La charge de surface gouverne la complexation nanoparticules de pullulane–albumine sérique humaine et la libération contrôlée de médicaments

Résumé

La conception de nanoparticules repose sur la façon dont la chimie de surface régit l'adsorption des protéines dans la circulation sanguine. Nous avons synthétisé trois polymères à base de pullulane : pullulane modifiée au cholestérol (CHP), pullulane animée modifiée CH (CHAP) et pullulane carboxylée modifiée CH (CHSP), et formé des nanoparticules par dialyse. La diffusion dynamique de la lumière a révélé que la taille des particules variait avec le nombre de groupes chargés : CHP (73,1 nm, −0,698 mV), CHAP (116,9 nm, +12,9 mV) et CHSP (156,9 nm, −15,4 mV). La calorimétrie de titration isotherme a montré des profils thermodynamiques distincts pour la liaison à l'HSA : constantes de liaison (K_b) de 1,41 × 10⁴, 27,7 × 10⁴ et 412 × 10⁴ M⁻¹ pour CHSP, CHP et CHAP respectivement, reflétant l'influence de la charge de surface. Les analyses de fluorescence et de dichroïsme circulaire ont confirmé que l'HSA subit une réduction de l'hélice α lors de la complexation, le CHP induisant le plus grand changement conformationnel. Les études de libération de médicament in vitro utilisant la mitoxantrone ont démontré que l'adsorption d'HSA ralentit nettement la libération : après 48 h, CHSP–HSA a libéré 35,8 %, CHP–HSA 33,9 % et CHAP–HSA 32,5 %, contre 53,7 %, 58,5 % et 63,2 % pour leurs homologues de nanoparticules libres. Ces résultats soulignent que la taille des nanoparticules, la charge de surface et la formation de couronne protéique dictentcritiquement la cinétique de libération du médicament et, par extension, l'efficacité thérapeutique.

Contexte

L'administration ciblée de médicaments par nanoparticules s'est imposée comme une pierre angulaire de l'oncologie moderne, offrant une libération soutenue et une toxicité systémique réduite (1–3). Pour qu'une nanoparticule (NP) atteigne le tissu tumoral, elle doit naviguer dans la circulation sanguine, traverser l'endothélium vasculaire, pénétrer la matrice extracellulaire et entrer dans les cellules cancéreuses (4–6). L'adsorption des protéères — particulièrement des protéines plasmatiques à haute abondance telles que l'albumine sérique humaine (HSA) — forme une « couronne protéique » qui peut altérer la biodistribution des NP, l'absorption cellulaire et la libération du médicament (10–14). La composition de la couronne est déterminée par la concentration en protéines, l'affinité des NP et les propriétés de surface, incluant la charge, l'hydrophobicité et la taille (15–19).

La pullulane, un polysaccharide neutre, peut être chimiquement modifiée pour introduire des groupes cholestérol hydrophobes, produisant des polymères amphiphiles qui s'auto-assemblent en NP cœur-coquille. Des travaux antérieurs ont montré que la pullulane modifiée au cholestérol (CHP) peut encapsuler des médicaments anticancéreux et que l'HSA se lie au CHP via des interactions hydrophobes (28–31). Partant de cela, nous avons conçu deux variantes supplémentaires : la pullulane animée modifiée CH (CHAP) portant des groupes amino et la pullulane carboxylée modifiée CH (CHSP) portant des groupes carboxyle. Ces modifications permettent d'explorer systématiquement comment la charge de surface influence l'adsorption des protéines et la libération du médicament.

Méthodes

Matériaux

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-imidazole, éthylènediamine, anhydride succinique et autres réactifs étaient de grade analytique.

Synthèse du CHP, CHSP et CHAP

Le CHP a été préparé par estérification de la pullulane avec le succinate de cholestérol (CHS) dans le DMSO, suivi de purification (Fig. 1). Le CHAP a été obtenu en faisant réagir le CHP avec le N,N-diimidazole et l'éthylènediamine ; le CHSP a été synthétisé par couplage à l'anhydride succinique. La confirmation structurale a été réalisée par FTIR et RMN ¹H, donnant des degrés de substitution au cholestérol de 4,5 % (CHP), 7,8 % (CHSP) et 14,1 % (CHAP) (Fig. 2–3).

Préparation et caractérisation des NP

Les nanoparticules ont été formées par dialyse des polymères dans le DMSO contre l'eau, suivie de filtration (0,45 µm). La taille et le potentiel zêta ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DDL). Les NP CHP, CHAP et CHSP présentaient des diamètres moyens de 73,1 nm, 116,9 nm et 156,9 nm, avec des potentiels zêta de −0,698 mV, +12,9 mV et −15,4 mV respectivement (Fig. 4).

ITC

La calorimétrie de titration isotherme a quantifié la thermodynamique de la liaison de l'HSA à chaque type de NP à 25 °C (Fig. 5). Une liaison exothermique a été observée pour CHP et CHSP, tandis que CHAP a présenté une phase exothermique initiale suivie d'une liaison endothermique, reflétant l'interaction des forces hydrophobes et électrostatiques.

Spectroscopie de fluorescence

La fluorescence de l'HSA (excitation 280 nm, émission 290–450 nm) a été surveillée après mélange avec chaque type de NP. L'analyse de quenching utilisant une équation de Stern-Volmer modifiée a donné des constantes de liaison de 2,02, 2,99 et 4,72 × 10⁵ M⁻¹ pour CHSP, CHP et CHAP respectivement, indiquant l'interaction la plus forte pour le CHAP chargé positivement.

Analyse par dichroïsme circulaire

Les spectres CD (200–250 nm) ont évalué les changements dans la structure secondaire de l'HSA lors de la liaison aux NP. Le contenu en hélice α a diminué de 55 % (HSA libre) à 48–52 % pour les complexes, avec la réduction la plus marquée pour CHP–HSA (Fig. 8).

Libération de médicament in vitro

La mitoxantrone (MTO) a été encapsulée dans chaque NP par dialyse. Les profils de libération ont été mesurés dans du PBS à 37 °C, avec et sans HSA (0,1 mg/mL). Le médicament libre a libéré 99,8 % en 4 h. Pour les NP seules, les taux de libération à 48 h étaient de 53,7 % (CHP), 58,5 % (CHAP) et 63,2 % (CHSP). La présence d'HSA a réduit ces taux à 33,9 % (CHP–HSA), 32,5 % (CHAP–HSA) et 35,8 % (CHSP–HSA) (Fig. 9).

Résultats

Caractérisation des polymères CHP, CHSP et CHAP

Les spectres FTIR ont confirmé la fonctionnalisation réussie : pics carbonyl d'ester à 1731 cm⁻¹ pour CHP, pics amide à 1648 cm⁻¹ pour CHAP et pics carboxyle à 1710 cm⁻¹ pour CHSP (Fig. 2). L'analyse RMN a quantifié les degrés de substitution (Tableau 1).

Propriétés des NP CHP, CHSP et CHAP

La taille et la charge de surface ont directement influencé l'auto-assemblage des NP : le CHSP chargé négativement et le CHAP chargé positivement ont formé des particules plus grandes (156,9 nm et 116,9 nm) comparé au CHP neutre (73,1 nm). Les potentiels zêta reflétaient les groupes fonctionnels incorporés (−15,4 mV, +12,9 mV, −0,698 mV). La présence de groupes chargés a perturbé l'empilement du cœur, produisant des structures plus lâches et plus grandes (Fig. 4).

Analyse thermodynamique

Les données ITC (Tableau 2) ont révélé une liaison exothermique pour CHP (ΔH = 42,8 kJ mol⁻¹) et CHSP (ΔH = 80,4 kJ mol⁻¹), et un profil exo-endo mixte pour CHAP (ΔH = 22,4 kJ mol⁻¹). Les changements d'entropie suggéraient une liaison plus facile de l'HSA au CHP et CHAP (ΔS = 0,251 kJ mol⁻¹ K⁻¹ et 2,775 kJ mol⁻¹ K⁻¹) qu'au CHSP (ΔS = 0,201 kJ mol⁻¹ K⁻¹).

Spectroscopie de fluorescence

Le quenching de fluorescence a confirmé une phase d'adsorption rapide suivie d'une formation de complexe plus lente. Les constantes de liaison dérivées de l'analyse de Stern-Volmer correspondaient aux résultats ITC, soulignant le rôle dominant de l'électrostatique pour CHAP et de l'hydrophobicité pour CHP (Fig. 7).

Analyse du spectre CD

Les mesures CD ont montré une perte progressive d'hélice α lors de la complexation : CHP–HSA est tombé à 48,0 %, CHAP–HSA à 48,6 % et CHSP–HSA à 52,0 % (Fig. 8). La réduction d'hélicité la plus rapide est survenue pour CHP, cohérente avec son cœur compact et densément empilé.

Libération de médicament

L'adsorption d'HSA a systématiquement ralenti la libération du médicament pour tous les types de NP. La hiérarchie des taux de libération (48 h) correspondait à la séquence de taille et charge de surface des NP : CHSP > CHAP > CHP pour les NP libres, et CHSP–HSA > CHP–HSA > CHAP–HSA pour les complexes liés aux protéines (Fig. 9). Ces résultats mettent en évidence comment la couronne protéique module les voies de diffusion et de dégradation.

Discussion

Nos données confirment que la charge de surface est un facteur décisif dans la formation de la couronne d'HSA et la libération subséquente du médicament. Le CHAP chargé positivement a formé le complexe NP–HSA le plus fort, attribuable à l'attraction électrostatique combinée et à l'ancrage hydrophobe. En revanche, le CHSP chargé négativement a exhibé la liaison la plus faible, limitée par la répulsion de charge et une coquille plus poreuse qui a ralenti la migration de la protéine vers le cœur. Le CHP neutre occupait une position intermédiaire, affichant la plus haute couverture d'HSA due à son cœur compact et hydrophobe.

Ces interactions influencent le devenir in vivo des NP chargées de médicament. Une couronne protéique dense peut entraver la traversée endothéliale, altérer la distribution organique et réduire l'absorption cellulaire (15–18). En ajustant la charge de surface, nous pouvons moduler la composition de la couronne et ainsi affiner la pharmacocinétique et les fenêtres thérapeutiques.

Conclusions

Nous avons conçu avec succès trois nanoparticules à base de pullulane avec des charges de surface distinctes. La taille, la charge et l'hydrophobicité ont collectivement gouverné l'adsorption d'HSA, la force de liaison et la cinétique de libération du médicament. Le CHAP chargé positivement a exhibé la liaison protéique la plus forte et la libération de médicament la plus lente, tandis que le CHP neutre a montré la plus haute couverture protéique mais la libération la plus rapide parmi les NP libres. Ces insights fournissent un plan pour concevoir des nanovecteurs avec des profils de couronne protéique adaptés afin d'optimiser l'administration ciblée et la libération contrôlée.

Abréviations

EDX

Spectroscopie par dispersion d'énergie des rayons X

SEM

Microscope électronique à balayage

TEM

Microscopie électronique à transmission

XRD

Diffraction des rayons X