Sécrétion de cellules pariétales gastriques et de cellules caliciformes intestinales :une nouvelle voie métabolique de nanoparticules métalliques in vivo à médiation cellulaire améliorée avec la diarrhée via des herbes chinoises

Introduction

Avec le développement rapide de la nanotechnologie et de ses applications, une grande variété de matériaux nanostructurés fabriqués sont maintenant utilisés dans les produits pharmaceutiques, les produits biomédicaux et d'autres industries. Les produits nanotechnologiques émergents ont un potentiel énorme pour la croissance et le développement économiques futurs, mais les risques de la nanotechnologie sur l'environnement et la santé humaine ne sont toujours pas entièrement compris. Pour étudier l'impact des nanoparticules sur le corps humain, leurs interactions avec les systèmes biologiques et leurs évaluations des risques potentiels, la nanotoxicologie a été considérée comme un nouveau sujet multidisciplinaire, attirant de plus en plus l'attention des gouvernements et des scientifiques, et établissant la biosécurité des nanomatériaux comme un élément clé. problème scientifique. À ce jour, de nombreux rapports sont étroitement associés à l'interaction entre les nanoparticules et les cellules humaines. Par exemple, certaines nanoparticules telles que les oxydes de graphène, les nanoclusters d'or et les points de carbone peuvent pénétrer dans le cytoplasme ou le noyau cellulaire, induisant l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose cellulaire, la formation de granulomes pulmonaires et stimulant la sécrétion immunologique de certaines cytokines [1,2, 3].

Avec le développement de nouvelles techniques d'imagerie moléculaire, les nanoparticules métalliques telles que les nanoparticules d'or, les nanoparticules d'argent, les nanoparticules magnétiques et les points quantiques ont été activement étudiées en tant que réactifs théranostiques multifonctionnels et sont utilisées pour l'imagerie ciblée in vivo, le chauffage induit magnétique, photothermique ou thérapie photodynamique, ou en tant que systèmes d'administration de médicaments hautement efficaces, entre autres applications. Il a été observé que ces nanosondes multifonctionnelles à base de nanoparticules métalliques sont situées dans des sites tumoraux, et une partie d'entre elles sont également situées dans les tissus du foie et de la rate et peuvent se répartir dans les tissus rénaux, pulmonaires et cérébraux [4,5,6, 7,8,9,10]. Étant donné que le rein ne nettoie que les nanoparticules de moins de 5  nm de diamètre, la plupart des nanoparticules sont très difficiles à éliminer de cette manière [11, 12]. Par conséquent, comment nettoyer les nanoparticules métalliques in vivo est devenu un problème scientifique clé. Cependant, à ce jour, il n'existe pas de voies alternatives convaincantes ni de mécanismes détaillés pour éliminer les nanoparticules métalliques du corps humain. Ainsi, comment nettoyer les nanoparticules métalliques in vivo est devenu notre préoccupation.

À ce jour, les nanoparticules métalliques sont introduites dans l'organisme principalement par trois voies, telles que les voies intraveineuse, orale et intrapéritonéale, parmi lesquelles l'injection intraveineuse est la méthode la plus courante en raison de sa distribution rapide dans tout le corps [4, 13, 14] . Cependant, la dégradation des noyaux métalliques de ces types de nanoparticules par l'organisme est, si possible, extrêmement difficile, conduisant au problème principal, à savoir les effets de l'accumulation de nanoparticules résiduelles. Il convient de noter que la qualité des nanoparticules métalliques in vivo est déterminée par l'équilibre entre la bioactivité induite par les nanoparticules et la toxicité indésirable. D'un point de vue toxicologique, un effet toxique n'est provoqué que si des quantités suffisantes de nanoparticules sont localisées dans un site cible, et l'excrétion de l'organisme est le meilleur moyen de faire cesser les effets d'une quantité excessive de nanoparticules localisées dans les cellules et les tissus. Par conséquent, une bonne compréhension de leurs voies d'élimination est cruciale pour toute application médicale et pour une évaluation complète des risques.

Certaines études sont associées à la clairance des nanoparticules des tissus ou organes in vivo tels que les reins, le foie et les poumons [15,16,17]. Cependant, ces expériences fournissent simplement des informations concernant le mécanisme de clairance pour éliminer les particules d'un seul organe au lieu de l'ensemble du corps [18]. En ce qui concerne la clairance systémique in vivo, deux voies principales d'excrétion des nanoparticules injectées par voie intraveineuse ont été rapportées, à savoir la voie système hépatobiliaire (HBS)-fèces pour les nanostructures plus grandes qui ne peuvent pas être biodégradées par l'organisme comme certains types de nanoparticules magnétiques. [19, 20] et la voie rein-urine pour les nanoparticules de petite taille, telles que les points quantiques, les fullerènes, les nanoclusters d'or et d'autres types de nanoparticules d'or de moins de 5  nm de diamètre [16, 21, 22]. Cependant, ces deux voies présentent un taux de clairance limité pour les nanoparticules métalliques in vivo.

Souris et al. ont démontré que les nanoparticules de silice s'accumulaient dans la paroi intestinale à une concentration élevée et que la concentration de nanoparticules de silice injectées par voie intraveineuse de 50 à 100  nm situées dans le foie était bien inférieure à celle de la paroi intestinale et des selles [20]. Une autre étude a montré que des nanoparticules aussi grandes que 500 nm, quelles que soient les modifications, peuvent être éliminées du corps du poisson et que le taux d'élimination des particules de 500 nm était plus rapide et plus efficace que celui des particules de 50  nm malgré le fait que les nanoparticules plus grosses dépassent de loin la capacité. de HBS [23]. Ces données montrent que la voie HBS peut ne pas être la principale voie d'excrétion des nanoparticules in vivo et qu'il peut exister d'autres voies d'excrétion pour les nanoparticules in vivo.

Les cellules caliciformes intestinales (GC) sont des cellules excrétrices hautement polarisées présentes dans tout le tractus intestinal. Ces cellules épithéliales spécialisées joueraient un rôle protecteur important dans l'intestin en synthétisant et en sécrétant plusieurs médiateurs [24,25,26]. Wang et al. ont rapporté que les cellules caliciformes (GC) peuvent absorber des nanoparticules [27], et Sun et al. ont trouvé que les nanoparticules injectées par voie intraveineuse étaient distribuées dans les GC intestinales [28]. Néanmoins, à ce jour, l'interaction entre les nanoparticules et les GC intestinales n'est toujours pas étudiée en détail. Plus précisément, aucun rapport ne clarifie pleinement comment ces nanoparticules sont capables de pénétrer dans les cellules des GC et si ces nanoparticules se répartissent dans les GC de l'ensemble du tissu intestinal. Pour clarifier la voie d'excrétion des nanoparticules métalliques dans les tissus intestinaux, il est crucial d'élucider le rôle joué par les GC intestinales dans cette nouvelle voie d'excrétion des nanoparticules. Étant donné que les nanoparticules métalliques peuvent être excrétées par le HBS et pénétrer dans l'intestin, nous nous sommes donc concentrés sur la distinction entre l'excrétion médiée par le HBS et celle médiée par les GC intestinales (Schéma 1).

La voie d'excrétion intestinale des GC des nanoparticules

Dans cette étude, nous avons sélectionné quatre types de nanoparticules métalliques courantes telles que les nanoparticules magnétiques, les nanoparticules triangulaires d'argent, les nanoclusters d'or et les nanotiges d'or comme cibles de recherche. Grâce aux propriétés optiques caractéristiques des nanotiges d'or, elles ont servi d'outil pour observer la distribution intestinale des nanoparticules par excitation à deux photons, tandis que les trois autres types de particules ont servi d'exemples représentatifs de divers autres nanomatériaux métalliques. Des modèles de souris ont été préparés avec une ligature du canal cholédoque pour empêcher la connexion entre HBS et le tractus intestinal. Les nanoparticules métalliques ont été injectées à des souris par la veine de la queue, puis des souris nudes ont été élevées et des excréments ont été collectés pendant 7 jours, et les animaux ont finalement été sacrifiés, et les tissus du tractus intestinal et gastrique ont été collectés, préparés en tranches et enfin analysés. utilisant un électroscope à transmission haute résolution et l'ICP-MS pour étudier la distribution des nanoparticules métalliques dans les tissus intestinaux. De plus, la présence de nanoparticules métalliques a été mesurée dans les selles des souris avec ligature CBD. De plus, dans cette étude, afin de mieux découvrir le mécanisme de sécrétion de nanoparticules des GC et des PC, nous avons utilisé un modèle de diarrhée de souris récemment développé induite par des herbes chinoises.

Matériaux et méthodes

Synthèse et caractérisation de nanoplaques d'argent triangulaires

Les nanoplaques d'argent triangulaires ont été synthétisées via des procédures décrites précédemment par Mirkin [29] et ses collègues avec quelques modifications [30]. Dans une expérience typique à température ambiante avec de l'air, AgNO₃ (0,1 mM, 100 mL), citrate trisodique (30 mM, 6 mL), PVP (30 kDa poids moléculaire, 0,7 mM, 6 mL) et 240 μL H₂ O₂ (30 % en poids) ont été ajoutés de manière ordonnée dans un flacon de 250  mL. Après avoir vigoureusement secoué les solutions combinées dans le flacon, 0,8 mL d'une solution fraîchement préparée de 0,1 M NaBH₄ a été injecté rapidement. En quelques secondes, la couleur de la solution a viré au jaune indiquant la génération de nanosphères d'argent. Au cours des heures suivantes, le flacon a été placé sous la lumière du soleil ou une lampe fluorescente jusqu'à ce que la solution devienne bleue, sans autre changement de couleur (au plus 5 h). Et la solution finale a été conservée dans un réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation ultérieure.

Le spectre d'absorbance de la solution préparée a été mesuré par un spectromètre UV-vis-NIR (UV-3600, Shimadzu, Japon) en utilisant une cuvette à chemin optique de 1 cm. Les spectres ont été collectés dans une plage de 200 à 950 nm avec une fente de 2 nm. L'analyse par microscopie électronique à transmission a été opérée sur JEM-200CX (JEOL, Japon) en plongeant la grille TEM en cuivre recouverte de carbone dans les nanoparticules de collecte dans 1 mL d'eau déminéralisée après centrifugation d'un total de 10 mL de la solution dans des microtubes de 1,5 mL à 6000 tr/min pendant 30 min à 25 °C. Un nombre total de 200 nanoplaques d'argent triangulaires ont été sélectionnées à partir des images MET pour calculer statistiquement la distribution de la taille de leurs bords.

Magnétite superparamagnétique (Fe₃ O₄ ) des nanoparticules, des nanoclusters d'or et des nanotiges d'or ont été synthétisés et caractérisés selon nos précédents rapports [31,32,33] et conservés à température ambiante.

Préparation de modèles animaux avec ligature du canal cholédoque

Des rats Wistar femelles en bonne santé (180 à 220 µg) et des souris grossières femelles (20 à 22 µg) ont été obtenus auprès de Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux lois et directives institutionnelles pertinentes. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Jiao Tong de Shanghai (NO.SYXK2007-0025). Le canal cholédoque a été ligaturé selon une méthode initialement décrite par Lee avec quelques modifications [34]. Brièvement, ces souris ont été anesthésiées au pentobarbital (25µmg/kg) et fixées sur un drap chirurgical en bois. Une incision mi-abdominale a été pratiquée et les tissus abdominaux ont été soigneusement séparés pour exposer clairement le CBD. Deux sutures chirurgicales médicales en nylon stérile (Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Shanghai, Chine), de 0,2 mm de diamètre, ont été insérées sous le CBD, et trois nœuds ont été réalisés aux deux extrémités d'un segment du CBD (Fig. 1b, c). Enfin, le CBD a ensuite été coupé entre les deux extrémités, suivi de la fermeture définitive de l'abdomen. Le 14e jour après la ligature du canal cholédoque, des échantillons de sang ont été prélevés sur chaque souris pour tester la fonction hépatique principale.

Caractérisation des nanoplaques d'argent triangulaires. un Spectre UV-vis de la solution préparée. b Image MET des nanoparticules d'argent recueillies après centrifugation. c Distribution de la taille des nanoplaques d'argent triangulaires sélectionnées (200 nanoparticules à partir de l'image MET)

Injection de nanoparticules dans la souris

Après avoir terminé la ligature du CBD, 12 souris ont été réparties au hasard en quatre groupes :groupe témoin 1, groupe de test de nanoplaques d'argent, groupe de test de nanoparticules magnétiques et groupe de test de nanoclusters d'or. Un groupe témoin supplémentaire était composé de cinq souris sans ligature CBD. Les souris des groupes témoins ont été traitées avec une injection intraveineuse de solution aqueuse de NaCl à 0,9 %, tandis que les groupes de test ont reçu une injection d'une suspension de nanoparticules telles que des nanoplaques d'argent triangulaires, des nanoparticules magnétiques, des nanotiges d'or et des nanoclusters d'or à une dose de 150 μL ( 550  μg/mL). Les quatre suspensions de nanoparticules ont été fraîchement dispersées par sonication pendant 1 min avant utilisation. Les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane à 5 % jusqu'à ce que le tonus musculaire se relâche, puis quatre types de suspensions de nanoparticules ont été injectés par voie intraveineuse à l'aide d'une seringue de 1  mL, respectivement.

Répartition des nanoparticules dans les tissus

Le septième jour après l'injection de la suspension de nanoparticules métalliques, les souris ont été anesthésiées et leurs tissus intestinaux ont été prélevés, fixés dans du formaldéhyde à 10 % pendant 24 h puis enrobés de paraffine. Un microtome rotatif Leica RM2135 a été utilisé pour préparer des coupes de 5 µm d'épaisseur des échantillons fixés. Enfin, les coupes ont été déshydratées à l'alcool et colorées à l'hématoxyline et à l'éosine. Les sections des échantillons ont été observées au microscope à contraste de phase (Olympus, RX-71, Japon).

Le septième jour après l'injection de la suspension de nanoparticules métalliques, les tissus intestinaux et les tissus gastriques ont été prélevés immédiatement après scarification des souris et ont été fixés dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5%. Les échantillons fixés ont été déshydrogénés en série dans de l'éthanol et enrobés de résine époxy. Après cela, un échantillon intestinal ultra-mince a été réalisé et observé avec un MET haute résolution (FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, États-Unis).

Le même jour, leurs tissus intestinaux ont été collectés immédiatement après le sacrifice et ont été imagés à l'aide d'un système d'imagerie in vivo (système d'imagerie IVIS-100, Caliper) couplé à une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) et à une protéine fluorescente rouge. (DsRed) filtre (Caliper Life Sciences). Les images et les mesures des signaux fluorescents ont été acquises et analysées par le logiciel Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences).

Contenu métallique des matières fécales

De plus, toutes les matières fécales de souris ont été collectées dans les 7 jours suivant l'injection, et les matières fécales ont été pesées et digérées avec de l'eau régale sous chauffage. Enfin, la teneur mentale en métal de la solution a été déterminée par un ICP-MS (Agilent 7500a, USA).

Préparation d'extraits de plantes chinoises

Des extraits de feuilles de séné 10 g, de rhubarbe 2 g et de fructus de cannabis 1 g ont été ajoutés à 100 mL d'eau, chauffés à 100 °C pendant 10 min, puis filtrés par deux couches de gaze [35]. Enfin, les filtrats ont été collectés et concentrés à 0,3 µg/mL sous pression réduite. Les extraits de feuille de séné ont été préparés comme ci-dessous et conservés à 4°C avant la réalisation des tests.

Analyse des cellules caliciformes

Premièrement, six souris mâles Kunming ont été réparties au hasard en deux groupes :le groupe témoin et le groupe diarrhée; les deux ont été traités quotidiennement avec une solution saline et des extraits de plantes chinoises pendant 7 jours par gavage oral (0,1 ml), respectivement. Le septième jour après administration par gavage, les souris ont été sacrifiées, les tissus intestinaux ont été collectés, et les tissus intestinaux et gastriques ont été congelés dans Tissue Tek OCT et sectionnés sur un cryostat Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, USA). Les coupes de 8 m ont été colorées au Bleu Alcian (1% d'Alcain Blue 8GX dans 3% d'acide acétique glacial) pendant 5 min, et ont finalement été rincées à l'eau distillée. Cet échantillon a été oxydé dans de l'acide périodique à 1% avant lavage puis traité pendant 15 min dans le réactif de Schiff. Les images des coupes de tissus ont été enregistrées à l'aide d'un microscope inversé. Les tissus gastriques ont été prélevés sur des lames chargées positivement pour une imagerie par luminescence à deux photons.

Contenu en or des tissus intestinaux et des matières fécales

Brièvement, 9 souris mâles Kunming ont été réparties dans chacun des trois groupes selon les différents traitements :groupe contrôle, groupes ligature et groupe ligature + diarrhée. Ensuite, ces souris ont reçu une injection intraveineuse de 100 μL de GNR (1 mg/mL). Le deuxième jour après l'injection dans la veine caudale, les groupes témoins et ligaturés ont été traités avec une solution saline, en même temps les groupes ligature + diarrhée ont été traités avec des extraits d'herbes chinoises. La dose du traitement a été maintenue constante et administrée quotidiennement pendant les 7 jours suivants par gavage oral (0,1 µmL). Le septième jour, les souris ont été sacrifiées, et les tissus intestinaux ont été congelés dans Tissue Tek OCT et sectionnés sur un cryostat Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, USA). Des coupes (8 μm) ont été collectées sur des lames chargées positivement pour une imagerie par luminescence à deux photons. Tous les excréments de souris ont été collectés après injection. Les matières fécales ont été pesées et digérées avec de l'eau régale sous chauffage. Enfin, le contenu mental en or de la solution a été déterminé par un ICP-MS (Agilent 7500a, USA).

Analyse statistique

Chaque expérience a été répétée trois fois en double. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne  ± SD. Les différences statistiques ont été évaluées à l'aide du t test et considéré à P < 0,05.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des nanoparticules

Des nanoplaques d'argent triangulaires ont été synthétisées par une méthode de synthèse thermique rapide, présentant une bonne solubilité dans l'eau. Plus important encore, la forme triangulaire particulière de ces nanoparticules facilite leur identification par microscopie électronique. Comme le montre la Fig. 1, dans le spectre UV-vis, les nanoparticules d'argent préparées ont montré un pic fort à 648,5  nm correspondant à la bande de plasmon de surface dipolaire dans le plan et deux pics modestes à des longueurs d'onde inférieures, correspondant à la bande dans le plan (482 nm) et hors du plan (333  nm) des résonances quadripolaires, indiquant la formation d'une architecture triangulaire [36], qui est en outre vérifiée par l'image MET des nanoparticules d'argent recueillies après centrifugation. L'image MET (Fig. 1b) a révélé que les lots préparés contenaient une sous-population de nanosphères d'argent, contribuant peut-être au pic SPR à 389 nm [36]. La longueur des bords des nanoplaques d'argent triangulaires rassemblées était de 44,3  nm avec une bonne distribution monodispersée.

Des nanoparticules magnétiques de 20 nm de diamètre et des nanoclusters d'Au de 5 nm de diamètre ont été préparées et leur caractérisation est présentée dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1 et S2 respectivement. Les images MET et les spectres UV/vis des nanotiges d'Au sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S3.

Préparation des modèles de souris de ligature CBD

La ligature du canal cholédoque (CBD) est un modèle expérimental bien connu utilisé pour induire une fibrose cholestatique hépatique [37, 38]. Ici, nous avons réalisé des expériences sur des souris avec ligature CBD afin de bloquer totalement la connexion entre HBS et tractus intestinal (Fig. 2a, b), en veillant à ce que les nanoplaques métalliques soient transportées uniquement par la circulation sanguine vers les tissus intestinaux après injection intraveineuse. Par rapport aux témoins normaux, les groupes traités ont montré une forte augmentation du diamètre et de l'épaisseur de la paroi du canal cholédoque 14 jours après la ligature du CBD en raison de la stase biliaire (Fig. 2d). De plus, comme le montre la figure 2e, les niveaux de TBIL et d'AST dans le groupe de ligature étaient significativement plus élevés que dans le groupe de contraste. Ces résultats suggèrent qu'après avoir construit avec succès le modèle de souris de ligature CBD, le canal cholédoque était absolument bloqué et que la connexion entre HBS et le tractus intestinal était complètement coupée, induisant ainsi une cholestase et une fibrose cholestatique hépatique [39].

un Une illustration schématique des relations de HBS avec le tractus intestinal. b, c Ligature du CBD (flèches blanches). d Gonflement du CBD le 14e jour après la ligature du CBD (flèche blanche). e Examen de la fonction hépatique majeure. *P < 0,05

L'effet de quatre types de nanoparticules sur les tissus intestinaux

Normalement, l'épithélium intestinal fournit une barrière semi-perméable qui permet à de petites quantités de molécules de différentes tailles et caractéristiques de traverser l'épithélium intact par des mécanismes actifs et passifs. En général, plus la molécule est grosse, moins elle a de chances de franchir cette barrière. Cependant, une fois que la muqueuse intestinale est enflammée ou endommagée, il devient plus difficile pour l'épithélium intestinal de retenir les particules étrangères et volumineuses à mesure que les espaces entre les cellules s'ouvrent [40, 41]. Considérant que les nanoparticules peuvent être à l'origine des modifications pathologiques des tissus intestinaux et de l'augmentation conséquente de la perméabilité de la paroi intestinale, ce qui conduit les nanoparticules à traverser la paroi intestinale, nous avons effectué un examen histopathologique des tissus intestinaux après avoir été exposés à quatre types différents de nanoparticules :nanoparticules magnétiques, nanoparticules triangulaires d'argent, nanotiges d'or et nanoclusters d'or. Comme le montre la figure 3, aucune différence significative n'a été observée entre les groupes témoins et les groupes de test, ni d'autres changements histologiques tels qu'un infiltrat inflammatoire [42]. Les résultats démontrent que ces nanoparticules métalliques n'ont causé aucun changement pathologique des tissus intestinaux, éliminant ainsi la possibilité que les nanoparticules s'échappent des espaces entre les cellules.

Microsection histopathologique de différents échantillons de tissus intestinaux de souris avec ligature au CBD. un Groupes témoins :souris traitées avec une injection de solution saline via les veines de la queue (panneaux supérieurs). b Groupes de test :souris traitées avec une suspension de nanoplaques d'argent triangulaire injectée via les veines de la queue (panneaux inférieurs)

Distribution de nanoparticules métalliques dans les GC intestinaux

Les GC sont un type des quatre principaux types cellulaires présents dans le tractus intestinal et sont responsables de la production et de la préservation d'une couche protectrice de mucus en synthétisant et en sécrétant des glycoprotéines de haut poids moléculaire appelées mucines, qui favorisent l'élimination du contenu intestinal et fournissent la première ligne de défense contre les blessures physiques et chimiques causées par les aliments ingérés, les microbes et le produit microbien [43, 44]. Les GC ont été facilement identifiés grâce à leur volume élevé de mucus. Comme le montre la figure 6, les nanoplaques d'argent triangulaires étaient situées à l'intérieur des GC intestinales dans tout le tractus intestinal, et les différentes phases de leur sécrétion à partir des GC ont pu être obtenues. La figure 4d montre comment certaines nanoplaques d'argent triangulaires ont été sécrétées dans l'intestin par un GC. La figure 4e montre que certaines nanoplaques d'argent triangulaires encapsulées dans le contenu de mucus des GC intestinales étaient prêtes à être sécrétées. Sur la figure 4f, il est montré comment certaines nanoplaques d'argent triangulaires ont été expulsées d'un GC, tandis que d'autres y étaient encore. À partir des images MET, nous avons constaté que certaines nanoplaques d'argent triangulaires étaient présentées en mode d'agrégation (Fig. 4 (a2, d et e), flèches vertes), tandis que d'autres étaient en mode de dispersion (Fig. 4 (a1, b1, b2, c1, c2 et f), flèches blanches). L'agrégation est un phénomène courant des nanoparticules, et elle est généralement observée lorsque leur concentration est fortement augmentée dans les cellules [45]. Au contraire, une diminution de la concentration des nanoparticules empêche leur agrégation.

Distribution de nanoplaques d'argent triangulaires dans les GC intestinales de souris avec ligature CBD. Le groupe de souris ligaturées CBD a été traité avec des nanoplaques d'argent triangulaires injectées via la veine caudale 7 jours après la ligature. GC intestinales de différents tissus intestinaux. Un Duodénum, ​​des nanoplaques d'argent triangulaires ont été présentées en mode d'agrégation (flèche verte), tandis que certaines nanoplaques d'argent triangulaires étaient en mode de dispersion (flèches blanches). B Jéjunum, nanoplaques d'argent triangulaires situées au niveau du GC intestinal (flèches blanches). C L'iléon et certaines nanoplaques d'argent triangulaires ont été excrétées, tandis que certaines étaient encore à l'intérieur. D Colon, des nanoplaques d'argent triangulaires ont été sécrétées et dans l'intestin. E , F Rectum, certaines nanoplaques d'argent triangulaires étaient prêtes à excréter (mode dispersion, flèches blanches), tandis que d'autres étaient encore à l'intérieur (mode agrégation, flèche blanche)

Des résultats similaires ont été observés pour les nanoclusters d'or, les nanoparticules magnétiques et les nanotiges d'or, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S4, S5 et S6. Ces résultats ont clairement montré que ces trois types de nanoparticules métalliques sont situées à l'intérieur des GC du tractus intestinal, ce qui soutient indirectement que ces nanoparticules métalliques peuvent être nettoyées par la voie des GC.

Bien que les GC soient répartis sur toute la ligne du tractus intestinal, leur contribution au volume épithélial total n'est pas identique. Dans l'intestin grêle des souris, la densité volumique des GC augmente progressivement du duodénum à l'iléon. Cette tendance se poursuit dans le gros tractus intestinal avec une densité de GC dans l'épithélium colique augmentant également de proximal à distal, du côlon au rectum [43]. Sur la base du fait que des nanoplaques d'argent triangulaires, des nanoparticules magnétiques et des nanoclusters d'or existaient dans les GC intestinales dans tout le tractus intestinal, et que la contribution des GC au volume épithélial total est totalement différente, nous pensons que le gros intestin peut être le principal lieu d'excrétion pour la voie d'excrétion intestinale des GC.

En raison de leur forme caractéristique, les nanoplaques d'argent triangulaires ont été facilement distinguées par imagerie TEM aux emplacements décrits dans la voie suggérée pour atteindre les GC. Cependant, bien que les nanoparticules magnétiques et les nanoclusters d'or n'aient pas pu être distingués des autres structures utilisant cette technique, le fichier supplémentaire 1 :la figure S4 révèle que le tractus intestinal du groupe de ligature du CBD contient encore une certaine quantité de nanoclusters d'or, ce qui nous amène au conclusion que le mécanisme d'excrétion de GC mentionné ci-dessus est également appliqué pour d'autres types de nanoparticules métalliques.

De plus, comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S7, les résultats de l'ICP-MS montrent clairement que ces nanoparticules peuvent toujours être sécrétées par le corps des souris ligaturées. Ces résultats ont prouvé que les cellules caliciformes des tissus intestinaux sont impliquées dans une voie importante pour l'excrétion des nanoparticules.

Mécanisme potentiel de transport des nanoparticules métalliques dans le vaisseau sanguin intestinal

Les résultats mentionnés ci-dessus démontrent que ces quatre types de nanoparticules métalliques (nanoparticules magnétiques, nanoparticules triangulaires d'argent, nanotiges d'or et nanoclusters d'or) étaient distribuées dans les GC dans tout le tractus intestinal, mais la manière dont les nanoparticules pénètrent dans les GC n'était toujours pas élucidé. Étant donné que les modèles de souris avec ligature de CBD ont été traités avec une suspension de nanoparticules métalliques par injection dans la veine caudale, ces nanoparticules ne pouvaient être transportées que par le flux sanguin dans les vaisseaux intestinaux. Comme l'a révélé l'imagerie MET, certaines nanoplaques d'argent triangulaires étaient en effet localisées dans le corpuscule sanguin (Fig. 5a, flèches blanches). De plus, des études antérieures ont révélé que des nanoparticules de petite taille peuvent être délivrées par le corpuscule sanguin dans tout le système circulatoire [46]. On peut voir sur la figure 5b que certaines nanoplaques d'argent triangulaires traversent la membrane des vaisseaux sanguins (flèches vertes), tandis que certaines nanoplaques d'argent triangulaires sont situées dans le corpuscule sanguin (flèches rouges). Par conséquent, comme le révèle la figure 8, nous déduisons que les nanoplaques d'argent triangulaires ont été transportées par les globules sanguins, puis ont été libérées dans le plasma, puis ont traversé la membrane de la paroi vasculaire des vaisseaux intestinaux et ont finalement atteint les GC.

Distribution of triangular silver nanoplates in the intestinal vessels of mice with CBD ligation. un Triangular silver nanoplates located in the blood corpuscle (white arrows). b Triangular silver nanoplates penetrated into the vascular wall (green arrows), while some located in the blood corpuscle (red arrows)

Goblet Cell Analysis Assay

Goblet cells play a key role in the excretion pathway of nanoparticles. In this study, we found that metal nanoparticles can be secreted from these goblet cells. Following this statement, if the secretion process of the goblet cells is accelerated, it would theoretically be possible that the excretion of nanoparticles will also increase. To address this, we established a diarrhea model induced by a Chinese herb used in traditional medicine. In order to explore how diarrheic processes influence the secretion of GCs, a histological analysis of the intestinal GCs was conducted. It must be acknowledged that an increased number of intestinal tissue goblet cells increases the mucin production [47]. As shown in Fig. 6, in the diarrhea groups, the total number of goblet cells in the small intestinal and the large intestinal were significantly higher compared to the controls. In addition, the percentage and number of cavitated goblet cells in the intestinal tissues were significantly higher in the diarrhea groups compared to the controls. These observations let us assert that the amount of intestinal tissue cells increases in response to diarrhea, suggesting an increased excretion by the GCs. These results are consistent with data reported previously [47].

Photomicrographs of intestinal tissue stained with Alcian Blue/Schiff’s reagent to visualize goblet cells. Images are representative of mice treated with saline (Ligation groups) and senna leaf (ligation + diarrhea groups) with arrows indicating non-cavitated goblet cell (green arrow) and cavitated goblet cell (red arrow) secreting mucin. All bars are 100 μm

Gold Contents of the Intestinal Tissues and the Feces

It has been reported that the two-photon action cross-section (TPACS) of a nanorod can reach 2320 GM, which is much higher than that of organic fluorophores and within the range of that of quantum dots, providing a promising approach to detect the distribution of the gold nanorods in biological tissues using two-photon excitation [48, 49]. In this part of the study, in order to observe the intestinal distribution of nanoparticles in the ligation groups and the ligation + diarrhea groups, two-photon luminescence of the AuNRs core was measured. As shown in Fig. 7, the gold contents of small and large intestinal were significantly higher for the ligation groups compared with those observed in ligation + diarrhea groups. The gold elemental contents in intestinal tissues were quantified by ICP-MS 7 days after tail vein injection. The gold contents of intestinal tissues were significantly higher in the ligation groups compared to that in the ligation + diarrhea groups (P  < 0.001) throughout the study (Fig. 7). These results indicate that the level of excreted nanoparticles by the goblet cells of the diarrhea groups is higher than that of any of the other groups.

Two-photon-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections at 7 days after tail vein injection of GNRs (excitation 780 nm, emission 601–657 nm)

In the next experiment, we analyzed the gold contents in the feces of mice. As shown in Fig. 8a, the gold contents of feces were significantly higher in the control group compared to that in the ligation groups or the ligation + diarrhea groups (P < 0,001). Moreover, in the ligation + diarrhea groups, the gold contents were significantly higher than in the ligation groups (Fig. 8a). These results suggest that diarrhea accelerates the process of nanoparticles being secreted by the intestinal goblets cells. Combined with quantitative analysis of gold elements in feces, we further proved that the goblet cells of intestinal tissues are involved in an important pathway for the excretion of nanoparticles.

Content of GNRs at the intestinal tissues 7 days after injection (a ), and gold element content of feces (b ) based on ICP-MS analysis. ***P  < 0.01, showing a significant difference between ligation groups and ligation + diarrhea groups

Effects of Parietal Cells on Gastric Secretion of Metal Nanoparticles

Parietal cells are mainly distributed in the bottom of the stomach and the gastric body, which secrete hydrochloric acid and internal factor. Furthermore, we found that gold nanoclusters distributed in the gastric tissues of mice with CBD ligation (Additional file 1:Figure S4B). Therefore, we hypothesized that parietal cells may be involved in the excretion of nanoparticles. As expected, from two-photon luminescence images, it was found that gold nanorods are distributed in the gastric tissues (Fig. 9a, b). In addition, as Fig. 9c, d shows, we observed that triangular silver nanoplates are distributed in the parietal cells of gastric tissue. Combined with the previous research results, we speculate that the parietal cells are involved in the secretion of nanoparticles.

Distribution of nanoparticles in the gastric tissue. (un ) et (b ):Two-photo-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections 7 days after tail vein injection of GNRs (Excitation:780 nm, Emission:601-657 nm). (c ) TEM image of the gastric parietal cells; (d ) Triangular silver nanoplates located in the gastric parietal cells (white arrows)

Conclusions

In summary, we successfully prepared and applied triangular silver nanoplates, magnetic nanoparticles, gold nanorods, and gold nanoclusters as tracking agents. Mice with CBD ligation were treated with the previously prepared nanoparticles via tail vein injection to study the gastric-intestinal tissue distribution and excretion of these nanoparticles. We also analyzed the excretion pathways of gold nanoclusters and magnetic nanoparticles. It must be stated that gold nanoclusters are mainly cleaned away via kidney urinary pathway, whereas magnetic nanoparticles are mainly removed from the organism via HBS pathway. As the excretory capabilities of kidney and HBS for in vivo applications of metal nanoparticles are very limited, the GCs and PCs excretion pathway may provide another important alternative way for the excretion of these nanoparticles. Concerning this issue, we also found that the process of nanoparticles secreted from GCs and PCs is accelerated by diarrhea, further proving that the GCs and PCs represent an important pathway for the excretion of metal nanoparticles. Admittedly, our knowledge is still limited with respect to the in vivo clearance of nanoparticles as, for example, the concrete mechanism underlying the GCs and PCs secretion pathways, and the clearance efficiency of nanoparticles in intestinal GCs, thus further investigations are urgently needed. To sum up, this novel pathway of in vivo clearance of metal nanoparticles has great potential in short-term applications such as new drug design and development, nanoparticle-based labeling and in vivo tracking, and biosafety evaluation of in vivo nanoparticles.

Abréviations

CBD:

Common bile duct

CCD:

Charge-coupled device

GCs:

Goblet cells

GNRs:

Gold nanorods

HBS:

Hepato-biliary

PCs:

Parietal cells

System Fe₃ O₄ :

Superparamagnetic magnetite

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TPACS:

Two-photon action cross-section