Formation de complexes nanoparticules-HSA à base de pullulane et libération de médicaments influencées par la charge de surface

Contexte

Le système d'administration de nano-médicaments, tels que les nanoparticules (NP) chargées de petits médicaments antitumoraux moléculaires, a des propriétés de libération de médicaments soutenues et contrôlées ainsi qu'un effet de ciblage. La thérapie ciblée avec les NP est devenue une priorité dans le traitement des tumeurs, car elles peuvent réduire considérablement les effets secondaires des médicaments et améliorer l'efficacité des médicaments [1,2,3].

Les NP chargées de médicaments doivent emprunter trois voies pour atteindre le site cible, à savoir la circulation sanguine, la voie tissu-cellule et le mouvement intracellulaire [4,5,6]. Ils doivent également franchir la barrière vasculaire pour atteindre le tissu ciblé, puis la barrière membranaire cellulaire pour atteindre la cellule ciblée [7, 8]. L'adsorption et l'échange de protéines sont impliqués dans toutes les voies des NP. Enfin, les NP adsorbées sur les protéines atteignent les cellules cibles et libèrent les médicaments [1, 9].

Les protéines à forte abondance telles que l'albumine sérique humaine (HSA), les lipoprotéines et la globuline sont généralement adsorbées à la surface des NP chargées de médicament, modifiant ainsi le comportement de libération in vivo et les sites de ciblage des NP [10]. Le nombre et le type de protéines adsorbées sont étroitement liés à la concentration de protéines dans le plasma et à l'affinité des NP [11]. Plus la concentration en protéines plasmatiques est élevée, plus l'adsorption en surface de la NP est importante [12]. Une protéine à haute affinité peut remplacer celle à faible affinité [13]. Par conséquent, la surface de la NP est occupée par la protéine à forte concentration et à forte affinité, formant une couronne de nano-protéines [14]. Les couronnes en nano-protéines sont indispensables au fonctionnement in vivo des NPs [15]. Par exemple, si la surface est modifiée avec du polysorbate, les NP peuvent délivrer le médicament à travers la barrière hémato-encéphalique jusqu'au tissu cérébral [16]; Les nanomatériaux polysaccharidiques modifiés hydrophobes peuvent interagir avec la HSA dans le corps, améliorant ainsi le contrôle de la libération du médicament [17].

L'absorption des NP par les cellules est affectée par divers facteurs tels que les propriétés physiques et chimiques des NP, la concentration de nano-médicaments, l'adsorption des protéines et l'adhésion cellulaire [18]. Les types et les quantités d'adsorption de protéines affectent la fonction des NP, y compris le contrôle et le ciblage de la libération des médicaments. De plus, les propriétés physiques et chimiques des NP, telles que la taille des particules, la charge et l'hydrophobie de surface, affectent l'adsorption des protéines [19]. La nature de la NP décide de son sort au cours du processus in vivo [20]. Les matériaux macromoléculaires amphiphiles tels que les polymères polysaccharidiques modifiés de manière hydrophobe peuvent être auto-assemblés en particules de taille nanométrique. La taille de la NP joue un rôle important dans ses fonctions de ciblage et de contrôle de la libération du médicament [21]. Le groupe hydrophobe dans le polymère est une force motrice pour la formation de la structure nucléaire du NP. Plus le degré de substitution du groupe hydrophobe est élevé, plus le NP est petit [22]. Les matériaux polymères avec des groupes carboxyle, des groupes amino et leurs dérivés sont impliqués dans l'auto-assemblage des NP, ils affectent donc la taille des NP et fournissent une charge de surface pour se fixer facilement à la protéine avec une charge opposée [23]. Les NP avec des charges de surface différentes ont une capacité différente d'adsorption des protéines et différentes fonctions biologiques [24]. Par conséquent, nous devons explorer l'interaction entre les différents composants de surface des NP et des protéines.

La HSA est la protéine la plus abondante dans le sang. Il est essentiel pour le transport, la distribution et le métabolisme des substances étrangères et endogènes. De nombreux médicaments à petites molécules pénètrent dans le corps et forment des adsorbants HSA dans le transport sanguin, ce qui modifie les effets pharmacologiques des médicaments [25]. Les NP chargées de médicaments sont combinées avec la HSA après avoir pénétré dans le corps ; en raison de la structure complexe des NP, les caractéristiques d'adsorption diffèrent de celles des combinaisons HSA à petites molécules [26]. Par exemple, l'adsorption de médicaments à petites molécules aux molécules de HSA est rapide; cependant, l'adsorption de la HSA sur les NP est lente et complexe [27].

Les nanoparticules de CHP en tant que transporteur de médicaments ont été étudiées pendant longtemps, ce qui a montré d'excellents nanomatériaux pour l'administration de médicaments [28, 29]. Dans une expérience précédente, nous avons étudié l'interaction entre la HSA et les NP de pullulane avec différents degrés de substitution du cholestérol, le pullulane modifié hydrophobe (CH) cholestérique (CHP), et avons trouvé principalement deux processus :la HSA rapidement attachée à la surface de la NP puis lentement insérée dans le noyau hydrophobe des NPs [30]. Les interactions hydrophobes ont joué un rôle majeur dans la formation des complexes CHP-HSA [31]. L'hydrophobie et la structure enveloppe-noyau des particules étaient principalement responsables des changements de conformation de l'albumine au cours de l'interaction NP et HSA [30].

Dans cette étude, nous avons fabriqué trois NP, le CHP, le pullulane animé modifié par CH (CHAP) et le pullulane carboxylé modifié par CH (CHSP). Leur structure et leurs propriétés ont été caractérisées par infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et RMN, et leurs tailles et potentiels ont été déterminés par diffusion dynamique de la lumière (DLS). La calorimétrie de titrage isotherme (ITC) et la spectroscopie de fluorescence ont été utilisées pour étudier les caractéristiques d'interaction des complexes NP-HSA et les effets des trois types de NP sur la structure de la HSA. Nous révélons les effets sur la libération de médicaments avec les propriétés des complexes NP-HSA, ce qui est vital pour l'application future du système de libération de médicaments.

Méthodes

Matériaux

La HSA a été achetée auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). N ,N -L'imidazole provenait de la biotechnologie des solutions mères de Shanghai (Shanghai). L'éthylènediamine, l'anhydride succinique a été fourni par Tianjin Star Chemical Reagent (Tianjin). Tous les autres réactifs chimiques étaient de qualité analytique et provenaient de Changsha Huicheng Co. (Changsha, Chine).

Synthèse de CHP, CHSP et CHAP

Synthèse de la cogénération

Le succinate de cholestérol (CHS) a été synthétisé comme décrit précédemment [32]. Une quantité de 2 g de pullulane polysaccharide a été dissoute dans 10 ml de solution de diméthylsulfoxyde (DMSO) déshydraté. Ensuite, 1,06 g de CHS, 0,505 g d'EDC•HCl et 0,268 g de DMAP ont été dissous dans une quantité appropriée de solution de DMSO. Les deux groupes de réactifs ci-dessus ont été mélangés et activés à température ambiante pendant 1 h puis incubés dans un bain d'huile chauffé à 50 °C pendant 48 h. Une fois la réaction arrêtée et refroidie à température ambiante, une quantité appropriée d'éthanol anhydre a été ajoutée et le solide blanc a été précipité par agitation et obtenu par des filtrations par aspiration répétées. Les produits ont été lavés avec une quantité appropriée d'éthanol anhydre, d'éther éthylique et de tétrahydrofurane, puis séchés dans un séchoir à air pulsé à 50 °C pour devenir un solide blanc (Fig. 1).

Synthèse des polymères CHP, CHSP et CHAP

Synthèse de CHAP

Une quantité de 1,80 g de cogénération et 1,00 g de N ,N -diimidazole ont été dissous dans 100 ml de DMSO. Après chauffage et agitation dans un bain d'huile à 50 °C pendant 4 h, 3,60 g d'éthylènediamine ont été ajoutés, suivis d'un chauffage supplémentaire et d'une agitation pendant 24 h. Lorsque le liquide de réaction a refroidi à température ambiante, il a été dialysé dans un sac de dialyse d'interception 4000 avec de l'eau bidistillée pendant 1 jour, puis lyophilisé pour obtenir un solide jaune clair qui était le produit de pullulane animé modifié de manière hydrophobe.

Synthèse de CHSP

Une quantité de 1,80 g de CHP a été dissoute dans 100 ml de DMSO déshydraté, puis 0,5 g d'anhydride succinique et 0,05 g de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) ont été dissous dans 10 ml de DMSO activé pendant 1 h; après chauffage et agitation dans un bain d'huile à 50 °C pendant 20 h, la réaction a été arrêtée. Lorsque le liquide réactionnel s'est refroidi à température ambiante, il a été placé dans une quantité appropriée d'éthanol anhydre et agité pour précipiter un solide blanc. Le solide blanc a été lavé plusieurs fois avec une quantité appropriée d'éthanol anhydre, d'éther diéthylique et de tétrahydrofurane et séché dans un séchoir à air comprimé à 50 °C. Le produit obtenu était un polysaccharide pullulane carboxylé modifié de manière hydrophobe.

Spectroscopie FTIR et RMN

Les spectres FTIR pour CHP, CHSP et CHAP ont été obtenus sous forme de pastilles KBr pour la spectroscopie FTIR (Nicolet NEXUS 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les structures chimiques de CHP, CHSP et CHAP ont été confirmées par 500 MHz ¹ H-RMN, avec le DMSO-d6 comme solvant. Le degré de substitution du cholestérol dans les polymères CHP a été déterminé par la liaison glycosidique alpha-1,4 et alpha-1,6 et l'aire du pic de méthylène.

Préparation et caractérisation des NP

Les NPs CHP, CHSP et CHAP ont été préparées par la méthode de dialyse [33]. Brièvement, CHP, CHSP et CHAP ont été dissous dans 10 ml de DMSO. Pour former les NP, la solution de mélange a été injectée dans un sac de dialyse pendant 24 h pour éliminer le DMSO. La solution de CHP, CHSP et CHAP NPs a été tamisée avec un filtre à membrane (taille des pores 0,45 m, Millipore, Boston, MA, USA) pour éliminer les plus gros agrégats de CHP, CHSP et CHAP NPs. La distribution de taille et le potentiel zêta des particules obtenues ont été déterminés par DLS (Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, UK) à 11,4 V/cm, 13,0 mA.

ITC

Une certaine concentration de solution de HSA a été versée goutte à goutte sur les solutions de CHP, CHSP et CHAP NP, et le changement de chaleur a été mesuré par ITC (VP-ITC, Microcal, Northampton, MA, USA). Une quantité de 0,9 mM de HSA a été injectée dans des cellules de titrage 0,01 mM de CHP, CHSP et CHAP NP, pour titrer 20 fois. La première goutte était de 2 L, et le temps de réaction était de 180 s; les gouttes restantes étaient de 10 L par goutte et le temps de réaction était de 210 s, et la température était fixée à 25 °C. Les paramètres thermodynamiques et les courbes de connexion ont été obtenus avec 28 fois de titrage.

Spectroscopie de fluorescence

Les NPs HSA et CHP ont été mélangées à un rapport moléculaire HSA/CHP de 3,6:1 pour préparer des mélanges CHP-HSA, CHSP-HSA et CHAP-HSA. Les mélanges obtenus ont été placés dans des tubes EP de 2 ml et secoués à 20 tr/min à 25 °C pendant 24 h. Les spectres de fluorescence et l'intensité de fluorescence (FI) de la HSA libre et de la HSA liée au NP ont été enregistrés par spectrophotométrie de fluorescence (Shimadzu RF-4500, Japon). Le chromophore tryptophane dans la molécule HSA a été excité à 280 nm, et les spectres d'émission ont été enregistrés à 290 à 450 nm. Les largeurs de fente d'excitation et d'émission étaient de 5 et 12 nm.

Sept solutions de NP à différentes concentrations ont été mélangées avec une solution de HSA. Les solutions mélangées ont été transférées dans des tubes EP de 2 ml pour une réaction de 9 heures. Les échantillons obtenus ont été collectés pour mesurer les spectres de fluorescence à une longueur d'onde de 290 à 450 nm. Les spectres de fluorescence de la solution pure de HSA ont été utilisés comme référence pour déterminer les constantes de liaison selon l'analyse de Stern-Volmer. Les données d'extinction de fluorescence ont été analysées en utilisant l'équation de Stern-Volmer améliorée [34] :

où K _q est la constante d'extinction de Stern-Volmer, F ₀ et F sont des intensités de fluorescence à 342 nm en absence et en présence d'extincteur, et [Q ] est la concentration d'extincteur.

Analyse du dichroïsme circulaire

Les complexes CHP-HSA ont été préparés de deux manières différentes. Le premier (complexe I) a été préparé en mélangeant simplement des solutions de HSA et de CHP. Le second (complexe II) a été conservé dans des tubes EP de 2 ml, qui ont été placés dans une table à secousses à 20 tr/min pendant 12 h à 25 °C. Les spectres de dichroïsme circulaire (CD) pour la HSA libre et les NP ajoutées à la protéine ont été enregistrés à une longueur d'onde de 200 à 250 nm en utilisant un spectromètre CD (JASCO J-810, Japon) à 37 °C avec une cellule de cuvette de 0,1 cm. La concentration de HSA était de 1,0 mg/mL dans tous les échantillons. La teneur relative en hélice dans HSA a été calculée comme suit [35] :

où θ ₂₀₈ est l'ellipticité moyenne des résidus (deg cm ⁻² dmol ⁻¹ ) à 208 nm, θ est l'ellipticité, M est le poids moléculaire de la HSA, C est la concentration de HSA (mg/mL), L est la longueur de la cellule de la cuvette (cm), et N _r est le nombre d'acides aminés dans la molécule HSA.

Drogue Libération In Vitro

Les NP chargées de mitoxantrone (MTO) ont été préparées par une méthode de dialyse [36]. La courbe standard de la mitoxantrone a été acquise par spectrophotométrie UV. La charge de médicament et l'efficacité d'encapsulation ont été calculées comme décrit [33]. La libération de MTO a été étudiée in vitro par dialyse dans une solution saline tamponnée au phosphate. En bref, la solution de NP chargées de MTO (2 mg/mL) a été placée dans un tube de dialyse Visking et dialysée contre le milieu de libération à 37 ° C dans un agitateur à bain d'air à 50 tr/min. A des moments prédéfinis, le média de libération a été collecté et le média de libération frais a été ajouté. La quantité libérée de MTO a été déterminée par spectrophotométrie UV (UV-384 plus, Molecular Devices, USA) à 608 nm. Le pourcentage de libération accumulé (Q %) a été calculé comme décrit précédemment [37]. Une certaine quantité de solution de HSA (0,1 mg/mL) a été ajoutée au tube de dialyse pour déterminer la libération de médicament de trois types de NP.

Résultats

Caractérisation des polymères CHP, CHSP et CHAP

Spectres FTIR

La figure 2 montre les spectres FTIR pour CHP, CHSP et CHAP. Les données pour les spectres CHP étaient de 1731 cm ⁻¹ (–C=O pic de vibration d'étirement) et 1161 cm ⁻¹ (–C=O pic de vibration d'étirement). Ce résultat démontre la formation de liaisons ester sur le pullulane, indiquant que le CHP a été synthétisé avec succès.

Spectres FTIR de CHP (a), CHAP (b) et CHSP (c)

Par rapport aux spectres CHP, les données pour les spectres CHAP étaient de 1648 cm ⁻¹ (–C=O pic d'absorption des vibrations), 1734 cm ⁻¹ (–C=O pic d'absorption des vibrations), 1539 cm ⁻¹ (–N–H pic de vibration de flexion) et 3 742 cm ⁻¹ (–NH₂ pic de vibration d'étirement). Selon ces pics caractéristiques, il y avait des liaisons amide sur CHP, et CHAP a été synthétisé avec succès par la réaction d'estérification.

Par rapport aux spectres CHP, les données pour les spectres CHSP étaient de 1710 cm ⁻¹ (–C=O pic de vibration d'étirement), 1158 cm ⁻¹ (–C=O pic de vibration d'étirement), 1560 cm ⁻¹ (double –C=O pic de vibration de couplage), et 1421 cm ⁻¹ (–O–H pic de vibration de flexion). Cela montre qu'il y avait des groupes carboxyle sur CHP et une partie d'entre eux sont devenus des sels.

¹ RMN H

La figure 3 montre le ¹ Spectres RMN H pour CHP, CHSP et CHAP. Un total de 0 à 2,40 ppm appartenait au signal hydrogène du cholestérol, ce qui démontrait la synthèse réussie de la cogénération. Les pics caractéristiques du DMSO-d6 et méthylène (–CH₂ CH₂ –) a montré des signaux à 2,49 et 2,53 ppm, respectivement. Par rapport au CHP, le CHAP montrait des signaux à 8-9 ppm, qui appartenaient au groupe amino et prouvait que l'éthylènediamine était greffée sur le CHP. Le degré de substitution du cholestérol pour 100 unités de glucose dans la cogénération pourrait être calculé par le rapport des protons de méthylène aux protons de sucre avec l'équation suivante [38] :

¹ Spectres HNMR pour les NP CHP (a), CHSP (b) et CHAP (c)

où A _2,53 δ est l'aire du spectre sous le pic d'absorption caractéristique du méthylène (hydrogène), et A _4,74 δ et A _5,01 δ sont la zone du spectre sous les pics d'absorption caractéristiques pour les liaisons glycosidiques alpha-1,6 et alpha-1,4, respectivement.

Du ¹ Spectres RMN H en CHP, le degré de substitution du succinate de cholestérol (CHS) était de 4,50 %. Pour les NP CHSP, les groupes méthylène (–CH₂ CH₂ –) comprenait deux aspects :l'anhydride succinique et le CHS. Le degré de substitution était de 12,34 % pour les groupes méthylène (–CH₂ CH₂ –) et 7,84 % pour les groupes carboxyle. Pour les NP CHAP, les groupes méthylène (–CH₂ CH₂ –) comprenait deux aspects :l'éthylènediamine et le CHS. Le degré de substitution était de 18,6 % pour les groupes méthylène (–CH₂ CH₂ –) et 14,1% pour les groupes aminés.

Propriétés des NP CHP, CHSP et CHAP

Les polymères amphiphiles peuvent être auto-assemblés par dialyse pour former des NP noyau-enveloppe avec une enveloppe hydrophile et un noyau hydrophobe, qui peuvent être chargés de médicaments anticancéreux pour former des NP chargées de médicaments. Les propriétés des NP telles que la charge de surface et la taille ont joué une influence vitale sur l'efficacité du traitement en tant que vecteur de médicament [39, 40]. La distribution des tailles et le potentiel zêta des NP CHP, CHSP et CHAP mesurés par DLS sont présentés sur la figure 4. La taille moyenne des NP était de 73,1, 116,9 et 156,9 nm pour CHP, CHAP et CHSP, respectivement. Le potentiel zêta était respectivement de − 0,698, + 12,9 et − 15,4 mV (tableau 1).

Potentiel zêta (a ) et la distribution des tailles (b ) des NP de cogénération ( ), CHAP NP ( ) et les NP CHSP ( )

Pour les NP pullulanes avec le même groupe hydrophobe, la taille était plus grande pour les CHSP chargées négativement et CHAP chargées positivement que pour les NP CHP neutres. Ainsi, le groupe chargé interfère avec le comportement d'auto-assemblage des NP, formant des NP de plus grande taille avec une structure lâche en solution aqueuse. Les potentiels zêta des NPs CHP, CHAP et CHSP étaient respectivement de − 0,698 mV, + 12,9 mV et − 15,4 mV. Ainsi, les groupes amino et carboxyle du polymère pourraient créer des NP avec des charges de surface différentes et ainsi modifier les propriétés de surface.

Analyse thermodynamique

L'analyse thermodynamique a été réalisée à l'aide de l'ITC avec titrage HSA aux solutions CHP, CHSP et CHAP NP. En tant que titrage HSA en solution de pullulane NP avec différentes charges, nous avons déterminé les changements de chaleur, en ajustant les propriétés de connexion de trois types de matériaux, la connexion et le nombre de connexions de molécules. Le spectre original du thermomètre de titrage isotherme reflète le changement de chaleur. Le pic vers le haut indique une réaction de libération de chaleur et le pic vers le bas indique une réaction d'absorption de chaleur [41, 42]. Lorsque les NP de CHP, CHAP et CHSP ont été titrées avec de la HSA, la chaleur libérée par la combinaison a progressivement diminué au fil du temps (Fig. 5). Dans l'ensemble, 26 gouttes de solution de HSA ont été titrées dans une solution de CHP NP, et les pics du spectre étaient ascendants, indiquant la nature exothermique de la réaction. Le même phénomène a été observé lorsque la solution de HSA a été titrée dans la solution de CHSP NP. Cependant, lorsque la solution de HSA a été titrée dans la solution de CHAP NP, les pics du spectre pour les quatre premières gouttes étaient vers le haut, tandis qu'à partir de la cinquième goutte, les pics se sont tournés vers le bas, indiquant une réaction endothermique. L'absorption HSA des NPs CHP et CHSP était exothermique, donc la réaction était spontanée. L'absorption HSA des NP CHAP était partiellement endothermique et partiellement exothermique, ce qui peut être lié à la charge positive de CHAP.

Données calorimétriques de titrage isotherme pour le titrage HSA dans a CHP, b CHSP, et c CHAP NPs à 25 °C. La concentration de NP dans la cellule (250 L) était de 12 M et la concentration de protéines dans la seringue était de 230 M. Les graphiques supérieurs montrent les données brutes et les graphiques inférieurs montrent les chaleurs intégrées

La valeur d'enthalpie reflète la chaleur dégagée par la combinaison de HSA et de NP. Les changements d'enthalpie des NPs CHP, CHSP et CHAP par HSA étaient respectivement de 42,827, 80,3712 et 22,3951 KJ/mol (tableau 2). Combinée au changement d'enthalpie, à la réaction exothermique, à la structure chimique des NP amphiphiles et à la charge négative de la HSA, l'interaction hydrophobe peut principalement entraîner l'interaction de la HSA avec les NP CHP et CHSP. Il est à noter que dans le titrage HSA de CHAP, la chaleur comprenait une valeur négative. Les molécules de HSA contiennent une poche hydrophobe qui peut être combinée avec le centre hydrophobe du NP [43], de sorte que l'interaction déclenchée par les quatre premières gouttes de HSA et de CHAP est principalement entraînée par des forces hydrophobes. Bien que le HSA soit chargé négativement et que le CHAP soit chargé positivement, à partir de la cinquième goutte, il existe également une force de charge entre le HSA et le CHAP en raison de la nature endothermique de la réaction.

La valeur du changement d'entropie peut refléter la difficulté de la réaction entre HSA et NPs. Les entropies des NPs HSA et CHP, CHSP et CHAP étaient respectivement de 0,251, 2,775 et 0,201 KJ/mol K (tableau 2). lier à HSA.

La couverture des NPs HSA et CHP, CHSP et CHAP était respectivement de 1,17, 0,404 et 0,845. La concentration de NP est calculée en fonction de la concentration du polymère plutôt que du nombre de particules. Nous ne savons pas combien de particules de polymère contiennent une seule NP, nous ne pouvons donc pas déterminer exactement quelle quantité de chaque NP est adsorbée par la HSA, mais sur la base de la valeur de couverture, nous pouvons conclure que les NP de cogénération ont la plus forte adsorption de HSA.

Dans des expériences précédentes, nous avons montré que la valeur d'affinité, K _A , reflète la force de la force de liaison entre les NP et la HSA [32]. Plus l'hydrophobie des NPs CHP est forte, plus l'affinité est forte [44]. La constante de liaison de HSA et CHP était de 27,7 × 10 ⁴ M ⁻¹ , celui de HSA et CHSP était de 1,41 × 10 ⁴ M ⁻¹ , et celle de HSA et CHAP était de 412 × 10 ⁴ M ⁻¹ . Ainsi, la combinaison de HSA et de CHAP chargée positivement était la plus forte, suivie par la CHP chargée neutre et la CHSP chargée négativement. La combinaison la plus forte de HSA et CHAP peut être attribuée à la force hydrophobe, à une attraction mutuelle de la force de charge et probablement à une charge mutuellement exclusive entre HSA et CHSP.

Spectroscopie de fluorescence

Avec des spectres de fluorescence, nous avons étudié l'interaction entre la HSA et les trois NPs avec des charges de surface différentes. La HSA contient 585 résidus d'acides aminés, avec un seul résidu Trp à 214 (Trp214), et son spectre de fluorescence domine dans la région UV. Lorsque d'autres molécules interagissent avec la HSA, le spectre de fluorescence de Trp peut changer, en fonction de l'interaction entre la HSA et d'autres molécules. Lorsque les trois NP ont été mélangées avec de la HSA, le pic d'émission maximal du spectre de fluorescence de la HSA n'a pas subi de déplacement chimique; seule l'intensité a été affaiblie dans une certaine mesure (Fig. 6A). Le pic d'émission maximum de HSA a été observé lorsque HSA combiné avec CHAP NPs.

Un Spectres de fluorescence pour HSA (1,5 × 10 ^− 5 mol/L) sans (a) et avec (b) CHSP, (c) CHP et (d) CHAP NPs avec la même concentration (4,2 × 10 ^− 6 mol/L). B Intensité des émissions HSA avec les NP CHSP, CHP et CHAP à 343 nm au fil du temps

Une étude expérimentale a montré que la combinaison de HSA et de NP pullulanes présentait un processus complexé [45]. Nous avons ajouté les trois NP dans la solution de HSA et avons constaté que l'intensité de fluorescence des trois complexes NP-HSA diminuait progressivement (Fig. 6B). L'équilibre a été atteint pour HSA-CHSP à 556,3 nm après 12 h, pour CHP-HSA à 534,3 nm après 10 h et pour CHAP-HSA à 512,3 nm après 8 h. Le temps nécessaire pour équilibrer l'intensité de fluorescence des différents complexes NP-HSA est lié à la charge portée par la NP. Le temps le plus long nécessaire pour atteindre l'équilibre a été observé sur CHSP-HSA chargé négativement, suivi par CHP-HSA non chargé.

La réduction rapide de l'intensité de fluorescence initiale des trois complexes NP-HSA (montrée sur la figure 6A) est due à l'adsorption rapide des NP et de la HSA. L'intensité de fluorescence subséquente montre une lente diminution jusqu'à l'état constant car l'interaction des NP avec la HSA est un lent processus de combinaison. L'intensité de fluorescence constante reflète l'état de saturation de la complexation. L'interaction entre les trois NP de charge différente et la HSA a subi un processus de recombinaison rapide précoce et un processus de recombinaison lent plus tard. La combinaison de HSA chargée négativement et de CHSP chargée négativement a nécessité un temps plus long pour atteindre la saturation complexe par rapport à la CHP non chargée. La combinaison HSA chargée négativement et CHAP chargée positivement a nécessité le temps le plus court pour atteindre la saturation complexe.

La figure 7A-C montre les spectres de HSA combinés à différentes concentrations de NP CHSP, CHP et CHAP pour former des complexes NP-HSA. Avec l'augmentation de la concentration de NP, le pic d'absorption maximal du complexe NP-HSA a diminué, montrant une corrélation inverse.

Spectres de fluorescence de HSA (1,5 × 10 ^− 5 mol/L) avec CHSP (A ), CHP (B ) et CHAP (C ) à différentes concentrations (a) 0, (b) 2,07 × 10 ⁻⁷ , (c) 3,31 × 10 ⁻⁷ , (d) 4,14 × 10 ⁻⁷ , (e) 8.28 × 10 ⁻⁷ , (f) 20,7 × 10 ⁻⁷ , (g) 33,1 × 10 ⁻⁷ , et (h) 41,4 × 10 ⁻⁷ mol/L. D Parcelles (n = 7) pour F ₀ /(F ₀ − F) vs 1/[Q ], Q est la concentration de CHSP (–◆–), CHP (–■–) et CHAP (–▲–), respectivement

Le CHAP-HSA chargé positivement a affiché le temps le plus court pour atteindre l'équilibre.

Nous avons utilisé une équation de Stern-Volmer modifiée pour analyser les données d'extinction de fluorescence :

$$ {F}_0/\gauche({F}_0-F\right)=1/{f}_{\mathrm{a}}+1/\gauche({f}_{\mathrm{a}} {K}_{\mathrm{q}}\left[Q\right]\right) $$

où f _un est la fraction de contact de la substance fluorescente avec l'extincteur, K _q est la constante d'extinction de Stern-Volmer, F ₀ est l'intensité de fluorescence à 342 nm sans l'extincteur, F est l'intensité de fluorescence à 342 nm avec l'extincteur, et [Q ] est la concentration d'extincteur.

À partir de l'image fonctionnelle de F ₀ /(F ₀ − F ) paire 1/[Q ], on peut obtenir les valeurs de f _un et K _q de la pente et de l'interception (Fig. 7D). Assuming that the observed fluorescence intensity changes mainly due to the interaction between NPs and HSA, the quenching constant can be seen as a binding constant for the formation of complexes. The binding constants for HSA and CHSP, CHP, and CHAP molecules were 2.02, 2.99, 4.72 × 10 ⁵ M ⁻¹ , respectivement. In the previous study, we discussed the interaction between HSA and CHP NPs with different hydrophobicity substitutions [30]. The hydrophobic interaction between HSA molecules and CHP cholesterol played an important role in the formation of CHP–HSA. The greater the hydrophobic substitution of CHP, the greater the binding constant of CHP and HSA.

In the present study, we found that the value of the binding constant (K _b ) is related to the electrical properties of the NP. A surface with a positive charge, such as CHAP, has the largest K _b , and a surface without a charge, such as CHP, has the second largest K _b . The K _b for CHSP, with a negative charge, was the lowest. Therefore, in addition to the hydrophobic interaction between NPs and HSA, the electrostatic interaction between them also plays an essential part in the formation of NP–HSA complexes.

In addition, the f _un values for CHSP, CHP, and CHAP NPs were 0.269, 0.288, 0.38, respectively, so part of the Trp residue was involved in this reaction. Furthermore, the amount of HSA was too much at a given NP/HSA concentration, so free HSA molecules presented in the reaction system.

CD Spectrum Analysis

Figure 8A shows the CD spectra (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. There are two negative bands at 208 and 222 nm of the UV region in HSA spectra, which are the characteristic peaks of the α -helical structure. The α -helical content of free HSA was 55%. At the beginning of the complex, with the recombination of HSA and CHSP, CHAP, and CHP NPs, the α -helical content of HSA was reduced to 52.0%, 48.57%, and 48.0%, respectively.

Un CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. B CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. C Ellipticity at 208 nm for HSA interacting with CHSP (–▲–), CHAP (–●–) and CHP (–■–) over time

Figure 8C shows that the ellipticity changes of the three samples at 208 nm over time. The ellipticity of HSA combined with CHAP and CHP NPs increased from 0 to 12 h and leveled off at 12 h, but that of HSA with CHSP NPs increased faster, i.e., the ellipticity increased from 0 to 9 h and leveled off at 9 h. Therefore, the ellipticity of the three samples gradually increased over time and the α-helical content gradually decreased; when the ellipticity maintained constant, the recombination of the sample and HSA was completed.

Figure 8C illustrates that the fastest surface absorption rate was presented on the combination of CHSP and HSA. The size, charge, and hydrophobicity of NPs can influence the migration rate of HSA to the center of NPs. The surface of CHP is not charged, the surface of CHSP is negatively charged, and the surface of CHAP is positively charged. Owing to the presence of the negative-charge mutual exclusion between CHSP and HSA, the resistance of HSA migrating to the CHSP NP center becomes larger. The traction of NPs on HSA is driven by the hydrophobic interaction forces. The traction of the three NPs on HSA is identical, so the lowest velocity of HSA migrating to the center of NPs was observed on the combination of HSA and CHSP NPs. Because the particle size is in the order of CHSP> CHAP> CHP, the particle density displays a reverse order, i.e., CHSP

The ITC results show that the amount of HSA migrating toward the center of CHSP NPs is the smallest but with the fastest speed compared with other types of NPs. Table 3 shows that the α-helix content of HSA migrating toward the center of CHP NPs was the lowest. The more the secondary structure of HSA was damaged, the faster the HSA migrated toward the center. The fastest speed was observed on HSA migrating to the center of CHSP NPs (Fig. 8C).

Figure 8B shows CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. After the complexation is completed, the α -helical content of HSA recombined with CHSP, CHAP, and CHP was reduced to 46.27%, 44.55%, and 42.91%, respectively (Table 3). With the increase in interaction time, the secondary structure of HSA was changed and the α -helical content was reduced during the process of complexation with NPs.

Drug Release

We measured the drug release rate of MTO with the three kinds of drug-loaded NPs and drug-loaded NP–HSA complexes. The drug release for free MTO was about 99.8% at 4 h (Fig. 9). The release rate in 48 h for CHP, CHAP, and CHSP NPs was 53.68%, 58.54%, and 63.24%, respectively. The drug release from all NPs was fast in the first 8 h, which was a burst release process, and the drug release remained stable after 12 h, which was a sustained release process. In vitro drug release from NPs is not affected by gastrointestinal pH and enzymes, and the dissolution of nanomaterials results in little drug release. The release is mainly determined by dissolution and diffusion [46]. The 48-h drug release rate was in the order of CHSP> CHAP> CHP, corresponding to the size of NPs. The fastest release rate was found on CHSP, which was negatively charged with the largest size. The second fast drug release rate was found on which was positively charged with the size smaller than CHSP. CHP was electrically neutral, and its drug release rate was minimal. Hence, the polymer surface groups involved in the formation of NPs affect the size of NPs and ultimately the drug release of NPs.

Mitoxantrone (MTO) release of pullulan NPs in phosphate-buffered saline (PBS) at 37 °C in vitro (□:free mitoxantrone, ○:CHP, △:CHAP, ▽:CHSP, ◁:CHAP–HSA,◇:CHP–HSA, ▷:CHSP–HSA)

The drug release rate from the combinations of HSA and CHAP, CHP, and CHSP in 48 h was 32.45%, 33.86%, and 35.76%, respectively. After the combination of NPs and HSA, the drug release in 48 h was significantly decreased as compared with HSA-free NPs, which was mainly attributed to the resistive effect and adsorption effect of HSA. At 48 h, the drug release of the compounds was in the order of CHSP–HSA> CHP–HSA> CHAP–HSA, while the drug release of HSA-free NPs was in the order of CHSP> CHAP> CHP. Although NP–HSA compounds showed significantly slow drug release, the total release of CHP-HSA decreased by 21.23% in 48 h, whereas the total release of CHAP-HSA decreased by 25.68% and that of CHSP-HSA by 28.48%. The drug release of the NPs is related to the size of the NPs and the polymer hydrophobic groups on NP surface. The adsorption of HSA can lead to significant slowdown in drug release, which is related to the hydrophobicity of NPs and also to the surface charge of NPs [46]. The adsorption of HSA is closely related to the size of the NPs and the degree of substitution of the hydrophobic groups of the polymer during the self-assembly process. Nevertheless, the drug release of the NPs is ultimately determined by the properties of the NP itself.

Discussion

As shown in Fig. 10, the formation of the NP–HSA complex is driven by a hydrophobic force between cholesterol groups of the particle core and the aromatic amino acid of the hydrophobic domain of HSA. After mixing, HSA interacts with the surface cholesterol unit and is rapidly adsorbed to the NP surface. Then, the adsorbed HSA on the NP surface is processed because of the hydrophobic forces derived from the cholesteric unit in the particle core. When overcoming the steric hindrance of polysaccharide chains in the NP shell, the adsorbed HSA gradually migrates to the core. After the hydrophobic interaction and resistance of the hydrophilic polysaccharide chain are balanced, the HSA molecule enters the particle core to become hydrophobically bound to cholesterol groups to form the NP–HSA complex.

Adsorption of HSA to NPs

For CHAP and CHSP NPs, the recombination of HSA is a complex process also subjected to the charge interaction with HSA under the traction of the hydrophobic driving force. The binding constants of the three kinds of NPs with the same hydrophobic substitution and different surface charge were in the order of CHAP> CHP> CHSP. The electrical properties also play a major part in the formation of NP–HSA. In this process, the formation of the CHSP–HSA complex was blocked by the structure of the NP shell and the repulsive force between the negative charges, which led to their loose connection. During the rapid adsorption and slow recombination, the degree of spiraling of HSA is lower for CHSP NPs than CHP NPs and CHAP NPs. Therefore, the surface charge of NPs not only changes the nature of the particles themselves but also affects the protein complex.

In the current study, we investigated the effect of NP surface charge on the interaction between NPs and proteins (Fig. 10). Three different charges of pullulan NPs with HSA adsorption still showed rapid adsorption and slow recombination. The number of HSA molecules with positively charged CHAP complex was the most, including rapid adsorption of NP–HSA by hydrophobic forces, HSA molecule migration to the center, and the HSA molecules adsorbed on the surface of NPs by charge action. CHP- and CHSP-adsorbed HSA molecules were mainly distributed in the hydrophobic center of NPs, with CHSP adsorbing fewer HSA molecules. The adsorbed number of HSA molecules is related to the hydrophobicity of NPs. The greater the degree of substitution of hydrophobicity, the more HSA is adsorbed [41]. The cholesterol substitutions of the three NPs were the same, and the number of HSA molecules adsorbed by positively charged NPs was the highest, so the adsorption of NPs and HSA was related to the hydrophobicity and surface charge of the NPs.

The surface adsorption capacity between NPs and HSA is also related to the hydrophobicity and charge of NPs. The binding force between HSA and NPs is determined by the hydrophobicity, surface charge, size, and structure of NPs. The α-helicity was decreased most at the beginning of adsorption and the complete CHP–HSA complex. CHP NP has the smallest size and highest density. The CHP NPs migrated toward the center by the hydrophobic traction; the sugar chain of the CHP NP shell was larger to inhibit the migration toward the center. The extension of the peptide chain of HSA is larger, with the α -helix decreased the most. Although CHAP NPs have hydrophobic and charge forces, they possess relatively large size, loose structure, small resistance in the periphery, small extension of the peptide chain, and small content of the α -helix. Some HSAs remained on the surface of NPs through the charge force of adsorbing, and the α -helical content is also smaller in this part of the HSA. The α -helix content of CHAP decreased less than that of CHP, mainly due to the peptide chain extension-induced central pulling force which led to α-helix content decline. During the process of the CHSP and HSA complexation, the role of the central pulling force has a reverse direction of the charge force, thereby resulting in weakening the center of the migration force. CHSP NPs are larger than CHAP NPs, and the structure of CHAP NPs is loose. Because the adsorbed number of HSA on CHAP is higher than that on CHSP, the decrease of α -helicity in CHSP is less than that in CHAP NPs. Therefore, the interaction between NPs and HSA and the decrease in α -helicity are all related to the size, density, hydrophobicity of substitution, surface charge of the NPs, and number of HSA connections.

After the NPs enter into the blood, protein adsorption affects the functions of NPs, such as the slow and controlled drug release, the travel from the blood circulation passing through the vascular barrier, targeting tissue, and entering cells. NPs interact with the HSA in the body and affect the in vivo behavior of NPs. The number of adsorbed proteins is closely related to the properties of the NPs. HSA adsorbs NPs, which affects the distribution in organs and removal of NPs, thereby altering the concentration of the drug in the body and the efficacy of the drug.

Finally, the properties of NPs, such as size, hydrophobicity, and surface charge, affect the drug release of NPs in vivo. We can design specific materials to perform specific functions with specific protein adsorption.

Conclusions

In this study, three kinds of nano-drug carriers were constructed, CHP, CHSP, and CHAP. The size, charge, drug loading properties of NPs, interaction between NPs and HSA, and drug release were all closely related to charge amount and charge type of nanomaterials. With the same degree of substitution of hydrophobicity, CHAP NPs with larger amino substitutions were the largest, CHSP NPs the second largest, and CHP NPs the smallest. The size and surface charge of the NPs were essential to the coverage of HSA, the binding constant, and the slow drug release. The positively charged CHAP binding constant was the strongest, showing the fastest drug release, and CHP NPs had the highest coverage. The combination of HSA further retarded the drug release of NPs. CHAP NPs adsorbed HSA had the slowest drug release rate.

Abréviations

CH:

Cholesteric hydrophobically

CHAP:

CH-modified animated pullulan

CHP:

Cholesteric hydrophobically (CH) modified pullulan

CHSP:

CH-modified carboxylated pullulan

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide

HSA:

Human serum albumin

K _b :

The binding constant

MTO:

Mitoxantrone

NP :

Nanoparticule