Complexes polymères PEG dispersés dans l'eau de chimiothérapeutiques 4-thiazolidinone : activité pro-apoptotique accrue contre cellules glioma rat C6

Résumé

Objectif

Étudier si la formulation aqueuse du complexe de dérivés 4-thiazolidinone avec un nanovecteur polymérique contenant PEG améliore leur action pro-apoptotique vis-à-vis des cellules glioma rat C6.

Méthodes

Les mécanismes d'effets antinéoplasiques de dérivés 4-thiazolidinone furent investigués in vitro sur cellules glioma rat C6. La vitalité cellulaire, le cycle cellulaire, et l'expression Annexin V furent évalués et les dommages ADN estimés par analyse comète ADN. Une nouvelle formulation aqueuse de dérivés 4-thiazolidinone complexés avec un nanovecteur polymérique fut utilisée pour renforcer l'action pro-apoptotique vers cellules C6.

Résultats

Les dérivés 4-thiazolidinone étudiés utilisent des mécanismes d'apoptose pour tuer les cellules glioma rat C6, confirmé par analyse FACS de ces cellules en phase pré-G1, l'apparition de cellules C6 Annexin V positives, et un nombre accru de comètes ADN de classes supérieures. La complexation des composés étudiés avec un nanovecteur polymérique contenant PEG a significativement augmenté les effets pro-apoptotiques dans les cellules glioma rat C6 mesurés par toutes les méthodes susmentionnées.

Conclusion

La complexation de dérivés 4-thiazolidinone avec un nanovecteur polymérique contenant PEG leur a conféré solubilité aqueuse et effets pro-apoptotiques accrus dans les cellules glioma rat C6.

Introduction

La chimiothérapie est la modalité principale de traitement pour de nombreuses tumeurs, et les médicaments chimiothérapeutiques sont choisis comme dernière option, surtout quand le cancer s'est déjà propagé. Cependant, les effets secondaires négatifs sévères réduisent l'efficacité clinique de nombreux médicaments anticancéreux actuels. Par conséquent, il y a un besoin continu et crucial de développer des médicaments anticancéreux alternatifs ou synergiques avec effets secondaires réduits ou minimaux.

La faible solubilité aqueuse des médicaments anticancéreux a été un problème prévalent et sérieux qui entrave leur développement et application clinique, et de nombreux agents chimiothérapeutiques hautement actifs et prometteurs ont été exclus en raison de leur faible solubilité aqueuse. Les tensioactifs et co-solvants sont utilisés à hautes concentrations pour solubiliser les agents anticancéreux insolubles dans l'eau ; cependant, ces substances peuvent aussi produire des effets indésirables, limitant ainsi l'utilisation de nombreux médicaments anticancéreux.

Un grand défi pour le développement de médicaments pharmaceutiques est d'éliminer ou au moins réduire les effets secondaires négatifs de médicaments hautement actifs, surtout les agents antitumoraux démontrant toxicité générale dans le corps qui restreint significativement leur utilisation. Une façon efficace de surmonter ce problème est d'utiliser un nanovecteur multifonctionnel du médicament qui permettra aux agents antitumoraux toxiques de se lier au site de leur délivrance vers cellules cibles dans organes ou tissus spécifiques. La petite taille, structure à spécificité contrôlée, grande surface et forme des nanoparticules leur fournissent plusieurs avantages comparés à d'autres matériaux. En utilisant des nanoparticules, il est possible d'optimiser l'efficacité, minimiser les effets secondaires négatifs, et améliorer la thérapie du cancer. Ainsi, des médicaments qui ont échoué plus tôt en raison de toxicité générale élevée peuvent maintenant obtenir une seconde opportunité d'utilisation clinique, grâce à leur inclusion dans un système de délivrance à biodisponibilité améliorée et libération contrôlée. De tels complexes médicament-vecteur pénètrent plus aisément les barrières naturelles comme barrières hémato-encéphaliques ou membranes de cellules individuelles. La grande surface des nanoparticules permet de former des complexes avec biomolécules vectrices spécifiques qui assistent la délivrance du médicament à l'organe cible, mènent à réduction significative voire élimination complète des effets secondaires négatifs, permettent d'augmenter la dose minimale efficace lors d'une administration unique, améliorent l'efficacité de l'action du médicament, et donnent un nouvel élan au développement de pharmacothérapie personnalisée. De plus, les nanoparticules peuvent encapsuler des molécules améliorant solubilité, stabilité et absorption de certains médicaments. Les systèmes de délivrance peuvent fournir circulation prolongée du médicament dans le sang, capacité d'accumulation pendant le processus pathophysiologique, et capacité de transférer efficacement la molécule de substance active dans les cellules et organites cellulaires. Les nanoparticules doivent être stables, maintenir leur structure chimique pendant un certain temps, et en même temps être capables de biodégradation.

Pour évaluer de nouveaux médicaments anticancéreux, il est important de mesurer leur activité cytotoxique et puissance utilisant diverses lignées cellulaires cancéreuses humaines cibles, et modèles tumoraux expérimentaux in vivo. La chimiothérapie échoue souvent à cause d'une déficience dans le processus d'apoptose qui joue un rôle pivotal dans la mort cellulaire induite par médicament consécutive à ou résultant d'un changement dans la tumorigénèse.

Puisque de nombreuses cellules malignes peuvent échapper à la mort apoptotique, une approche rationnelle doit être utilisée dans la conception et développement de nouveaux médicaments anticancéreux. Les objectifs majeurs pour créer de nouveaux médicaments anticancéreux sont : (1) trouver des moyens de surmonter les mutations de cellules cancéreuses individuelles qui impactent mécanismes indépendants d'action du médicament ; et (2) concevoir des régimes chimiothérapeutiques capables de cibler simultanément des voies indépendantes. Une meilleure compréhension de la relation entre génétique du cancer et sensibilité au traitement est un enjeu clé pour développer de nouveaux médicaments anticancéreux efficaces.

Dans des études précédentes, nous avons démontré que des dérivés synthétiques 4-thiazolidinone (Les-3288, Les-3833, et Les-3882) utilisent probablement des mécanismes d'action différents d'autres agents anticancéreux pour tuer les cellules glioma rat C6 et glioblastome humain U251 in vitro, contrairement à la doxorubicine (Dox). Les-3288 n'affecta pas significativement le niveau d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules traitées. Il faut souligner que ces agents antitumoraux puissants montrèrent moins de toxicité générale dans le corps d'animaux expérimentaux, comme démontré par les paramètres biochimiques mesurés de leur action toxique dans cellules tumorales et animaux, comparés à ceux de Dox. Ainsi, la liaison d'un médicament antitumoral avec un nanovecteur polymérique (PNC) et l'application du médicament sous forme de système de délivrance aqueux stable peuvent réduire les effets toxiques dans les organes des animaux, comparés à l'action de ces substances sous forme libre.

L'objectif de ce travail était d'étudier l'induction d'apoptose dans cellules glioma lignée C6 in vitro et in vivo par formulations aqueuses de complexes de dérivés 4-thiazolidinone avec un PNC contenant PEG, et comparer l'induction d'apoptose utilisant ces dérivés sous forme libre.

Matériaux et Méthodes

Médicaments Anticancéreux

Les dérivés hétérocycliques 4-thiazolidinone (composés Les-3288 et Les-3833, Fig.1) furent synthétisés au Département de Chimie Pharmaceutique, Organique et Bioorganique de l'Université Médicale Nationale Danylo Halytsky Lviv, Ukraine, comme décrit précédemment.

Nanovecteur Polymérique

Le PNC pour délivrance de médicament fut synthétisé au Département de Chimie Organique de l'Université Polytechnique Nationale Lviv, Ukraine, utilisant une méthodologie décrite plus tôt. La synthèse de poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG fut réalisée par étapes successives comme suit. Poly(VEP-co-GMA) fut synthétisé par copolymérisation radicalaire de 5-tert butylperoxy-5-methyl-l-hexene-3-yne (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (monomère peroxyde synthétisé par la méthode décrite) et méthacrylate de glycidyle (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich, USA) dans acétate d'éthyle (7,9 mL) (Merck, Darmstadt, Allemagne) en utilisant azoïsobutyronitrile (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Allemagne) comme initiateur radicalaire. La polymérisation fut menée à 343 K jusqu'à conversion maximale 65 %. Poly(VEP-co-GMA) fut utilisé comme squelette pour l'attachement de chaînes PEG latérales via réactions d'addition de poly(éthylène glycol) éther méthylique (mPEG) avec groupes époxydes latéraux. Trifluorure de bore éthérate (0,027 mL, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fut ajouté à la solution de copolymère (1,0 g) dans dioxane (20 mL ; Merck, Darmstadt, Allemagne) à 313 K et agité 3 h. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, USA) fut dissous dans dioxane (15 mL) et la solution fut mélangée avec la solution de polymère squelette et agitée 6 h à 313 K. Le mPEG non réagi fut éliminé par dialyse avec poche taille coupure poids moléculaire (MWCO) 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, USA). Le poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG en peigne résultant fut séché à température ambiante sous vide jusqu'à poids constant. Les structures et quelques caractéristiques du PNC sont présentées Fig. 2 et furent décrites précédemment.

Pour préparer les solutions aqueuses de PNC, 0,09 g PNC fut dissous dans 0,9 mL DMSO. Cette solution PNC fut ajoutée à 8,0 mL solution NaCl 0,9 %. Puis, la solution fut agitée 0,5 h et soniquée 10 s. Les dispersions aqueuses des complexes furent obtenues en ajoutant goutte à goutte les solutions DMSO de 4-thiazolidinones et PNC dans l'eau dans l'ordre suivant : 0,045 g PNC dissous dans 0,15 mL DMSO (Sigma-Aldrich, USA), et 0,0015 g Les-3288 (ou Les-3833) dissous dans 0,10 mL DMSO. Les solutions PNC et 4-thiazolidinones furent mélangées et ajoutées à 4,25 mL solution NaCl aqueuse 1 % et soniquées 10 s.

Ce PNC tensioactif contient chaînes PEG hydrophiles greffées sur squelette hydrophobe (Fig. 2a). En solutions aqueuses, le PNC amphiphile forme structures micellaires qui peuvent solubiliser composés insolubles dans l'eau (ex: médicaments) ou ces composés peuvent être adsorbés sur surface des nanoparticules, augmentant ainsi leur biocompatibilité. La technique développée pour obtenir dispersions aqueuses hautement stables de chimiothérapeutiques à base 4-thiazolidinone consiste en la nucléation de particules médicament à l'échelle nanométrique qui se produit quand les solutions diluées en DMSO sont transférées dans la solution saline précipitante contenant le tensioactif polymérique PNC qui fournit revêtement polymère pour la surface nanoparticulaire. En résultat, dû à l'agrégation et sédimentation, le complexe fut stabilisé et la dispersion prévenue. En plus, les complexes nanoscopiques de dérivés 4-thiazolidinone sont protégés d'interactions possibles avec le microenvironnement biologique environnant. Cette protection leur permet de rester plus longtemps dans le corps sans perdre stabilité et s'accumuler dans le tissu ou organe cible sans causer effets secondaires négatifs. Ainsi, telle modification fournit stabilité d'agrégation et sédimentation accrue des dispersions aqueuses de nanoparticules du composé anticancéreux.

Les tailles des micelles polymères de PNC et des complexes PNC avec hétérocycliques 4-thiazolidinones furent mesurées par diffusion dynamique de lumière (DDL) utilisant Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Allemagne) et DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) et par spectres de corrélation photonique utilisant technologie diffusion arrière non-invasive (NIBS) à 25°C. Les échantillons pour mesures DDL furent préparés comme décrit ci-dessus, et si nécessaire, dilués avec eau bi-distillée, pH 6,5-7,0. Trois-cinq mesures furent faites pour chaque échantillon (chaque mesure consistait en 5 cycles et l'intervalle entre mesures était 5 min). La Figure 3 montre la distribution de taille des structures micellaires du PNC et nanoparticules des complexes PNC avec hétérocycliques 4-thiazolidinones (Les-3833 et Les-3288) analysées par DDL. La taille et morphologie des micelles PNC ainsi que nanoparticules 4-thiazolidinone enrobées PNC furent étudiées utilisant microscope électronique à transmission JEM-200А (JEOL, Japon) à tension accélératrice 200 kV. Les échantillons furent préparés comme décrit ci-dessus, et si nécessaire, dilués avec eau bi-distillée. Les échantillons furent préparés par pulvérisation de la solution testée sur substrat via dispersant ultrasonique UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ukraine), qui facilite un enrobage uniforme sur substrat. Un film de carbone amorphe mince déposé sur grille cuivre fut utilisé comme substrat. Les tailles et morphologies des micelles PNC et complexes avec hétérocycliques 4-thiazolidinones (Les-3288 et Les-3833) étudiées par méthodes DDL et MET sont présentées Fig. 3.

Les études DDL et MET démontrèrent que les tailles des micelles PNC étaient 50 ± 25 nm et les nanoparticules formées par complexes PNC avec hétérocycliques 4-thiazolidinones Les-3833 et Les-3288 étaient 140 ± 25 nm et 155 ± 30 nm respectivement. Les dispersions des complexes PNC avec dérivés 4-thiazolidinone sont hautement stables et protégées de l'agrégation et sédimentation par la coquille PNC adsorbée sur surface nanoparticulaire thiazolidinone. Comme Fig. 4, les changements de tailles des nanoparticules dispersées dans le système aqueux sont négligeables à dilutions multiples avec eau, ainsi qu'après 6 mois de vieillissement des systèmes aqueux de complexes PNC avec 4-thiazolidinones.

Culture Cellulaire

Les cellules glioma rat lignée C6 furent obtenues de la Collection Culture Cellulaire à l'Institut de Biologie Moléculaire et Génétique, Académie Nationale des Sciences d'Ukraine (Kyiv, Ukraine). Les cellules furent cultivées en milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM, Sigma, USA) supplémenté 10 % sérum fœtal bovin (Sigma, USA). Les cellules furent cultivées en incubateur CO₂ à 37°C, 5% CO₂, et 95% humidité. Le réensemencement des cellules fut effectué à ratio 1:5 une fois tous les 2-3 jours.

Évaluation de l'Action Cytotoxique des Substances Étudiées

Les cellules furent ensemencées en plaques 24 puits à concentration 100 000 cellules/mL par puits. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, USA). Les substances à l'étude furent ajoutées à concentrations 0,1, 0,5 et 1,0 µM après période d'adaptation 24 h qui débuta après ensemencement. Le comptage cellulaire fut conduit à intervalles réguliers dans chambre de comptage hémocytométrique utilisant colorant Trypan Blue (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, USA) à concentration finale 0,01%, 2 min après ajout à la suspension cellulaire. Les cellules mortes prirent ce colorant dû à dommage à leur membrane plasmique.

Cytométrie de Flux

Pour étudier cycle cellulaire et apoptose, cellules C6 furent traitées avec Les-3288, Les-3833 et leurs complexes avec PNC, ainsi qu'avec PNC sous forme libre, lavées avec tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4), pelletées par centrifugation 1000 tr/min 5 min à 4°C et resuspendues dans PBS froid (2 millions cellules par 1 mL PBS). Puis, cellules furent fixées en ajoutant aliquotes 4 mL éthanol absolu refroidi à −20°C avec mélange doux. Les échantillons fixés furent gardés à −20°C jusqu'à utilisation (pas plus d'1 semaine). Pour analyse tri cellulaire activée fluorescence (FACS), échantillons cellulaires furent centrifugés 1000 tr/min 5 min à 4°C, surnageant éliminé et culot cellulaire resuspendu dans 1 mL PBS. Cent microlitres RNase sans DNase (Sigma, USA) fut ajouté à cette suspension, et échantillons incubés 37°C 30 min. Puis, chaque échantillon fut supplémenté 100 µl iodure de propidium (PI) (Sigma, USA, 1 mg/mL), et incubé température ambiante 10 min. Finalement, échantillons furent transférés tubes Falcon plastique, et suspension cellulaire fut monitorée avec cytomètre flux FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) et logiciel Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) pour mesurer paramètres cycle cellulaire et apoptose.

La mesure des cellules Annexin V-positives (apoptotiques) fut effectuée par analyse FACS. Cellules glioma rat C6 furent traitées avec concentrations 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, et 1 mg/mL de PNC, Les-3288, Les-3833, et leurs conjugués polymériques comme indiqué sous figures. À fin d'expérience, cellules furent détachées du fond du plat avec solution Trypsin-EDTA, lavées deux fois PBS, et colorées Annexin V-FITC utilisant Kit Détection Apoptose (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), selon instructions fabricant. Cellules lavées furent incubées 15 min dans tampon liaison Annexin V (BD Pharmingen), contenant 1/50 volume solution Annexin V conjuguée FITC. Puis, échantillons furent dilués deux fois avec volume approprié tampon liaison Annexin V et immédiatement mesurés sur canal FL1/FL2 (FITC-PI) cytomètre flux (Becton Dickinson, USA). Les cellules Annexin V-positives simples furent classées apoptotiques.

Essai Comète ADN

L'essai comète ADN fut réalisé sous conditions alcalines. Dix mille cellules furent mélangées dans 75 µl agarose bas point fusion (0,5%) par échantillon. Après mélange, échantillon fut pipetté sur lame pré-enrobée 1,5% agarose normal point fusion. Échantillons furent incubés 4°C pendant 18 h en solution lyse (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Pour permettre dévidage ADN et expression dommages alcalins-labiles, lames furent incubées en solution alcaline température ambiante 20 min (conduit dans obscurité). Pour électrophorèse (~74 V/cm 30 min), lames furent transférées chambre horizontale et 1x tampon électrophorèse (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) ajouté. Lames furent fixées dans méthanol 100% glace et séchées. Lames furent colorées 80 µL 1× bromure d'éthidium (EtBr) 5 min puis trempées eau distillée glacée pour éliminer excès colorant. Les comètes ADN furent visualisées microscope (Carl Zeiss, Allemagne), et images analysées logiciel 'CASP' (Casplab-1.2.3b2 software, CASPlab, Wroclaw, Pologne). Cent comètes par échantillon furent comptées. Dommages ADN catégorisés en cinq niveaux génotoxicité selon taille queue comète : 0 (0-5% dommages), 1 (5-25%), 2 (25-45%), 3 (45-70%), 4 (>70%). L'indice dommage (DI) fut calculé, comme décrit précédemment.

Essai Intercalation ADN Utilisant Colorant Vert Méthyl

Les composés Les-3288 et Les-3833 furent investigués pour capacité intercaler dans molécule ADN par essai vert méthyl. ADN sperme saumon (10 mg/mL) fut incubé 1 h à 37°C avec 15 µL solution vert méthyl (1 mg/mL dans H₂O). Composés furent ajoutés 1 µg/mL et incubés 37°C dans obscurité 2 h. Volume final total échantillons 1 mL. Absorption vert méthyl mesurée 630 nm, après incubation échantillons 2 h à 37°C, utilisant microphotomètre multi-canaux BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, USA). EtBr utilisé comme contrôle positif.

Analyse Données et Statistiques

Toutes expériences furent répétées trois fois avec trois parallèles chaque variante. Analyse variance (ANOVA) utilisée pour comparaison groupes. Données distribution cellules glioma rat C6 différentes phases cycle cellulaire analysées ANOVA unidirectionnelle, suivie test post-hoc Tukey comparaison multiple. Toutes données présentées moyenne ± SD. Valeur p < 0,05 considérée statistiquement significative.

Résultats

Effet Cytotoxique (Test Exclusion Trypan Blue) Dérivés 4-Thiazolidinone Forme Libre et Complexe avec Nanovecteur Polymérique

Les résultats test exclusion Trypan blue démontrèrent que les formes aqueuses des complexes Les-3288 et Les-3833 avec PNC avaient toxicité accrue vers cellules glioma C6 (traitement 24 h et 48 h) comparé à cytotoxicité observée utilisant forme libre de ces composés (Figs. 5 et 6). L'effet cytotoxique le plus haut fut observé à doses 0,1 et 0,5 µM Les-3288 et Les-3833 en complexes avec PNC, tandis qu'à dose la plus haute (1,0 µM) de ces composés, une amélioration de complexation avec PNC fut détectée seulement pour Les-3288 à 24 h (Figs. 5 et 6).

Complexation Les-3833 et Les-3288 avec Nanovecteur Polymérique Améliore Leur Activité Pro-Apoptotique In Vitro Vers Cellules Glioma Rat C6

Deux approches alternatives furent utilisées pour évaluer effet modulateur du PNC sur potentiel cytotoxique des dérivés 4-thiazolidinone sélectionnés. Premièrement, analyse cycle cellulaire fut conduite pour investiguer impact complexes médicament-PNC sur cyclage cellulaire. Additionnellement, double coloration Annexin V/PI fut utilisée pour distinguer type exact mort cellulaire induit par ces nanocomposites.

Les-3288 et Les-3833 à faibles doses (0,1 µg/mL et 0,5 µg/mL) ne produisirent aucun effet visible ni sur progression cycle cellulaire ni induction apoptose, comme Fig. 7 et Tableau 1. Cependant, complexation des deux composés avec PNC augmenta significativement nombre cellules en phase pré-G₁ (4 fois pour Les-3288 et 6 fois pour Les-3833), indiquant boost majeur potentiel pro-apoptotique. Il faut souligner que PNC forme libre n'eut aucun impact sur cyclage cellulaire ou induction apoptose ; ainsi, l'apparition observée grande population cellules pré-G1 sous traitement complexes thiazolidinone-nanovecteur ne peut être expliquée par simple effet synergique PNC et médicaments expérimentaux.

Afin confirmer que pic sous-G1 observé consiste en cellules apoptotiques, résultats coloration Annexin V/PI furent analysés. Nous n'observâmes pas d'externalisation significative phosphatidylsérine (marqueur principal apoptose précoce, détecté par Annexin V conjugué FITC) pendant traitement glioma C6 avec faibles (0,1 et 0,5 µg/mL) et fortes doses Les-3288 (1,0 µg/mL), suggérant ce composé est faible inducteur apoptose. Au lieu, nous trouvâmes augmentation population cellules nécrotiques (de 1,2% contrôle à 11,25% pour Les-3288, 1,0 µg/mL), ce qui peut indiquer Les-3288 cause au moins partiellement mort cellulaire nécrotique. Cependant, complexation Les-3288 avec PNC changea complètement mode action de ce médicament. Il y eut augmentation massive nombres cellules apoptotiques précoces (Annexin V(+)/PI(−)) et tardives (Annexin V(+)/PI(+)), tandis que quantité globale cellules purement nécrotiques resta au niveau cellules contrôle (non traitées) (Fig. 8a). Ainsi, liaison Les-3288 avec PNC non seulement renforce fortement son activité pro-apoptotique vers cellules glioma, mais diminue aussi son potentiel mécanisme mort cellulaire nécrotique. Ces découvertes peuvent être d'importance clé pour pratique clinique car médicaments pro-nécrotiques ne sont pas recommandés dû à induction massive inflammation inconvenante pour patients.

Surprenant, nous n'observâmes pas même effet pour complexe Les-3833+PNC. En fait, activité pro-apoptotique complexe Les-3833+PNC fut inférieure comparée à Les-3288 forme libre à toutes concentrations testées (Fig. 8b). Telle différence drastique entre les deux composés pourrait être expliquée par spécificité leur structure chimique, et nous spéculons que dans cas Les-3833, structure polymère devrait être optimisée pour meilleurs résultats.

Essai Comète Dommages ADN Cellules Glioma Rat C6 Causés par Dérivés 4-Thiazolidinone Forme Libre et Complexés avec PNC

Essai comète alcalin permet détection cassures simple brin ADN en sites ADN alcalins-labiles. Résultats obtenus estimés valeur moyenne moment queue Olive (OTM). Nos données montrèrent que traitement cellules glioma rat C6 avec Les-3288, Les-3833, et PNC (concentration 0,5 µg/mL) 3 h (Figs. 9 et 10) ne causa pas dommages ADN significatifs (OTM = 0,7299 ± 0,1276, OTM = 1,466 ± 0,3086, OTM = 0,5846 ± 0,1078 respectivement), comparé cellules non traitées contrôle (OTM = 0,4541 ± 0,07273). Cependant, traitement cellules avec complexe Les-3833 + PNC (OTM = 2,3880 ± 0,2212) causa dommages ADN plus significatifs que traitement forme libre Les-3833. Telle augmentation dommages ne fut pas observée pour action complexe Les-3288+PNC (Figs. 9 et 10).

Augmentation temps incubation 6 h (Figs. 11 et 12) causa dommages ADN plus grands dans tous groupes expérimentaux : Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, et Dox (contrôle positif). Cependant, effets complexes Les-3288+PNC et Les-3833+PNC apparurent inférieurs aux effets formes libres Les-3288 et Les-3833. Il faut noter que effet dommage ADN complexes des deux dérivés avec PNC fut moins que tel effet de ces dérivés forme libre.

Résultats évalués valeur moyenne TailDNA%. Données obtenues montrent incubation cellules glioblastome rat C6 avec substances Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, et PNC (tous concentration 0,5 µg/mL) pendant 3 h (Fig. 13) ne mène pas à dommages ADN significatifs (TailDNA% 4,157 ± 0,682 ; 3,530 ± 1,012 ; 8,807 ± 0,878 ; 3,298 ± 0,514 respectivement) comparé contrôle (TailDNA% = 3,638 ± 0,406), mais traitement cellules avec complexe Les-3833+PNC (TailDNA% = 19,53 ± 1,48) cause dommages ADN plus significatifs que forme libre Les-3833. Augmentation temps incubation 6 h (Fig. 14) en tous cas mène plus grands dommages ADN. Encore, niveau TailDNA% détecté action complexes des deux dérivés avec PNC fut moins que niveau cet indicateur pour action dérivés forme libre.

Nous utilisâmes aussi système classification alternatif cinq catégories pour classifier migration ADN et calculâmes DI. Tableau 2 résume pourcentages cellules glioma rat C6 chaque niveau génotoxicité pendant 3 h traitement. Dans contrôle (cellules non traitées), pourcentages plus élevés cellules niveaux 0 (81,3%) et 1 (18,6%) détectés comparé ces niveaux dans cellules traitées Les-3288 et PNC. Complexation Les-3288 avec PNC ne mena pas grand changement distribution pattern comètes ADN. En contraste, cellules traitées Les-3833 montrèrent pourcentage plus faible cellules niveau 0 (38,6%) et plus élevé niveau 1 (60,0%), tandis cellules traitées Les-3833 + PNC démontrèrent pourcentage significativement plus faible niveau 0 (8,0%) et pourcentages beaucoup plus élevés niveaux 1 (76,0%), 2 (13,3%), et 3 (2,6%). L'indicateur intégratif dommage ADN (DI) cas application Les-3288 et son complexe PNC ne différa pas significativement contrôle ou PNC libre, tandis DI utilisant Les-3833 et son complexe PNC fut même plus élevé que DI utilisant Dox.

Pendant cet intervalle temps, cellules traitées Les-3833 + PNC démontrèrent pourcentage plus élevé cellules niveau 4 (5,3%) dommages ADN que cellules traitées Les-3288 et autres composés expérimentaux, mais pourcentages cellules niveaux 2 et 3 furent plus bas (16,0% et 12,0% respectivement) que ceux traitement autres composés (Tableau 2). Tableau 3 résume pourcentages cellules glioma rat C6 dommages ADN après 6 h traitement. En général, tendance apparition comètes ADN classes supérieures détectée quand complexes Les-3833 et Les-3288 utilisés, comparé spectre classes comètes ADN induites formes libres ces agents (Tableau 3). Cependant, indicateur intégratif dommage ADN (DI) calculé action complexes Les-3833 et Les-3288 fut trouvé plus bas que tel indicateur action formes libres ces agents. Explication possible pourrait être niveau DI très haut à 6 h action agents étudiés même plus haut que niveau indicateur trouvé action Dox (Tableau 3). Ainsi, nous observâmes dépendance temps dommages ADN causés complexes Les-3833 et Les-3288 : à 3 h traitement, augmentation DI cas action complexes Les-3833 comparé action forme libre Les-3833 ; cependant à 6 h traitement, diminution dommages ADN action complexes Les-3833 et Les-3288 comparé tels dommages observés action formes libres ces agents. Aucune dépendance temps significative pour action PNC, tandis augmentation significative temps-dépendante (3 à 6 h) DI observée action Dox (de 41,2 + 0,40 à 185,2 + 0,23).

Intercalation ADN par Dérivés 4-Thiazolidinone — Les-3288 et Les-3833

Les-3288 et Les-3833 démontrèrent certaine capacité intercaler molécules ADN avec environ 15% et 10% respectivement remplacement colorant vert méthyl. EtBr, agent intercalant ADN bien connu, utilisé contrôle positif, montra remplacement colorant vert méthyl bien plus efficace (70%) (Fig. 15). Ainsi, Les-3288 et Les-3833 ne sont pas capables d'intercaler efficacement entre deux paires bases complémentaires ADN double brin.

Discussion

Deux problèmes majeurs entravent l'augmentation efficacité traitement patients cancéreux : (1) actions non-ciblées de nombreux médicaments anticancéreux menant toxicité générale et effets secondaires sévères dus dommages tissus et organes normaux ; (2) développement rapide (6-12 mois) résistance cellules tumorales aux médicaments anticancéreux appliqués menant perte efficacité action médicament. En plus, il y a troisième problème technique mauvaise solubilité aqueuse nombreux médicaments anticancéreux. Cependant, lier ces médicaments avec vecteurs spécifiques taille nanométrique peut aider résoudre problème solubilité.

Dans cette étude, nous adressâmes premier et troisième problèmes susmentionnés en (a) sélectionnant nouvelles substances synthétiques (dérivés 4-thiazolidinone : Les-3288 et Les-3833) possédant à la fois haute activité anticancéreuse et moins toxicité générale chez animaux porteurs tumeurs et (b) appliquant nouvelle plateforme délivrance médicament fournissant formes aqueuses stables complexes 4-thiazolidinone dérivés insolubles dans l'eau avec polymère PEGylé.

Les dérivés 4-thiazolidinone — Les-3288 et Les-3833 — sont composés hétérocycliques masse moléculaire 400-600 Da. Ces et autres dérivés apparentés furent synthétisés Université Médicale Nationale Lviv (Ukraine), et la plupart furent testés sous Programme Développement Thérapeutique Institut National Cancer Bethesda, MA, (USA). Basé sur ces évaluations activité antinéoplasique, substances les plus prometteuses furent sélectionnées pour étude ultérieure mécanismes action cytotoxique et effets anticancéreux. Les-3833 démontra haute toxicité vers cellules mélanome B16F10, WM793, SK-Mel-28, et contre cellules cancer poumon humain A549, sein MCF-7, colon HCT116, ovaire SKOV3 et leucémie (lignées L1210, Jurkat, HL-60). Les-3288 et Les-3833 montrèrent haute toxicité contre cellules glioma mammifères (lignées C6, U251, U373).

Précédemment, nous trouvâmes Les-3288 et Les-3833 plus toxiques parmi autres dérivés 4-thiazolidinone étudiés vers cellules glioma rat C6 et glioblastome humain U251, bien que leur application pour traitement cellulaire fut très compliquée dû à leur insolubilité absolue dans l'eau. Seul utilisation DMSO avec chauffage additionnel fut efficace pour préparer forme soluble dérivés (voir section « Matériaux et Méthodes »). Ainsi, il fut raisonnable chercher voie améliorer délivrance ces dérivés vers cellules cibles, et nous utilisâmes PNC synthétique pour accomplir cette tâche. La complexation dérivés 4-thiazolidinone étudiés avec PNC appliqué améliora aussi efficacité leur action antinéoplasique. Les mécanismes action pro-apoptotique ces composés furent démontrés western blot et analyses FACS. Il faut noter que chez animaux expérimentaux sains, Les-3288 et Les-3833 produisent bien moins effets secondaires négatifs comme cardiotoxicité, hépatotoxicité, et néphrotoxicité que agent chimiothérapeutique anticancéreux largement utilisé Dox.

Dans étude précédente, nous montrâmes Les-3288 n'induisait pas production ROS pendant son action pro-apoptotique in vitro et effets animaux laboratoire, tandis action Les-3833 mena à telle production ; cependant, elle fut moins que Dox. ROS considérés principaux effecteurs effets secondaires négatifs médicaments anticancéreux, particulièrement Dox. Ainsi, composés Les-3288 et Les-3833 pourraient être médicaments anticancéreux prospectifs car ils possèdent activité antitumorale, mais ne démontrent pas toxicité générale au niveau caractéristique médicaments anticancéreux efficaces comme Dox.

Grand impediment promouvoir Les-3288 et Les-3833 comme médicaments anticancéreux est leur pauvre solubilité aqueuse. Ce problème existe aussi pour autres médicaments anticancéreux, comme taxols. Pour paclitaxel, ce problème fut résolu en utilisant huile spéciale pour préparation formulation médicinale. Cependant, plateformes délivrance spécifiques considérées plus prometteuses pour créer médicaments « intelligents » possédant action efficace dans organisme. Surfactants polymères fonctionnels spécifiques avec architectures bloc, peigne, et bloc/branché, incluant ceux contenant PEG, ainsi que formes aqueuses dérivées ont été développés et proposés pour application comme vecteurs délivrance Dox et agent chimiothérapeutique métal KP-1019 au Département Chimie Organique Université Polytechnique Nationale Lviv.

Puisque dérivés 4-thiazolidinone sont composés insolubles dans l'eau, DMSO fut utilisé pour préparer leurs formes solubles aqueuses. Pour éviter conséquences négatives utilisation solvant toxique comme DMSO, nous complexâmes ces dérivés avec PNC susmentionné. Dispersions aqueuses nanoscopiques hautement dispersées et stables de ces substances furent obtenues et appliquées traitement cellules glioma rat C6.

L'utilisation complexes dérivés 4-thiazolidinone avec PNC mena à toxicité générale réduite ces composés chez animaux expérimentaux. Précédemment, nous trouvâmes quand agents antitumoraux expérimentaux (Les-3288, Les-3833, Les-3882) appliqués en complexe avec vecteur polymérique synthétique, leur action fut accompagnée bien plus petits changements paramètres biochimiques sérum sanguin caractéristiques cardiotoxicité, hépatotoxicité, et néphrotoxicité, comparés ceux Dox. Ainsi, complexation ces agents antitumoraux avec PNC et leur application forme systèmes délivrance aqueux stables réduit leurs effets toxiques animaux expérimentaux, comparés action ces substances forme libre. Plusieurs systèmes délivrance paclitaxel proposés incluant nanoparticules polymères, formulations lipidiques, conjugués polymères, nanoparticules inorganiques, nanotubes carbone, nanocristaux, et nanoparticules cyclodextrine.

Ainsi, complexation Les-3288 avec PNC augmenta significativement activité pro-apoptotique ce médicament expérimental, permettant ainsi l'avancer vers études précliniques modèles tumoraux animaux. Complexation Les-3833 même type nanovecteur fut moins efficace, et ainsi autre type polymère devrait être utilisé.

Les formes aqueuses développées complexes, ainsi que dérivés libres, furent appliquées traitement cellules glioma rat C6. Il fut trouvé que ces formes aqueuses complexes PNC avec dérivés 4-thiazolidinone — Les-3288 et Les-3833 — améliorèrent action pro-apoptotique ces composés. Dans autre étude, nous démontrâmes que induction apoptose par Les-3288 ne fut pas accompagnée induction ROS, opposé action Dox et Les-3833. Ainsi, haute activité antitumorale Les-3288 ensemble sa faible toxicité générale ciblant malignité chez souris porteuses lymphome NK/Ly suggèrent grand potentiel ce composé anticancéreux expérimental. Données présentées prédisent aussi utilité potentielle Les-3288 et Les-3833 complexés PNC pour traitement glioma.

Division cellulaire, différenciation, et mort sont processus physiologiques principaux régulant homéostasie tissus organismes multicellulaires. Perturbation intégrité génomique et régulation altérée mort cellulaire peuvent toutes deux mener croissance cellulaire incontrôlée. Processus mort cellulaire compromis peut aussi promouvoir instabilité génomique. Il devient clair que dysregulation cycle cellulaire et processus mort cellulaire joue rôle pivotal développement troubles majeurs comme cancer, maladies cardiovasculaires, infection, inflammation, et maladies neurodégénératives.

Nous avons trouvé que certains dérivés 4-thiazolidinone, notamment Les-3288 et Les-3833, furent même plus efficaces que Dox dans induction apoptose cellules glioma rat C6 et glioblastome humain U251 in vitro. Il faut noter que tumeurs cérébrales appartiennent malignancies les plus résistantes chimiothérapies appliquées, et taux survie patients ces tumeurs sont extrêmement bas.

Il a été montré que complexation avec ce PNC améliora action pro-apoptotique dérivés 4-thiazolidinone (Les-3288 et Les-3833). Dans autre étude, nous démontrâmes que induction apoptose par Les-3288 ne fut pas accompagnée induction ROS, opposé action Dox et partiellement opposé Les-3833. Ces données pourraient expliquer toxicité générale plus faible Les-3288 comparé Dox.

Résultats analyse FACS accordent avec suggestion qu'amélioration action pro-apoptotique dérivés 4-thiazolidinone étudiés est due à leur complexation avec nouveau PNC. Telle complexation Les-3288 et Les-3833 augmenta ratio cellules pré-G1 population cellules glioma rat C6 traitées, diminua ratio cellules G1, et augmenta action cellules G2/M. Ces données suggèrent amélioration à la fois action cytotoxique (apoptose) et cytostatique (blocage phase G2/M cycle cellulaire) dérivés étudiés complexés PNC. En général, mécanisme apoptose mort cellules glioma par complexe Les-3288 + PNC et complexe Les-3833 + PNC fut démontré par résultats analyse FACS apparition cellules Annexin V simple-positives glioma rat C6.

Implication mécanismes apoptose action dérivés 4-thiazolidinone étudiés fut aussi confirmée par résultats essai comète ADN. Il fut trouvé que complexation Les-3833 avec PNC mena à diminution (comparé Les-3833 libre) ratio cellules glioma rat C6 niveau « 0 » comètes ADN et augmentation simultanée ratio comètes « 1 », « 2 », et « 3 » (traitement 3 h cellules). À 6 h traitement complexe Les-3833+PNC, grande augmentation (comparé Les-3833 libre) ratio comètes « 1 », augmentation ratio cellules dommages ADN plus exprimés (« 4 » comètes), et diminution ratios « 2 » et « 3 » comètes. Il faut noter que effets dommage ADN Les-3288 et Les-3833 mesurés 6 h fut plus hauts que tels effets complexes ces dérivés avec PNC (voir Tableau 3). Explication possible ici pourrait être niveau DI très haut à 6 h action agents étudiés même plus haut que niveau indicateur trouvé action Dox (Tableau 3). Aucune dépendance temps action PNC, tandis augmentation significative temps-dépendante (3 à 6 h) DI (de 41,2 + 0,40 à 185,2 + 0,23) détectée action Dox.

Ainsi, complexation dérivés 4-thiazolidinone — Les-3288 et Les-3833 — avec PNC améliora effet cytotoxique ces composés vers cellules glioma rat C6, et cet effet fut atteint par mécanismes apoptose incluant dommages ADN observés comètes ADN dans cellules électrophorésées.

Nous utilisâmes test intercalation ADN pour investiguer ciblage direct ADN par dérivés 4-thiazolidinone et révélâmes seulement faible remplacement colorant vert méthyl (15% et 10% remplacement pour Les-3288 et Les-3833 respectivement) intercalé dans ADN sperme saumon, comparé remplacement EtBr, contrôle positif (70%).

Ainsi, conduire expériences cytotoxicité in vitro avec dérivés 4-thiazolidinone — Les-3288 et Les-3833 — fut plus commode dû à utilisation formes aqueuses dérivés 4-thiazolidinone — Les-3288 et Les-3833 — complexés nouveau PNC. En plus, nous avons démontré que nouveaux dérivés synthétiques 4-thiazolidinone (Les-3833 et Les-3288) possédaient effets traitement in vivo vers lymphome NK/Ly greffé souris BALB/C, et ces effets étaient comparables tels effets Dox. En même temps, action ces dérivés mena à bien moins effets secondaires négatifs mesurés comme changements nombre érythrocytes, neutrophiles, et lymphocytes sang animaux et activité aspartate et alanine aminotransférases leur sérum sanguin, comparés action Dox.

Conclusions

La complexation Les-3288 et Les-3833 avec PNC contenant PEG améliora leur action cytotoxique vers cellules glioma rat C6. L'action cytotoxique fut réalisée par mécanismes apoptotiques et confirmée par analyse FACS comme présence fraction pré-G1 dans cellules glioma rat C6 et cellules Annexin V-simple-positives. Analyse comète ADN révèla cassures simple brin ADN nucléaire cellules glioma C6 traitées qui probablement ne fut pas causée par intercalation composés étudiés dans molécule ADN. Les-3288 et Les-3833 stabilisés par PNC amphiphile contenant PEG résultèrent en formes aqueuses et fournirent amélioration effet antitumoral in vitro comparé forme libre médicaments.

Abréviations

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

Dox :

Doxorubicine

EtBr :

Bromure d'éthidium

FACS :

Tri cellulaire activé par fluorescence

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

PBS :

Tampon phosphate salin

PEG :

Polyéthylène glycol

PI :

Iodure de propidium

PNC :

Nanovecteur polymérique

MEB :

Microscopie électronique à balayage

MET :

Microscopie électronique à transmission

VEP :

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in