés utilisant l'extrait de P. tenuifolia. Le plus intéressant, des AgNPs synthétisés utilisant l'extrait de C. sappan ont montré une activité antibactérienne efficace contre S. aureus résistant à la méthicilline [18]. L'extrait de G. mangostana a produit des AgNPs en forme d'haltère asymétrique avec effets apoptotiques [14].

Des rapports précédents ont examiné la synthèse verte d'AuNPs et AgNPs utilisant l'extrait de feuilles de thé [19,20,21,22,23]. Kamal et collaborateurs ont rapporté la synthèse réussie d'AgNPs 25 nm [19]. Dans un autre rapport, des AgNPs sphériques de 20 à 90 nm ont été synthétisés utilisant l'extrait de feuilles de thé [20]. Les AgNPs synthétisés montraient une légère activité antibactérienne contre E. coli. Des AgNPs sphériques de 3,42~4,06 nm ont aussi été préparés par Loo et collaborateurs utilisant l'extrait de feuilles de thé [21]. Vaseeharan et collaborateurs ont synthétisé des AgNPs antibactériens utilisant l'extrait de feuilles de thé [22]. Les AgNPs synthétisés étaient efficaces contre l'infection pathogène Vibrio harveyi. Begum et collaborateurs ont utilisé l'extrait de feuilles de thé noir pour synthétiser à la fois AuNPs et AgNPs [23]. À ce jour, majoritairement des AgNPs sphériques ont été synthétisés utilisant l'extrait de feuilles de thé.

Dans ce rapport, le chitosane a été utilisé comme agent de capsule pour les AuNPs. Le chitosane a été exploré comme véhicule de délivrance de gènes/médicaments en raison de sa haute biocompatibilité, faible allergénicité, biodégradabilité et faible toxicité [24,25,26]. Le chitosane provient de la chitine, abondante dans les exosquelettes d'insectes et crustacés comme crabes, homards et crevettes. La chitine est un polysaccharide composé de N-acétyl-D-glucosamine lié par liaisons glycosidiques β(1-4). Le chitosane peut être obtenu de la chitine par un processus de déacétylation hétérogène. Le chitosane possède lui-même une activité antibactérienne, antifongique, antitumorale et antioxydante [25]. Comme agent de capsule, le chitosane contacte directement les AuNPs par un mécanisme électrostérique [26]. Les nanoparticules de chitosane affectent le mécanisme d'internalisation cellulaire par les cellules A549 sans modifier la cytotoxicité [24]. De plus, le degré de déacétylation du chitosane est plus influent que le poids moléculaire sur l'internalisation cellulaire et la cytotoxicité [24].

La plupart des études se sont concentrées sur la synthèse d'AgNPs sphériques utilisant l'extrait de feuilles de thé. Ici, l'extrait de feuilles de thé vert a été utilisé pour synthétiser des nanosphères et nanoétoiles d'or. Les nanosphères ont été utilisées comme semences pour la synthèse de nanoétoiles par croissance semée. Pour comparaison, des nanobâtonnets ont été synthétisés par une méthode conventionnelle courante [27]. Trois formes différentes d'AuNPs (nanosphères, nanoétoiles, nanobâtonnets) ont été capsulées avec chitosane pour augmenter leur biocompatibilité et stabilité colloïdale. Ces AuNPs ont été caractérisées par spectrophotométrie UV-visible, microscopie électronique en transmission à haute résolution (HR-MET) et FT-IR. Des mesures de taille hydrodynamique par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et mesures de potentiel zêta ont été conduites avant et après capsule au chitosane. La stabilité colloïdale a été évaluée dans solutions salines, tampon et milieu de culture cellulaire. Pour mesurer la cytotoxicité, le test MTT a été appliqué à quatre cellules cancéreuses : AGS (adénocarcinome gastrique humain), HeLa (adénocarcinome épithélial du col utérin humain), HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain), et HT29 (adénocarcinome colorectal humain). L'internalisation cellulaire des AuNPs dans les cellules HepG2 a été mesurée quantitativement par spectroscopie d'émission optique à plasma couplé par induction (ICP-OES) et spectrométrie de masse à plasma couplé par induction par ablation laser (LA-ICP-MS).

Matériels et méthodes

Matériaux et instrumentation

L'acide chloroaurique trihydraté (HAuCl₄·3H₂O), bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), chitosane (de coquilles de crevettes, ≥ 75 % déacétylé), et 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tous les autres réactifs étaient de grade analytique. Un spectrophotomètre Shimadzu UV-1800 ou UV-2600 a été utilisé pour acquérir les spectres UV-visible dans une cuve en quartz (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japon). Les mesures de taille hydrodynamique par DLS et de potentiel zêta ont été conduites en utilisant un NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA). Un Varian 640 IR a été utilisé pour acquérir les spectres FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ; l'échantillon mesuré a été préparé par la méthode du disque KBr. Les images HR-MET ont été capturées utilisant un JEM-3010 opéré à 300 kV (JEOL, Tokyo, Japon) ; l'échantillon a été chargé sur une grille de cuivre recouverte de carbone (type-B carbone, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA) et laissé sécher au four à 37 °C pendant 24 h. Pour la sonication, un modèle WUC-A22H a été utilisé (Daihan Scientific Co. LTD., Séoul, République de Corée). Une centrifugeuse 5424R (Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne) et un FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, République de Corée) ont été utilisés pour la centrifugation et la lyophilisation respectivement. Pour l'internalisation cellulaire des AuNPs, un Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) et un J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, USA) ont été utilisés.

Préparation de l'extrait de thé vert

L'Institut du Thé Vert de Hadong (Hadong, Gyeongnam, République de Corée) a gracieusement fourni un don de feuilles de thé vert séchées. Un mélangeur a été utilisé pour préparer des poudres des feuilles séchées. L'extraction a été réalisée en mélangeant eau déionisée (2 L) et feuilles en poudre (200 g). L'extraction a été laissée à procéder pendant 1 h par sonication à température ambiante avec trois répétitions. Des papiers filtre Whatman ont été utilisés pour filtrer les fractions aqueuses pour éliminer les matériaux insolubles. Ensuite, le filtrat a été centrifugé (3 000 g, 18 °C, 25 min), et le surnageant collecté. Le surnageant collecté a été filtré sur seringue, et le filtrat lyophilisé. Le matériel lyophilisé a été dissous dans l'eau déionisée pour créer une solution stock avec une concentration finale de 2 % (p/v) pour la synthèse verte décrite dans la section suivante.

Synthèse des nanosphères d'or utilisant l'extrait

Le processus de synthèse des nanosphères est illustré en Fig. 1a. La solution stock décrite dans la section précédente a été utilisée pour la synthèse. Dans une fiole en verre, l'extrait (concentration finale 0,03 %) et l'acide chloroaurique trihydraté (concentration finale 0,5 mM) ont été mélangés, et l'hydroxyde de sodium (concentration finale 1 mM) a été ajouté. De l'eau déionisée a été ajoutée pour un volume final de 2 mL. L'incubation au four a été réalisée dans un four sec à 80 °C pendant 2 h. La résonance plasmonique de surface (SPR) des nanosphères a été surveillée en acquérant les spectres UV-visible sur la gamme 300~800 nm. Les nanosphères ont aussi été utilisées comme semences pour la synthèse des nanoétoiles décrite dans la section suivante.

Synthèse des nanoétoiles d'or

Le processus de synthèse des nanoétoiles est illustré en Fig. 2a. Les nanosphères (50 µL) synthétisées comme décrit dans la section précédente ont été agitées (750 tr/min) avec une barre magnétique sur une plaque chauffante à température ambiante. L'acide chloroaurique trihydraté (0,25 mM, 5 mL) a été ajouté à cette solution. Après 15 s, deux solutions ont été ajoutées simultanément : nitrate d'argent (1 mM, 50 µL) et acide ascorbique (fraîchement préparé, 100 mM, 25 µL). Ensuite, le mélange a été agité à 750 tr/min pendant 5 min. Les spectres UV-visible ont été acquis sur la gamme 300~1100 nm.

Synthèse des nanobâtonnets d'or

Le processus de synthèse des nanobâtonnets est illustré en Fig. 3a. Pour la synthèse des nanobâtonnets d'or, la croissance semée a été réalisée selon un rapport précédent avec modifications mineures [27]. La solution de croissance a été préparée comme suit. Dans une fiole en verre de 20 mL, l'acide chloroaurique trihydraté (10 mM, 500 µL) et le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) ont été mélangés. La solution était jaune-brun. Ensuite, l'acide ascorbique (fraîchement préparé, 100 mM, 55 µL) a été ajouté, et cette solution a été agitée jusqu'à ce qu'elle passe de jaune-brun à incolore. Le nitrate d'argent (10 mM, 100 µL) a été ajouté et agité pendant 10 s. Cette solution finale a été étiquetée solution de croissance. La solution de semence a été synthétisée comme suit. Dans une fiole en verre de 20 mL, l'acide chloroaurique trihydraté (10 mM, 250 µL) et CTAB (100 mM, 9,75 mL) ont été mélangés. Ensuite, du borohydrure de sodium (10 mM, 600 µL) fraîchement préparé et refroidi à glace a été ajouté et vortexé pendant 2 min. La solution a été étiquetée solution de semence. La solution de semence (12 µL) a été mélangée avec une solution de croissance synthétisée précédemment. Les spectres UV-visible ont été acquis sur la gamme 400~900 nm.

Capsulage au chitosane des nanosphères, nanoétoiles et nanobâtonnets

Le capsulage au chitosane a été employé pour augmenter la stabilité colloïdale et la biocompatibilité des AuNPs. Le chitosane a été dissous dans 1 % d'acide acétique, et la concentration finale ajustée à 0,01 %. Ensuite, la sonication a été réalisée pour dissoudre complètement le chitosane ; cette solution a été utilisée comme solution stock pour le capsulage au chitosane dans la procédure suivante. Les nanosphères et nanoétoiles précédemment synthétisées ont été capsulées avec la solution stock de chitosane (0,01 %). La solution stock de chitosane (30 %, v/v) a été mélangée avec la solution d'AuNPs (70 %, v/v). Le mélange a été agité à 900 tr/min pendant 2 h pour compléter le capsulage au chitosane. Pour les nanobâtonnets, un excès de CTAB a été utilisé, et ainsi, une centrifugation (14 000 tr/min, 15 min, 25 °C) a été réalisée pour éliminer le CTAB. Les nanobâtonnets ont été récupérés du culot, et le capsulage au chitosane a été conduit comme mentionné ci-dessus. Ensuite, les spectres UV-visible ont été acquis.

Évaluation de la stabilité colloïdale

La stabilité colloïdale des AuNPs est importante pour les applications in vitro et in vivo. Les trois types d'AuNPs avec capsulage chitosane et les nanosphères sans capsulage chitosane ont été évalués pour la stabilité colloïdale dans les solutions suivantes : eau déionisée, albumine sérique bovine (BSA) 5 %, NaCl 5 %, PBS (pH 7,4), milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), et milieu complet. Le milieu complet était DMEM contenant 10 % sérum fœtal bovin (FBS). Un millilitre de chaque type de solution d'AuNPs a été mélangé avec la solution de test comme mentionné ci-dessus (0,5 mL). Le mélange a été incubé à 25 °C pendant 30 min, et les spectres UV-visible ont été acquis.

Culture cellulaire et cytotoxicité

Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été achetées auprès de la Korean Cell Line Bank (Séoul, République de Corée) : AGS, HeLa, HepG2 et HT29. Le test MTT a été effectué pour évaluer la cytotoxicité in vitro des AuNPs. Le DMEM contenant pyruvate de sodium a été utilisé. Le milieu de culture cellulaire contenait 10 % sérum fœtal bovin, 2 mM L-glutamine, 1 % pénicilline (100 unités/mL), et streptomycine (100 unités/mL). Les cellules ont été cultivées en boîtes de 100 mm et maintenues à environ 70 % de confluence. Avant la culture cellulaire, les AuNPs de trois formes différentes ont été soumis à évaporation sous vide pour obtenir une concentration finale d'Au de 5 mM. Sur plaques 96 puits, les cellules ont été ensemencées à une densité de 5,0 × 10³ cellules/puits, et l'incubation a été conduite pendant 24 h dans un four à 37 °C sous atmosphère CO₂ (5 %). Ensuite, cinq concentrations différentes d'AuNPs (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62,5 µM et 31,25 µM) ont été traitées et incubées au four pendant 24 h supplémentaires à 37 °C sous atmosphère CO₂ (5 %). Ensuite, le réactif MTT (5 µL, 5 % dans eau déionisée) a été ajouté et incubé dans un four à 37 °C sous atmosphère CO₂ (5 %) pendant 3 h supplémentaires. L'absorbance a été mesurée à 570 nm en utilisant un lecteur multi-détection à fluorescence (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Les cellules non traitées ont été utilisées comme contrôle.

Internalisation cellulaire

L'internalisation cellulaire de chaque type d'AuNP a été mesurée quantitativement en utilisant les cellules HepG2. Sur plaques 24 puits, les cellules ont été ensemencées à une densité de 5,0 × 10⁴ cellules/puits, et l'incubation a été conduite pendant 24 h dans un four à 37 °C sous atmosphère CO₂ (5 %). Ensuite, 5 µM (concentration finale) de chaque type de solution d'AuNP a été traitée et incubée au four pendant 24 h supplémentaires à 37 °C sous atmosphère CO₂ (5 %). Après incubation, la solution contenant l'excès d'AuNPs a été retirée, et les cellules ont été traitées à la trypsine. La concentration d'Au dans les cellules trypsinisées a été mesurée quantitativement par ICP-OES et LA-ICP-MS, ce qui a fourni la concentration d'absorption d'Au dans les cellules. Le contrôle était 5 µM de la solution colloïdale originale de chaque type d'AuNP, qui a aussi été analysée par ICP-OES et LA-ICP-MS pour obtenir la concentration d'Au.

Résultats et discussion

Spectres UV-visible

Les spectres UV-visible sont couramment acquis pour confirmer la synthèse des AuNPs. La SPR caractéristique des AuNPs peut être observée sur la gamme de longueur d'onde visible-proche infrarouge. De plus, le capsulage des AuNPs induit généralement soit un décalage bathochromique (rouge) soit hypsochromique (bleu). Par ailleurs, un décalage hypochromique est généralement induit conjointement avec les décalages rouge et bleu. Comme montré en Fig. 1b, les spectres UV-visible ont été surveillés sur une gamme 300~800 nm. Les nanosphères montraient une SPR caractéristique de 532 nm avec une couleur bourgogne foncée. Après le capsulage au chitosane des nanosphères, le SPR maximal était décalé vers le rouge à 537 nm avec un décalage hypochromique (Fig. 1b). Une large gamme de longueurs d'onde SPR (600~800 nm) avec une solution bleu foncé a été observée pour les nanoétoiles (Fig. 2b). Le capsulage au chitosane des nanoétoiles montrait un décalage hypochromique, où l'absorbance était plus faible que celle des AuNPs sans capsulage (Fig. 2b). Les nanobâtonnets montraient deux longueurs d'onde SPR distinctes de 514 nm et 815 nm, avec la formation d'une solution rose clair (Fig. 3b). Le capsulage au chitosane des nanobâtonnets induisait un décalage bleu à 797 nm avec un décalage hypochromique (Fig. 3b). En considérant tous ces résultats, le capsulage des AuNPs avec chitosane a changé la longueur d'onde SPR et induit des décalages. Un examen attentif des spectres UV-visible a démontré que les trois types d'AuNPs ont été réussis capsulés avec chitosane.

Taille hydrodynamique et potentiels zêta

Ensuite, la taille hydrodynamique et les potentiels zêta ont été mesurés ; les résultats sont montrés dans le Tableau 1. Sans capsulage chitosane, les tailles hydrodynamiques des nanosphères et nanoétoiles étaient 28,4 et 97,8 nm respectivement. La taille hydrodynamique des nanobâtonnets n'a pas été mesurée car elle était bien ajustée aux formes sphériques des nanoparticules. Avec capsulage chitosane, la taille hydrodynamique a augmenté à 190,7 nm pour les nanosphères et à 123,9 nm pour les nanoétoiles. Le capsulage chitosane a été confirmé par une augmentation de la taille hydrodynamique. Le changement de potentiels zêta a aussi reflété le capsulage chitosane sur la surface des AuNPs. Le chitosane est un polysaccharide chargé positivement ; ainsi, le capsulage chitosane a résulté en potentiels zêta positifs pour les trois types d'AuNPs. Pour les nanosphères, le potentiel zêta a été modifié de −12,73 à 42,28 mV. Le potentiel zêta des nanoétoiles a été modifié de −42,46 à 47,44 mV. Dans le cas des nanobâtonnets, le CTAB (un tensioactif cationique) a été utilisé pour la synthèse. Ainsi, le potentiel zêta original était 27,96 mV sans capsulage. Le capsulage au chitosane des nanobâtonnets a augmenté le potentiel zêta à 33,23 mV. Par conséquent, le changement de potentiels zêta de valeurs négatives à positives pour les nanosphères et nanoétoiles indiquait clairement un capsulage réussi avec chitosane. De plus, le potentiel zêta des nanobâtonnets a augmenté, suggérant que la surface a été capsulée avec chitosane.

Images HR-MET

La microscopie est cruciale pour la recherche sur nanoparticules, fournissant des informations essentielles sur la taille et la forme des nanoparticules. Les outils de microscopie délivrent une gamme d'informations détaillées, comme l'état de dispersion, la morphologie et topographie bi- et tri-dimensionnelle, et la relative dureté/tendresse des matériaux. Les nanosphères mesuraient 8,7 ± 1,7 nm, basé sur la moyenne de 75 nanoparticules discrètes sélectionnées aléatoirement en images HR-MET (Fig. 4). La taille la plus abondante était 8~9 nm (29,3 %), suivie de 9~10 nm (12,0 %). Avec capsulage chitosane, la forme des nanosphères était conservée sans aucun changement de forme (Fig. 4c, d). La nature cristalline des particules était clairement indiquée par les structures de réseau montrées en Fig. 4d. La distance entre réseaux voisins a été mesurée à 0,24 nm (Fig. 4d). De plus, la couche de chitosane a aussi été visualisée, comme indiqué par les flèches rouges en Fig. 4d. Les nanoétoiles ont été visualisées par HR-MET, comme montré en Fig. 5. Les nanoétoiles mesuraient 99,0 ± 47,0 nm, représentant la moyenne de 19 nanoparticules discrètes. La structure de réseau est indiquée dans une image agrandie (Fig. 5c). Comme montré, la distance entre réseaux voisins a été mesurée à 0,24 nm (Fig. 5c). Les flèches rouges en Fig. 5c indiquent la couche de chitosane. Les nanobâtonnets ont été visualisés comme montré en Fig. 6. La longueur et largeur moyennes des particules étaient 60,4 nm et 16,4 nm respectivement, selon les mesures faites sur 28 particules. Le rapport d'aspect, défini comme longueur de particule divisée par largeur de particule, était 3,7. La structure de réseau est montrée en Fig. 6c, confirmant la structure cristalline des nanobâtonnets. La distance entre réseaux voisins a été mesurée à 0,23 nm (Fig. 6c). Les flèches rouges indiquent la couche de chitosane (Fig. 6c).

Spectres FT-IR

Le thé vert contient divers métabolites primaires et secondaires. Spécifiquement, les constituants majeurs du thé vert sont les polyphénols, incluant épigallocatéchine-3-gallate, (-)-épicatéchine-3-gallate, (-)-épigallocatéchine, et (-)-épicatéchine [28]. Les spectres FT-IR ont été acquis pour obtenir des informations sur les groupes fonctionnels qui ont contribué à la synthèse des AuNPs. Nous avons comparé le spectre FT-IR des nanosphères avec le spectre de l'extrait (Fig. 7). Le groupe fonctionnel majeur le plus probablement impliqué dans la réaction de réduction des sels d'or était –OH. Dans l'extrait, les groupes fonctionnels –OH apparaissaient à 3255 cm⁻¹ (Fig. 7a). Lors de la synthèse, ce pic a été décalé vers un nombre d'onde plus élevé à 3300~3341 cm⁻¹. Ce résultat démontrait que les groupes fonctionnels –OH originaires des polyphénols étaient oxydés en C=O tout en réduisant les sels d'or en AuNPs. Remarquablement, l'apparition de groupes fonctionnels C=O à 1716 cm⁻¹ dans les nanosphères soutenait clairement l'oxydation des groupes fonctionnels –OH pendant la synthèse (Fig. 7b).

Évaluation de la stabilité colloïdale sous diverses solutions

La stabilité colloïdale des nanoparticules est une préoccupation importante pour les applications diagnostiques et thérapeutiques. Six solutions différentes ont été testées pour la stabilité colloïdale : (i) eau déionisée, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM, et (vi) milieu complet (DMEM avec 10 % FBS). Après mélange de chaque type d'AuNPs avec la solution de test, les spectres UV-visible ont été acquis ; les résultats sont montrés dans le Tableau 2 et Fig. 8. Un décalage hypochromique avec un léger décalage rouge ou bleu a été observé pour les trois types d'AuNPs dans les spectres UV-visible (Fig. 8a, c, e). La forme des spectres était conservée, et aucune agrégation de la solution colloïdale n'était observée (Fig. 8b, d, f). Ce résultat démontrait que la stabilité colloïdale était assez bien conservée dans les solutions de test mentionnées.

Dans le Tableau 2, le décalage hypochromique est exprimé en pourcentage d'absorbance retenue, avec l'absorbance de la solution originale fixée à 100 %. Dans les trois AuNPs, la stabilité colloïdale était la mieux retenue dans le milieu complet, utilisé pour les expériences de cytotoxicité subséquentes : nanosphères (65,3 %), nanoétoiles (93,4 %), et nanobâtonnets (80,2 %). La solution protéique, BSA (5 %), fournissait aussi une stabilité colloïdale raisonnable : nanosphères (61,8 %), nanoétoiles (70,2 %), et nanobâtonnets (72,0 %). Ces résultats indiquaient que les protéines qui recouvrent les nanoparticules ont d'autres effets bénéfiques sur la stabilité colloïdale des AuNPs ensemble avec le capsulage chitosane. La stabilité colloïdale des nanosphères sans capsulage chitosane a aussi été évaluée (Fig. 8g, h). Toutes les solutions induisaient un décalage hypochromique. Parmi les solutions testées, seule la solution NaCl (5 %) montrait un grand décalage rouge avec un décalage hypochromique.

Cytotoxicité

Un essai MTT a été effectué pour mesurer la cytotoxicité contre quatre types de cellules cancéreuses (Fig. 9) : AGS, HeLa, HepG2 et HT29. La cytotoxicité des trois types d'AuNPs était dépendante de la concentration d'Au. Parmi les quatre types de cellules, la cytotoxicité la plus élevée était observée pour les cellules HepG2. De plus, les nanobâtonnets montraient la toxicité la plus élevée contre les quatre types de cellules, suivis des nanoétoiles et enfin des nanosphères. Spécifiquement, les nanobâtonnets montraient une toxicité très élevée ; ainsi, la cytotoxicité des nanobâtonnets contenant une faible gamme de concentrations d'Au a aussi été évaluée (Fig. 9e). À des concentrations aussi basses que 8 µM Au, les nanobâtonnets montraient une cytotoxicité dépendante de la concentration. Contre les cellules HepG2, la valeur IC₅₀ était 127,1 µM Au pour les nanosphères, 81,8 µM Au pour les nanoétoiles, et 22,7 µM Au pour les nanobâtonnets. Ainsi, les nanobâtonnets étaient les plus cytotoxiques, suivis des nanoétoiles, et les nanosphères les moins cytotoxiques contre les cellules HepG2.

Il a été rapporté que la cytotoxicité des AuNPs est affectée par la taille, la forme et la charge de surface [29, 30]. Favi et collaborateurs ont investigué la cytotoxicité de nanosphères d'Au (61 nm) et nanoétoiles d'Au (34 nm) contre deux types de cellules (fibroblastes cutanés humains et cellules endothéliales de coussin adipeux de rat) [31]. Dans les deux types de cellules, une concentration létale était observée à 40 µg/mL pour les nanosphères et à 400 µg/mL pour les nanoétoiles. Leurs résultats suggéraient que les nanosphères étaient plus cytotoxiques que les nanoétoiles, suggérant que la taille, la forme et la chimie de surface sont très probablement influentes sur la cytotoxicité des AuNPs. Woźniak et collaborateurs ont rapporté la cytotoxicité d'AuNPs avec formes diverses contre HeLa et HEK293T (cellules rénales embryonnaires humaines), à savoir nanosphères (~10 nm), nano-fleurs (~370 nm), nanobâtonnets (~41 nm), nano-prismes (~160 nm), et nanoétoiles (~240 nm) [30]. Intéressant, les nanosphères et nanobâtonnets étaient plus cytotoxiques que nano-fleurs, nano-prismes et nanoétoiles. Les auteurs expliquaient que la petite taille des nanoparticules et le processus d'agrégation étaient les principales forces motrices pour la cytotoxicité des nanosphères et nanobâtonnets dans leur travail. En effet, de nombreuses études ont abordé l'effet de taille des AuNPs sur la cytotoxicité [32, 33]. À mesure que les AuNPs deviennent plus petites, leur absorption par les cellules augmente. Cette absorption plus élevée résulte en une concentration plus élevée d'AuNPs dans la cellule, ce qui mène à une cytotoxicité plus élevée contre les cellules. Cependant, une faible concentration d'AuNPs dans la cellule montre aussi une cytotoxicité élevée [34]. La concentration d'AuNPs dans la cellule affecte la cytotoxicité ; cependant, il est vital de considérer et comprendre les caractéristiques des AuNPs. La cytotoxicité d'AuNPs de deux formes différentes (nanosphères 43 nm, nanobâtonnets 38 × 17 nm) a été évaluée dans des cellules épithéliales par Tarantola et collaborateurs [35]. Les nanosphères étaient déterminées comme plus cytotoxiques que les nanobâtonnets. De plus, les nanosphères induisaient un dysfonctionnement des membranes cellulaires épithéliales, mesuré par détection d'impédance de substrat cellulaire électrique [35]. Comme discuté précédemment, de nombreuses études investiguent actuellement la cytotoxicité de différentes formes d'AuNPs dans diverses cellules. Bien que les formes des AuNPs puissent rester les mêmes, de nombreux facteurs affectent encore la cytotoxicité des AuNPs. Lors de l'évaluation de la cytotoxicité, des facteurs incluant taille, forme, propriétés physico-chimiques de surface, concentration, temps d'exposition et type de cellule devraient aussi être considérés [34, 36,37,38]. En plus des caractéristiques des AuNPs, les mécanismes cytotoxiques incluant disruption de la membrane cellulaire, stress oxydatif, destruction du cytosquelette, et perte de fonction mitochondriale sont aussi importants [38, 39]. Actuellement, l'autophagie et le dysfonctionnement lysosomial émergent comme explications de la cytotoxicité des nanomatériaux [40]. Dans les lysosomes, les nanomatériaux induisent la cytotoxicité par stress oxydatif médié par fer lysosomal et libération de cathepsines et autres hydrolases lysosomiales associées, ce qui cause dysfonction mitochondriale et mort cellulaire. Dans le rapport actuel, les nanobâtonnets étaient les plus cytotoxiques contre les quatre types de cellules cancéreuses testées. Ainsi, notre futur travail examinera les mécanismes détaillés de cytotoxicité.

Internalisation cellulaire sur cellules HepG2

Les cellules HepG2 montraient la cytotoxicité la plus élevée parmi les quatre types de cellules cancéreuses ; par conséquent, nous avons sélectionné ce type de cellule pour évaluer l'internalisation cellulaire. Deux instruments, ICP-OES et LA-ICP-MS, ont été utilisés pour analyser quantitativement la concentration d'Au dans les cellules, et les résultats sont montrés en Fig. 10. Une concentration d'Au de 5 µM a été utilisée pour évaluer l'internalisation cellulaire car aucune toxicité n'était observée à cette concentration parmi les quatre types de cellules cancéreuses. L'absorption était la plus élevée pour les nanosphères (58,0 %), suivie des nanobâtonnets (52,7 %) et nanoétoiles (41,5 %). Comme indiqué dans la section précédente, la cytotoxicité était dépendante de la forme des particules (nanobâtonnets > nanoétoiles > nanosphères). Cependant, l'ordre d'internalisation cellulaire (nanosphères > nanobâtonnets > nanoétoiles) ne correspondait pas à l'ordre de cytotoxicité. L'internalisation cellulaire des nanosphères était la plus élevée ; cependant, la cytotoxicité de ces particules était la plus faible. Ces résultats suggèrent qu'une absorption cellulaire élevée n'induit pas toujours une cytotoxicité élevée. Comme mentionné précédemment, divers facteurs incluant taille, forme, propriétés physico-chimiques de surface, concentration, temps d'exposition et type de cellule sont importants pour influencer la cytotoxicité.

Les différents degrés d'absorption des trois types d'AuNPs (41,5~58,0 %) dépendent possiblement de la compétition entre l'enveloppement (c.-à-d., comment une membrane enclôt une nanoparticule) sous une force thermodynamique motrice et la cinétique de diffusion des récepteurs [41, 42]. Chithrani et Chan ont comparé l'internalisation cellulaire d'Au nanosphères et Au nanobâtonnets enrobés de transferrine par cellules HeLa [42]. À la même taille (c.-à-d., même valeur pour le diamètre de nanosphère et largeur de nanobâtonnet), les nanosphères montraient une absorption plus élevée que les nanobâtonnets. Ce résultat est cohérent avec nos observations dans le rapport actuel d'une absorption plus élevée des nanosphères comparée aux nanobâtonnets. Pour l'absorption des nanobâtonnets, la largeur est plus importante que la longueur, et un rapport d'aspect croissant diminue le taux d'absorption [42]. La taille des nanoétoiles était 99,0 ± 47,0 nm, les rendant les plus grosses particules parmi les trois types d'AuNPs. Pour les grosses nanoparticules (> 50 nm), une cinétique de diffusion des récepteurs lente mène à des temps d'enveloppement courts [42]. Ainsi, l'internalisation cellulaire des grosses nanoparticules est faible, c.-à-d., nanoétoiles dans le rapport actuel. Le chitosane a été utilisé pour capsuler les AuNPs pour augmenter leur stabilité colloïdale et biocompatibilité. Le capsulage chitosane peut aussi jouer un rôle dans l'internalisation cellulaire des AuNPs en interagissant avec les récepteurs à la surface cellulaire. Une étude mécanistique détaillée est nécessaire pour élucider cette question.

Conclusion

Le développement continu de la nanotechnologie requiert des conceptions élaborées de forme et taille de nanoparticules pour des applications réussies, incluant comme véhicules de délivrance de médicaments ou vecteurs pour composés biologiquement actifs tels qu'agents anticancéreux. L'extrait de thé vert a été utilisé comme agent réducteur vert pour la synthèse de nanosphères et nanoétoiles d'Au. Intéressant, la cytotoxicité des nanobâtonnets était plus élevée que celle des nanosphères et nanoétoiles, tandis que les nanosphères montraient la cytotoxicité la plus faible contre quatre types de cellules cancéreuses. L'internalisation cellulaire par cellules HepG2 était très probablement dépendante de la forme et taille ; les nanosphères montraient l'absorption la plus élevée par les cellules, tandis que les nanoétoiles montraient la plus faible. L'optimisation de la taille et forme ensemble avec la modification de surface et fonctionnalisation mènera au développement de nanoparticules pour utilisation future en nanomédecine.

Abréviations

AFM :

Microscopie à force atomique

AgNPs :

Nanoparticules d'argent

AGS :

Cellules d'adénocarcinome gastrique humain

AuNPs :

Nanoparticules d'or

CTAB :

Bromure de cétyltriméthylammonium

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

FBS :

Sérum fœtal bovin

FT-IR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HeLa :

Cellules d'adénocarcinome épithélial du col utérin humain

HepG2 :

Cellules de carcinome hépatocellulaire humain

HR-MET :

Microscopie électronique en transmission à haute résolution

HT29 :

Cellules d'adénocarcinome colorectal humain

ICP-OES :

Spectroscopie d'émission optique à plasma couplé par induction

LA-ICP-MS :

Spectrométrie de masse à plasma couplé par induction par ablation laser

MEB :

Microscopie électronique à balayage

SPR :

Résonance plasmonique de surface