Optimisation de la cytométrie de flux en imagerie pour quantifier la cinétique et la spécificité de l'internalisation des vésicules extracellulaires HEK293T

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des vésicules nanosize à bicouche lipidique sécrétées naturellement par la plupart des types cellulaires comme mécanisme de communication pour délivrer des protéines, des lipides et du matériel génétique. Malgré le potentiel thérapeutique des VE, il existe peu d'informations sur la cinétique et la spécificité de leur absorption. Ici, les auteurs ont optimisé une plateforme basée sur la cytométrie de flux en imagerie (CFI) pour évaluer quantitativement les effets de la dose, du temps et de la spécificité des cellules réceptrices sur l'internalisation des VE de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293T) de manière hautement débitante. Ils ont trouvé que l'absorption des VE HEK293T est un processus actif qui est dépendant de la dose et du temps. De plus, la sélectivité de l'absorption des VE a été quantifiée in vitro, et ils ont trouvé que les VE HEK293T étaient internalisées en plus grandes quantités par des cellules de la même origine. Enfin, les cellules souches neurales ont internalisé significativement plus de VE HEK293T par rapport aux neurones matures, suggérant que les cellules souches ou progénitrices, qui sont plus métaboliquement actives que les cellules terminellement différenciées, peuvent avoir des taux plus élevés d'internalisation active des VE. La caractérisation de l'absorption des VE, notamment la spécificité, la dépendance à la dose et au temps, et les essais cinétiques aideront à informer et développer des thérapeutiques basées sur les VE ciblées et efficaces.

Introduction

La recherche sur les vésicules extracellulaires est un domaine en plein essor en raison de l'utilité thérapeutique et diagnostique des vésicules extracellulaires (VE) naturelles et modifiées. Les VE varient de 50 à 1000 nm de diamètre, sont produites par tous les types cellulaires, et sont enrichies en protéines transmembranaires, notamment CD63, CD81 et CD9 ; lipides ; protéines ; et ADN, ARN, ARNm et microARN [1-5]. Le contenu des VE, notamment l'ARNm et le miARN actifs, a été impliqué dans la modulation des cellules réceptrices via la traduction de novo et la régulation post-traductionnelle des cellules cibles [4, 6]. Comprendre et ensuite modifier l'absorption cinétique et l'internalisation des VE mènera éventuellement à une livraison optimisée du contenu des VE aux cellules cibles avec des concentrations suffisamment élevées pour avoir un bénéfice thérapeutique.

Autrefois considérées comme « les déchets des cellules », les VE ont été exploitées comme alternative aux thérapies cellulaires en raison de nombreux avantages, notamment leur biocompatibilité, leur faible immunogénicité et toxicité, la possibilité de doses répétées, diverses voies d'administration, et le potentiel de délivrer des médicaments et des thérapies géniques [3]. Notre groupe a précédemment rapporté des effets positifs des VE dérivés de cellules souches neurales dans l'accident vasculaire cérébral et les traumatismes crâniens. Dans les modèles murins et porcins d'accident vasculaire cérébral, les VE ont amélioré la récupération tissulaire et fonctionnelle post-AVC [3, 7, 8]. Nous avons également montré que les VE sont neuroprotectrices avec des bénéfices fonctionnels dans un modèle de traumatisme crânien chez le rongeur [9]. Malgré ces effets observés et le potentiel futur des VE, il y a peu de compréhension de la spécificité et de la cinétique d'absorption des VE, ce qui peut entraver la translation des thérapeutiques basées sur les VE en clinique.

Les VE ont également été conçues comme vecteurs de transfert et chargées avec des agents thérapeutiques, y compris des thérapies géniques et des composés chimiques, comme alternative aux thérapeutiques et vecteurs de délivrance nanoparticulaires synthétiques [4, 10-12]. Les cellules HEK293T ont été largement utilisées comme cellules productrices de VE en raison de leur prolifération rapide inhérente, de leur rendement élevé en VE et de leur facilité de manipulation génétique [13-17]. Les VE HEK293T ont délivré des thérapies géniques, y compris des thérapeutiques miARN pour le cancer du sein [12] et ont été utilisées pour délivrer des chimiothérapeutiques et des constructions de protéines thérapeutiques dans un modèle de schwannome [18]. Similaire aux études sur les nanoparticules synthétiques évaluant la cytotoxicité in vitro, les tests de toxicité MTT ont affiché une faible toxicité des VE HEK293T non chargées et une cytotoxicité élevée subséquente lorsqu'elles sont chargées avec des chimiothérapeutiques [10, 18-21]. En raison de cette utilisation abondante des VE HEK293T, nous avons analysé leur cinétique et leur spécificité dans cette étude.

L'absorption sélective ou spécifique fait référence à la capacité naturelle d'une VE à cibler des types cellulaires spécifiques. Il existe de nombreuses preuves sur les mécanismes d'internalisation des VE avec peu de consensus sur la spécificité d'absorption [22]. Souvent, les VE présentent une absorption sélective par des cellules réceptrices similaires à leurs cellules parentes, les cellules épithéliales internalisent plus de VE dérivées de cellules épithéliales que d'autres cellules réceptrices [23, 24], et les cellules souches mésenchymateuses (CSM) internalisent une quantité significativement plus grande de VE dérivées de CSM comparées à d'autres lignées cellulaires in vitro [24]. Cependant, d'autres études ont trouvé que les VE sont internalisées par tous les types cellulaires et affichent une biodistribution non sélective lorsqu'elles sont administrées in vivo [22, 25]. Malgré le potentiel thérapeutique immense et l'intérêt pour les VE, il y a un manque de compréhension de la spécificité d'absorption des VE. En comprenant mieux la spécificité d'absorption des VE, nous pouvons choisir appropriément les cellules productrices de VE qui sont sélectivement internalisées par les cellules réceptrices d'intérêt et ainsi améliorer l'applicabilité thérapeutique des VE.

Une raison potentielle des résultats contradictoires sur l'absorption des VE est le manque de standardisation dans les plateformes de mesure, y compris les analyses des effets de dose et de temps. Récemment, un groupe d'experts de la Société Internationale pour les Vésicules Extracellulaires (ISEV) a publié un document de position soulignant la nécessité d'analyser la dose et le temps, parmi d'autres facteurs confondants sur l'absorption des VE [26]. Le groupe a déclaré que « une dose ne convient pas à tous » et que la dose peut affecter l'absorption ou la sélectivité des VE [26]. L'augmentation des doses de VE HEK293T modifie le patron de biodistribution in vivo [27]. Les profils d'absorption des VE dérivées du sérum étaient significativement altérés par la dose [28]. De plus, les temps de co-incubation des VE avec les cellules réceptrices variant de 15 min à 48 h [24, 29-33] peuvent altérer les mesures d'absorption. Si adoptés par les chercheurs et l'industrie des VE, un processus quantifiable et fiable pour déterminer des courbes de dose et de temps standard afin d'identifier la dose minimale efficace pourrait mener à des études plus robustes et utiles.

Auparavant, les chercheurs ont utilisé la cytométrie de flux standard ainsi que diverses formes de microscopie à faible débit, y compris la microscopie confocale, pour analyser l'absorption des VE [32-34]. Cependant, ces technologies ont plusieurs limitations. La microscopie confocale peut être chronophage et subjective. Les cytomètres de flux traditionnels ont été conçus pour mesurer des particules biologiques dans la gamme cellulaire, ne peuvent pas différencier l'essaim ou la coïncidence de VE, et ont un bruit accru en raison du déclenchement [35-38]. Comme mentionné par le groupe ISEV, il y a une prise de conscience croissante des limitations physiques de la cytométrie de flux traditionnelle et la demande pour une cytométrie de flux spécialisée avec des limites de détection dans la gamme de 100 nm est mise en évidence [26, 38]. La cytométrie de flux en imagerie (CFI) combine la nature quantitative à haut débit de la cytométrie de flux avec la technologie d'imagerie par fluorescence qui peut résoudre des particules fluorescentes intrinsèquement petites, jusqu'à 100 nm de diamètre [38]. Les capacités de la CFI mènent à un faible bruit/fond, une diminution de l'essaimage, et des dispositifs à couplage de charge pour la clarté de l'image [37, 39]. Ces caractéristiques aident à développer une stratégie de gating pour caractériser les VE et leur absorption avec confirmation visuelle de manière hautement débitante comme une plateforme d'absorption des VE précise et quantifiable [36, 37, 40].

Dans cette étude, des cellules HEK293T exprimant CD63-eGFP ont été utilisées comme lignée cellulaire donneuse pour la production de VE en raison de leur utilisation courante dans le développement thérapeutique. Les VE fluorescents isolés ont été mis en co-culture avec des lignées cellulaires réceptrices, y compris des cellules neurales et endothéliales. L'absorption a été quantifiée en utilisant la CFI, résultant en une plateforme standardisée pour mesurer les caractéristiques importantes de l'absorption cinétique et de l'internalisation des VE pour les systèmes cellulaires in vitro. De plus, nous fournissons des données sur un processus pour quantifier l'absorption de VE fluorescents dans des conditions différentes et des lignées cellulaires cultivées pour élucider l'absorption sélective des VE.

Matériaux et méthodes

Culture cellulaire

Les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293T) ont été achetées auprès de l'ATCC et cultivées dans du DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Les cellules souches neurales humaines (hNSC), les cellules neurales SH-SY5Y, les cellules épithéliales hépatiques C3A, les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) et les neurones ont tous été cultivés dans des conditions standard à 37 °C, 5 % CO₂ avant les essais d'absorption des VE.

Marquage et isolation des VE

L'ADN plasmidique CD63-eGFP a été obtenu d'Addgene (#62964). Le CD63-pEGFP C2 était un don de Paul Luzio (plasmide Addgene #62964). Les cellules HEK293T ont été cultivées jusqu'à 70 % de confluence dans des boîtes de 10 cm, et 10 μg d'ADN plasmidique ont été transféctés en utilisant Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant. Vingt-quatre heures après la transfection, les milieux ont été changés pour des milieux HEK293T standards dépourvus de sérum fœtal bovin et collectés pendant 3 jours consécutifs. Comme décrit précédemment [3], les milieux HEK293T ont été filtrés à travers un filtre de 0,22 μm et enrichis par ultrafiltration en utilisant des unités de filtration centrifuge à cellulose régénérée 100 kDa Amicon et lavés deux fois avec PBS++. Les VE ont été concentrées à 1 mL, et la concentration et les distributions de taille ont été mesurées sur Nanosight NS300 selon le protocole du fabricant (Malvern, Royaume-Uni). Les VE ont été isolées à partir de différents vaisseaux de culture HEK293T, chaque vaisseau considéré comme des réplicats biologiques séparés, avec trois réplicats techniques dans chaque réplicat biologique (minimum de neuf échantillons au total pour chaque condition).

Essais d'absorption

Les lignées cellulaires réceptrices ont été ensemencées à 60 % de confluence dans une plaque à 6 puits pendant 24 h sous des conditions de culture standard à 37 °C. Les milieux standards ont été changés pour des milieux sans sérum fœtal bovin (FBS−) avant la co-culture avec les VE. Les VE marquées à la protéine fluorescente verte (GFP) ont été administrées aux cellules à des doses et des points de temps variables. Après la co-culture, les cellules ont été resuspendues dans 5 % de trypsine et concentrées à environ un million de cellules par 50 μL pour la cytométrie de flux. Trente-sept degrés Celsius est la norme pour les expériences d'absorption des VE dans nos essais car c'est la norme utilisée pour la culture cellulaire et les plateformes d'absorption des VE in vitro [31, 41-44].

Essais inhibiteurs

Essai à froid

Les VE ont été mises en co-culture avec les cellules réceptrices à 4 °C pour « mettre en pause » efficacement la croissance de la culture cellulaire et inhiber les processus actifs [45]. Quatre degrés Celsius inhibent toutes les formes actives d'absorption des VE [31, 41-44].

Essai fixé

Les cellules réceptrices ont été fixées dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 30 min sur glace et lavées avec PBS immédiatement avant la co-culture avec les VE pour inhiber toutes les formes actives d'absorption des VE.

Acquisition ImageStreamX

L'acquisition a été réalisée sur le cytomètre de flux en imagerie ImageStreamX Mark II (Luminex Corporation, Seattle, Washington) en utilisant le logiciel INSPIRE. Un minimum de 5000 à 10 000 événements cellulaires ont été acquis. Chaque échantillon biologique a été répliqué dans trois puits de réplicats techniques et acquis individuellement sur l'ISx. Les images en champ clair ont été collectées sur le canal un et la diffusion latérale (785 nm) sur le canal six. La protéine fluorescente verte (GFP) a été excitée par un laser argon 488 nm à 200 mW, et la fluorescence a été collectée sur le canal deux (480-560 nm). Un grossissement de 60× a été utilisé sur chaque échantillon avec un taux d'acquisition faible pour une haute sensibilité.

Analyse IDEAS

Les analyses de données et d'images ont été effectuées en utilisant le logiciel IDEAS (Luminex). La stratégie de gating est la suivante :

1. La porte de focalisation a été déterminée pour éliminer les cellules qui n'étaient pas dans le champ de focalisation en utilisant la valeur RMS du gradient.

2. Les cellules focalisées ont été gâtées pour éliminer les doublets et les débris en utilisant la surface en champ clair vs le rapport d'aspect en champ clair. Les données gâtées ont été utilisées pour créer des histogrammes et générer des références statistiques mesurant l'intensité de fluorescence (somme de tous les pixels dans une image), l'intensité maximale de pixel (intensité des pixels les plus brillants dans une image), ainsi que les valeurs de comptage de taches via des algorithmes internes pour chaque échantillon. Les caractéristiques de comptage de taches ont été générées en utilisant les assistants IDEAS applicables. Le comptage de taches, l'intensité moyenne et le rapport de pixel maximal sont calculés par la formule (Valeur de sortie avec VE / Valeur de sortie sans VE).

Statistiques

Toutes les données quantitatives ont été analysées via GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, Californie) et réalisées en triplicats. Les données sont présentées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). La signification statistique a été déterminée en utilisant un test T non apparié ou une analyse de variance (ANOVA) à un facteur avec le test post hoc de Tukey ou de Dunnett comparé aux contrôles lorsque approprié. p < 0,05 était considéré comme significatif.

Résultats

Propriétés des vésicules extracellulaires HEK293T marquées CD63-eGFP

Pour générer des VE marquées fluorescentement pour analyser la cinétique et l'absorption des vésicules extracellulaires, les cellules HEK293T ont été transféctées avec un plasmide portant la protéine de fusion CD63-eGFP. CD63 est une protéine tétracycline communément enrichie dans la membrane des exosomes, la rendant une cible optimale pour le marquage fluorescent des VE [46, 47]. Les milieux usagés ont été collectés à partir de la culture de cellules HEK293T, et les VE ont été isolées comme rapporté précédemment [8]. Nous avons comparé la taille et la distribution des VE isolées à partir de cellules HEK293T transféctées CD63-eGFP à des cellules HEK293T non transféctées. Les VE témoins et CD63-eGFP-transféctées HEK293T affichaient un diamètre médian moyen de 110,28 nm et 103,616 nm, respectivement, mesurés par le logiciel de nanotracking (Figure 1a), ce qui est cohérent avec la taille rapportée des VE HEK293T [13, 15, 27, 48]. Aucune différence significative dans le diamètre médian (p = 0,1615) et la distribution (p = 0,4225) des VE isolées à partir de cellules HEK293T non transféctées et CD63-eGFP-transféctées n'a été observée. Le marquage eGFP n'a pas altéré la taille des VE HEK293T (Figure 1b).

L'essai CFI a été réalisé pour déterminer si le CD63-eGFP était associé aux VE. Comme contrôle fluorescent négatif, des billes de 1,34 μM en solution tampon (Figure 1c, haut) manquaient de fluorescence lorsqu'exposées à la longueur d'onde d'excitation 488 nm, mais étaient visibles en champ clair (BF) et diffusion latérale (SSC). Les VE HEK293T non marquées étaient négatives en BF, GFP et SSC, suggérant une taille petite en dessous du seuil BF et l'absence de fluorescence (Figure 1d, milieu). L'absence en BF signifie une taille de VE inférieure à 300 nm, ce qui suggère un essaimage minimal des VE. Enfin, les VE marquées CD63-eGFP sont négatives en BF et positives dans le canal GFP signifiant la fluorescence positive des VE HEK293T (Figure 1c, bas). Le signal positif dans le canal GFP peut être indicatif d'une seule VE ou d'un groupe de VE fluorescents. Collectivement, ces résultats montrent que les VE HEK293T isolées ont une taille standard et des profils de marqueurs protéiques cohérents avec les rapports précédents d'exosomes HEK293T, et le marquage eGFP n'altère pas la taille des VE HEK293T [5, 27].

En utilisant une méthode commerciale basée sur la cytométrie de flux pour mesurer les marqueurs communs des VE, nous avons déterminé le profil global des tétracyclines des VE [5]. Les VE HEK293T isolées à partir de cellules témoins et HEK293T exprimant CD63-eGFP étaient positives pour les marqueurs standards des VE, y compris CD9, CD63 et CD81 mesurés en unités de fluorescence relative (Figure 1d). Comme rapporté précédemment, CD29 a également été trouvé à la surface des VE HEK293T et VE HEK293T transféctées CD63-eGFP [5]. Ces résultats indiquent que les méthodes d'isolation et de marquage pour les VE HEK293T aboutissent à des VE avec des marqueurs d'exosomes HEK293T communs.

Absorption active des VE HEK293T

Deux essais d'internalisation inhibitrice ont été réalisés. Les VE HEK293T ont été mises en co-culture avec les cellules réceptrices à 4 °C (froid) ou avec des cellules réceptrices préalablement fixées au paraformaldéhyde (fixé). Les traitements ont diminué la présence de VE marquées eGFP dans les cellules réceptrices comparées aux cellules réceptrices mises en co-culture avec les VE sous conditions physiologiques (Figure 2a). Les essais inhibiteurs à froid et fixés ont réduit le comptage de taches (froid : p = 0,0127, fixé : p = 0,0078), l'intensité (froid : p = 0,0105, fixé : p = 0,0374) et le pixel maximal (froid : p = 0,0159, fixé : p = 0,0149) des signaux de fluorescence dans les cellules réceptrices sans traitements, indiquant l'inhibition de l'absorption des VE. Ces résultats infèrent que la localisation eGFP et les augmentations des paramètres de sortie signifient que les VE HEK293T sont internalisées pour les essais d'absorption suivants.

Absorption des VE HEK293T dépendante de la dose

Pour développer une courbe de dose standard pour la plateforme CFI, les VE HEK293T ont été mises en co-culture avec des cellules réceptrices HEK293T à des doses croissantes variant de 0 à 20 000 VE par cellule à 37 °C. Les images CFI représentatives présentaient une augmentation visuelle de la fluorescence eGFP avec des doses élevées de VE (Figure 3a). Le nombre le plus bas de VE pouvant être détecté était de 6000 VE par cellule HEK293T co-cultivée. À ce niveau, le comptage de taches (p = 0,0012), l'intensité (p = 0,0075) et le pixel maximal (p = 0,0005) étaient significativement plus grands que les cellules réceptrices sans VE (Figure 3b-d). Par conséquent, des doses de 6000 VE HEK293T sont le seuil bas pour l'absorption dans nos conditions expérimentales. De même, des doses de 10 000 et 20 000 VE avaient un comptage de taches plus élevé (10 000 : p = 0,0009 ; 20 000 : p < 0,0001), intensité (10 000 : p < 0,0001 ; 20 000 : p < 0,0001) et pixel maximal (10 000 : p < 0,0001 ; 20 000 : p < 0,0001) comparées aux cellules sans VE. En comparant entre les doses plus élevées, il n'y a pas de différences significatives dans le comptage de taches (6000 vs 10 000 : p = 0,999, 10 000 vs 20 000 : p = 0,0927), intensité (6000 vs 10 000 : p = 0,8482, 10 000 vs 20 000 : p = 0,999) et comptage de pixel maximal (6000 vs 10 000 : p = 0,6056, 10 000 vs 20 000 : p = 0,5281) entre 6000 et 10 000, ainsi qu'entre 10 000 et 20 000. De même, en comparant entre 6000 et 20 000, il n'y a pas de différence statistique dans le comptage de taches (p = 0,0787) et l'intensité (p = 0,8083). Il y a une différence significative en pixel maximal entre 6000 et 20 000 (p = 0,0140). Globalement, la courbe de rendement affiche une dépendance significative à la dose dans tous les paramètres (tache, intensité, pixel maximal, p < 0,0001). Ces résultats indiquent que l'absorption des VE HEK293T est dépendante de la dose avec un seuil minimum de 6000 VE HEK293T par cellule.

Absorption temporelle des VE HEK293T

En utilisant 6000 VE par cellule, les VE HEK293T ont été mises en co-culture avec des cellules HEK293T pour des durées croissantes avant CFI, variant de 5 min à 24 h. La durée d'exposition aux VE a joué un rôle clé dans la quantité de fluorescence visible dans les cellules réceptrices, déclinant après 12 h (Figure 4a). Initialement, 30 min de co-culture affichaient une augmentation significative du comptage de taches (p = 0,0081) suggérant une tendance possible vers l'absorption des VE, mais pas dans les autres paramètres d'absorption (intensité : p = 0,3073, pixel maximal : p = 0,0952) (Figure 4b-d). À 2 h de co-culture, un comptage de taches (p = 0,0028), une intensité (p = 0,0420) et un pixel maximal (p = 0,0006) significativement plus élevés étaient enregistrés comparés aux cellules réceptrices sans VE. À nouveau, à 4 h de co-culture, tous les paramètres étaient supérieurs aux témoins (comptage de taches : p = 0,0003, intensité : p < 0,0001, pixel maximal : p < 0,0001). L'intensité et le pixel maximal continuaient d'être plus élevés que les témoins à 4, 12 et 24 h de co-culture. Il n'y avait pas de différences dans les paramètres d'absorption entre 4 et 12 h de co-culture (tache : p = 0,999, intensité : p = 0,5797 ; pixel maximal : p = 0,2489). Cependant, l'intensité (p = 0,0191) et le pixel maximal (p = 0,0027) ont diminué entre 12 et 24 h de co-culture (Figure 4c, d). Similaire à la courbe de dose, l'absorption des VE HEK293T est dépendante du temps avec une absorption constante à 4 h d'incubation et un pic à 12 h. Collectivement, une dose de 6000 VE par cellule ensemencée et une co-culture de 4 h ont été standardisées pour les essais d'absorption suivants.

Absorption comparative des VE HEK293T par plusieurs lignées cellulaires

L'hypothèse que l'absorption des VE est un processus sélectif où les VE sont préférentiellement absorbées par des cellules de leur propre origine a été testée en utilisant la CFI. Les VE HEK293T ont été mises en co-culture avec des cellules HEK293T ou d'autres lignées cellulaires : épithéliales (cellules hépatiques C3A), endothéliales (cellules endothéliales de veine ombilicale humaine), et neurales (cellules glioblastome SH-SY5Y). La fluorescence eGFP est plus abondante dans les cellules HEK293T comparée aux autres types cellulaires (Figure 5a). Comparées aux C3A et HUVEC, les cellules HEK293T avaient une intensité de fluorescence significativement plus élevée (C3A : p = 0,0321 ; HUVEC : p = 0,0055) (Figure 5c), lorsqu'elles étaient mises en co-culture avec des VE HEK293T. De plus, les cellules HEK293T avaient un pixel maximal plus élevé (C3A : p = 0,0221 ; HUVEC : p = 0,0079 ; SH-SY5Y : p = 0,0486) (Figure 5d) comparé à toutes les autres lignées cellulaires réceptrices (Figure 5b). Concernant l'intensité, les cellules SH-SY5Y étaient significativement plus élevées que les HUVEC lorsqu'elles étaient mises en co-culture avec des VE HEK293T (p = 0,0304). Ces résultats soutiennent l'absorption sélective des VE HEK293T par les cellules HEK293T comparées aux autres lignées cellulaires in vitro.

Statut de différenciation des cellules neurales et internalisation des VE HEK293T

Puisque les VE ont été impliquées à des fins thérapeutiques et de délivrance ciblant les maladies neurales, des cellules souches neurales humaines (hNSC) et des neurones humains matures ont été utilisées comme lignées cellulaires réceptrices dans notre système pour examiner si le statut de différenciation de la cellule réceptrice joue un rôle dans l'absorption sélective des VE. Les images représentatives de la CFI affichaient des preuves visuelles d'absorption dans les deux types cellulaires, mais avec la plus grande localisation eGFP dans les hNSC (Figure 6a). Les hNSC mises en co-culture avec des VE HEK293T ont un comptage de taches plus élevé (p = 0,0082) et un pixel maximal (p = 0,0083) comparés aux neurones matures. Ensemble, ces résultats suggèrent que le statut de différenciation des cellules neurales affecte l'absorption des VE HEK293T.

Discussion

Processus de standardisation de l'absorption des VE in vitro

Un groupe d'experts internationaux sur les VE a souligné la nécessité de déterminer efficacement la dose minimale efficace des VE pour les essais d'absorption, et ici nous avons développé un système qui peut être efficacement adopté par le domaine [26]. Il y a des défis lors de l'analyse de l'absorption des VE. Par exemple, comme nous et d'autres l'avons observé, les résultats peuvent différer si la dose de VE et le temps d'exposition sont modifiés [26]. Nous avons abordé la dose et la concentration des VE HEK293T comme variable cinétique. De plus, une dose minimale efficace in vitro peut prédire plus uniformément la biodistribution in vivo des VE et être utilisée pour développer des paramètres de dosage in vivo plus cohérents pour les thérapeutiques et la délivrance basées sur les VE. Dans une étude de biodistribution in vivo de VE chez la souris, l'augmentation de la dose de VE HEK293T a entraîné un changement de la distribution relative des VE dans les organes [27]. Similaire aux résultats d'une étude in vitro antérieure utilisant des VE de cancer de la vessie [39], les VE HEK293T ont affiché une forte dépendance à la dose avec une dose minimale efficace à 6000 VE dans notre étude. Nous sommes les premiers à utiliser les particules par cellule comme mesure de dose sensible in vitro, ce qui corrèle mieux avec les modèles in vivo utilisant des particules par poids corporel. Nos données indiquent également une limite de saturation de dose après 6000 VE, informant potentiellement de futures études de dosage in vivo en indiquant que des doses plus élevées peuvent avoir des bénéfices limités.

Une autre variable confondante de la mesure de l'absorption des VE est les effets temporels potentiels sur l'absorption des VE. Dans notre système, nous avons trouvé une forte dépendance au temps avec une absorption dès 2 h avec une diminution potentielle entre 12 et 24 h. Similaire à nos résultats, la dépendance au temps a été rapportée dans quelques études utilisant des cellules de cancer de la vessie, des cellules tumorales et d'autres avec une absorption dès 15 min jusqu'à 24 h [29-33, 39, 43, 49]. Comme vu avec les VE HEK293T, les valeurs plus basses à 24 h de co-culture peuvent être le résultat de la division cellulaire ou du recyclage/dégradation des VE internalisées aux premiers points temporels [50]. Spécifiquement, puisque les VE ont été montrées comme étant internalisées puis décomposées ou internalisées puis libérées après 24 h, des incubations plus longues peuvent générer des lectures d'internalisation inexactes [31, 50]. Notre étude est la première à utiliser la CFI pour fournir des preuves visuelles et quantitatives d'une courbe de rendement dépendante du temps sur l'absorption des VE HEK293T.

Comme le suggère le document de position de l'ISEV, le choix d'un marqueur de VE peut affecter l'absorption, nécessitant des techniques moins perturbatrices telles que les méthodes de marquage GFP utilisées dans notre étude. Spécifiquement, 72 % des chercheurs participant à une enquête affirment que les expériences avec des colorants lipidiques sont peu fiables à moins que des contrôles appropriés ne soient utilisés [26]. Les colorants de VE ne corréleraient pas de manière fiable avec le contenu des petites VE et pourraient même augmenter la taille des vésicules. La contamination de lipoprotéines mal étiquetées et du contenu protéique et l'agrégation de colorant ont contribué aux faux positifs [51, 52]. Par conséquent, nous avons fusionné CD63 avec un eGFP pour marquer les VE HEK293T. Similaire à d'autres rapports de marquage protéique, les VE HEK293T étaient GFP positives sans différences observées dans le diamètre et maintenaient une composition standard de protéines de surface des VE [38, 46]. Malgré cela, il est important de noter que le marquage des VE avec des protéines spécifiques des VE peut limiter le suivi à seulement quelques sous-types de VE exprimant les marqueurs respectifs. D'autres limitations potentielles peuvent être que l'intensité de fluorescence dépend du niveau d'expression de la protéine, de l'efficacité du marquage de la membrane des VE et de la force d'excitation de la source lumineuse [53]. Cependant, la CFI est sensible, détectant une faible intensité de fluorescence avec une visualisation précise des particules CD63-GFP à la gamme de 100 nm [38, 54].

Absorption sélective

Les VE affichent des protéines et d'autres signaux qui peuvent conférer une absorption sélective [22, 23, 55]. Puisque la première étape de la biogenèse des VE est l'invagination de la membrane plasmique, la membrane des VE contient des protéines, récepteurs, molécules d'adhésion et intégrines similaires comparées à la membrane de la cellule donneuse [22, 24, 55]. La composition lipidique et les protéines tétracyclines sur les membranes des VE régulées par les cellules donneuses peuvent contribuer aux tropismes des VE avec les cellules réceptrices [23, 34, 56]. Les VE de CSM transportent sélectivement le contenu dans les CSM, malgré une proximité plus grande avec les monocytes [24]. En contraste, d'autres rapportent que les VE naturelles étaient absorbées de manière égale par tout type cellulaire, indépendamment de l'origine des VE [11, 22, 25, 57] en utilisant des essais d'imagerie ou de knockdown fonctionnel. En utilisant la plateforme CFI, nous avons trouvé que les vésicules extracellulaires HEK293T sont absorbées en plus grandes quantités par les cellules HEK293T que par d'autres lignées cellulaires rapportées, suggérant ainsi une spécificité d'absorption des VE inhérente. Grâce à ce résultat et à la polyvalence de la CFI, les sources de VE peuvent être appropriément sélectionnées et analysées pour cibler des cellules réceptrices spécifiques. À notre connaissance, c'est la première étude utilisant la cytométrie de flux en imagerie pour analyser la spécificité des VE HEK293T.

En plus de l'auto-sélectivité, le statut de différenciation des cellules réceptrices a été hypothétisé comme jouant un rôle dans l'absorption des VE [32, 58, 59]. Comme notre groupe et d'autres l'ont montré, les VE ont des effets thérapeutiques dans le système nerveux central et sont connues pour moduler les fonctions cellulaires dans le développement neuronal et chez l'adulte [3, 7-9, 60]. Ici pour la première fois, le statut de différenciation des neurones a affecté l'absorption des VE, où les cellules souches neurales humaines avaient une absorption significativement plus grande des VE HEK293T comparées aux neurones matures. Les hNSC immatures internalisent plus activement les VE exogènes que les neurones matures quiescents. Puisque les hNSC sont des cellules hautement prolifératives en culture, elles peuvent internaliser de manière non spécifique des nutriments et des VE. De même, les cellules dendritiques immatures ont internalisé les VE à des niveaux plus élevés que les cellules dendritiques matures [32, 59]. Cependant, une autre étude avec des cellules précurseurs myéloïdes a trouvé que les cellules dendritiques matures et les macrophages internalisaient plus de VE que les cellules dendritiques immatures et les monocytes [58]. Les différences observées peuvent être attribuées à l'activité phagocytaire des cellules myéloïdes davantage différenciées. En raison des preuves in vitro soutenant l'absorption sélective, les VE HEK293T peuvent être utilisées pour moduler les neurones indifférenciés dans de futures applications thérapeutiques.

Conclusions

En résumé, nous avons développé davantage une plateforme quantitative et à haut débit pour quantifier la cinétique d'absorption des VE HEK293T. Cette plateforme peut être étendue à d'autres VE donneurs et types de cellules réceptrices et essais pour les liposomes et les vecteurs de délivrance de nanoparticules synthétiques. Significativement, nous avons trouvé que l'absorption des VE HEK293T est un processus sélectif, avec une spécificité envers les cellules HEK293T. Les essais CFI développés ici peuvent être utilisés pour mieux définir les paramètres utilisés dans les études d'escalade de dose in vivo et de biodistribution et fournir des informations instrumentales pour un modèle prédictif des résultats d'absorption des VE in vivo.

Disponibilité des données et du matériel

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Abréviations

VE :

Vésicules extracellulaires

HEK293T :

Lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine

CFI :

Cytométrie de flux en imagerie

hNSC :

Cellule souche neurale humaine

GFP :

Protéine fluorescente verte

BF :

Champ clair

SSC :

Diffusion latérale

ISEV :

Société Internationale des Vésicules Extracellulaires