Capteur à oxyde de titane pour la nanodétection précoce du cancer de la tête et du cou

Résumé

Le cancer de la tête et du cou est une maladie hétérogène, provenant des cellules squameuses tapissant le larynx, la bouche, le pharynx, la cavité nasale et les glandes salivaires. Un diagnostic au stade avancé réduit considérablement le taux de survie. Il est donc impératif d'identifier ce cancer aux stades précoces avec un biomarqueur adapté. L'antigène carcinome squameux (SCC-Ag) est un biomarqueur tumoral circulant sérique, dont le taux élevé chez les patients est fortement corrélé au volume tumoral. Cette recherche vise à détecter et quantifier le SCC-Ag sur un capteur à électrodes interdigitées (IDE) modifié par l'oxyde de titane (TiO₂) via un anticorps anti-SCC-Ag. La détection a été réalisée à 100 fM, améliorée à 10 fM lors de la conjugaison de l'anticorps avec des nanoétoiles d'or (GNS), soit une amélioration 10 fois supérieure. Cette sensibilité accrue est 1000 fois supérieure à d'autres substrats. L'analyse de spécificité avec deux protéines de contrôle montre que l'anticorps ne reconnaît que le SCC-Ag, confirmant la détection spécifique sur la surface IDE-TiO₂.

Introduction

Le cancer de la tête et du cou, sixième cancer le plus fréquent dans le monde avec plus de 644 000 nouveaux cas par an, se développe au niveau de la gorge, bouche, muqueuses, épithélium de la cavité buccale, glandes salivaires et cavité nasale. La plupart des patients sont diagnostiqués aux stades avancés, compromettant leur survie. L'identification précoce est cruciale. Les marqueurs tumoraux sériques sont utilisés pour le diagnostic et le suivi. Les cellules squameuses libèrent l'antigène carcinome squameux (SCC-Ag), élevé chez les patients cancéreux et marqueur prometteur pour les cancers squameux (gynécologiques, poumon, œsophage, anal). Des taux élevés de SCC-Ag sont associés à métastases, récidives et mortalité. Une corrélation existe entre le taux de SCC-Ag et le volume tumoral. Quantifier le SCC-Ag permet d'identifier l'état du cancer pour un traitement précoce. Cette recherche se concentre sur la détection du SCC-Ag à bas niveau par nanoparticules sur capteur IDE via anticorps anti-SCC-Ag.

L'IDE est un biocapteur électrochimique prometteur : faible coût, portable, sensible, utilisé en surveillance environnementale et diagnostic médical. L'amélioration des propriétés électriques de la surface de détection améliore la détection des biomolécules. Les nanomatériaux sont largement utilisés : taille réduite, grande surface, bonne conductivité thermique/électrique, biocompatibilité. Deux approches : fonctionnalisation de surface ou conjugaison de l'analyte. L'or est un nanomatériau établi dans divers capteurs (plasmon de surface, guide d'onde, électrochimique, colorimétrie). L'oxyde de titane (TiO₂), semi-conducteur écologique et peu coûteux à large bande interdite, est utilisé ici pour la modification de surface sur IDE. Ses propriétés électriques/optiques élevées le destinent aux supercondensateurs, photocatalyse, conversion photoélectrique. Sa nature hydrophile et grande surface favorisent la modification de surface et la détection de biomolécules à bas niveau. Ici, le TiO₂ enduit la surface IDE pour améliorer le flux électrique lors de l'interaction biomoléculaire. Pour améliorer la détection, l'anticorps est conjugué aux nanoétoiles d'or (GNS) et immobilisé sur la surface TiO₂. Les biomolécules conjuguées à l'or offrent une stabilité accrue et une orientation optimale, améliorant la limite de détection. De plus, plus d'anticorps peuvent être immobilisés sur une seule particule d'or, attirant plus de molécules cibles. Deux nanomatériaux sont utilisés : TiO₂ (modification de surface) et GNS (conjugaison anticorps) pour améliorer la détection du SCC-Ag sur IDE. Le GNS, par sa grande surface, capture plus d'anticorps.

Matériaux et Méthodes

Réactifs et Biomolécules

Antigène SCC (glycoprotéine 45-55 kDa) de Randox Life Sciences (Malaisie). Anticorps anti-SCC de Next Gene (Malaisie). APTES, éthanolamine, albumine (protéine sanguine majeure 45 mg/mL, 66,5 kDa), PBS (pH 7,4), isopropoxyde de titane IV de Sigma Aldrich (USA). Serpine (inhibiteur de protéase sérine 40-50 kDa) de Sino Biological (Chine). Nanoétoiles d'or synthétisées selon Shan et al. Tous réactifs stockés selon recommandations.

Fabrication des Électrodes Interdigitées

Le design et la fabrication d'IDE suivent un protocole antérieur. Wafer de silicium nettoyé, électrode aluminium déposée par gravure humide. Photoresist positif déposé, oxydation thermique. Dépôt d'aluminium par photolithographie en trois étapes (1200 tr/min 10 s, 3500 tr/min 20 s, 500 tr/min 10 s). Exposition UV pour transférer le motif IDE. Développeur RD-6 15 s. Photoresist pour éliminer zones non exposées. Cuisson 100 °C pour éliminer l'humidité et améliorer l'adhérence SiO₂/Al. Gravure aluminium 23 s, nettoyage acétone. Surface finale modifiée par TiO₂. Observation microscopie haute puissance et profilomètre 3D (×50).

Revêtement TiO₂ sur Surface IDE

Solution TiO₂ déposée sur IDE fabriqué. Isopropoxyde de titane IV comme précurseur. Éthanol + isopropoxyde titane, agitation vigoureuse 5 min. Stabilisateur (100 µL acide acétique) ajouté sous agitation, chauffage 85 °C. Ratio molaire 9:1:0,1 (éthanol:TIP:acide acétique). Après 3 h mélange, solution claire. Vieillissement 24 h, dépôt par centrifugation 2000 tr/min sur substrats SiO₂. Séchage 15 min à 175 °C, recuit 1 h à 450 °C. Trois couches pour épaisseur suffisante.

Préparation GNS-Anticorps Anti-SCC-Ag

Anticorps SCC-Ag immobilisé sur GNS via lien 16-mercaptoundécanoïque (16-MDA). 5 mM 16-MDA + 100 µL GNS, 30 min température ambiante. Centrifugation 13 000×g, 5 min. Pellet or activé par EDC (400 mM) et NHS (50 mM) ratio 1:1, 15 min température ambiante. Centrifugation pour éliminer EDC/NHS libres. Pellet GNS activé + 200 nM anticorps SCC-Ag, 1 h température ambiante. Centrifugation pour éliminer anticorps libres. Conjugué conservé à 4 °C. Confirmation par spectroscopie UV-Vis (480-560 nm, pics maximaux).

Immobilisation GNS-Anticorps sur Surface TiO₂-IDE

Surface TiO₂-IDE modifiée en amine par APTES pour immobiliser GNS-anticorps. APTES 3% (dans 30% éthanol) déposé 3 h température ambiante. Lavage 3× éthanol 30%. Activation EDC/NHS comme ci-dessus. Anticorps ou GNS-anticorps déposé 1 h. Lavage 5× PBS pour éliminer anticorps non fixés. Surfaces modifiées utilisées pour détection SCC-Ag et comparaison. Surface GNS-anticorps-TiO₂ analysée par AFM, MET à émission de champ, EDX. AFM échelle 5 µm, SEM 100 nm, 15 kV. Éléments identifiés par EDX.

Détection Antigène SCC sur Surfaces Anticorps/GNS-Anticorps

Surfaces anticorps/GNS-anticorps bloquées par 1 M éthanolamine (masquage zones sans anticorps) 30 min température ambiante. 1 nM SCC-Ag interagit, réponses courant notées avant/après. Pour limite de détection : titration SCC-Ag 10 fM à 1 nM déposées individuellement, réponses courant notées. Triplicatas, statistiques calculées. Balayage tension linéaire 0-2 V, pas 0,01 V. LOD = concentration la plus faible (ligne d'étalonnage basses concentrations) vs bruit de fond (S/N = 3:1), soit LOD = écart-type baseline + 3σ.

Détection Sélective SCC-Ag

Vérification interaction sélective SCC-Ag/anticorps via deux protéines contrôle : serpine et albumine. 1 nM chacune déposée sur surfaces anticorps/GNS-anticorps, changements courant notés avant/après. Comparaison avec détection spécifique SCC-Ag. Contrôles additionnels : SCC-Ag avec GNS seul, SCC-Ag avec surface TiO₂-IDE enduite anticorps non-immun marqué GNS. Triplicatas, statistiques. Balayage 0-2 V, pas 0,01 V.

Résultats et Discussion

Le cancer tête/cou décrit comme tumeurs développées dans/autour nez, bouche, larynx, sinus. Diagnostic précoce et traitement avec biomarqueur adapté obligatoires pour améliorer survie. SCC-Ag biomarqueur sérique adapté ; expériences de détection/quantification sur capteur IDE-TiO₂ par anticorps. TiO₂ améliore réponse courant lors interaction biomolécules. Comparé autres nanomatériaux, TiO₂ attractif capteur électrochimique : comportement actif surface le long électrodes, amélioration activité électrocatalytique, plus grande stabilité surface, répétabilité réponse électrode, amélioration limite détection par augmentation pic courant. Revêtement TiO₂ sur IDE (IDE-TiO₂) améliore flux courant. Nanomatériau GNS pour immobiliser anti-SCC-Ag sur IDE-TiO₂ et améliorer limite détection. Biomolécules conjuguées or immobilisées surface améliorent détection cible. Surface GNS plus grande que nanoparticules sphériques or. Idée mise en œuvre : GNS pour améliorer sensibilité.

Caractérisation Surface et Immobilisation GNS-Anticorps

Figure 1 : représentation schématique détection SCC-Ag sur surface IDE-TiO₂. Figure 1a : surface IDE enduite TiO₂, anticorps immobilisé avec/sans conjugaison GNS. Figure 1b : conjugaison GNS-anticorps confirmée UV-Vis. Décalage pic 535→545 nm après immobilisation, confirmant conjugaison. Surface fabriquée observée morphologiquement. Figure 2a : microscopie haute puissance. Figure 2b : image profilomètre 3D. Profils clairs zones gap/électrodes (doigts). Arrangement gaps/doigts uniforme/intact.

Comparaison Immobilisation Anticorps et GNS-Anticorps sur Surfaces TiO₂-IDE

SCC-Ag détecté sur surface TiO₂-IDE par surfaces anticorps/GNS-anticorps immobilisés. Fixation GNS sur TiO₂ confirmée AFM, SEM, EDX (Figure 2c). AFM : discrimination claire TiO₂ (sombre) et GNS (clair). Soutenu par SEM/EDX : pics or proéminents, titane modérés. Preuve présence GNS sur TiO₂. Figure 3 : processus immobilisation anticorps/GNS-anticorps sur surfaces IDE-TiO₂ modifiées amine. Surface TiO₂-IDE : courant 4,65E-12 (Fig 3a). Après APTES : 5,37E-11 (incrément = modification amine). Immobilisation anticorps : 5,375E-11 → 1,05E-9 (différence 1,04E-9). Interaction chimique groupe amine APTES et COOH anticorps. Changements courant confirment liaison. Éthanolamine 1 M couvre surface résiduelle (réduction biofouling). De même GNS-anticorps : 4,41E-12 → 1,23E-9 (Fig 3b). Réponse plus élevée avec GNS-anticorps : plus d'anticorps liés par GNS unique et liaison forte complexe sur surface amine. Liaison : groupe amino-terminal APTES déplace groupes citrate sur GNS, fixation chimique surface APTES-IDÉ. Détection biomolécules dépend : affinité liaison molécules interactives et immobilisation surface adéquate. Immobilisation biomoléculaire élevée améliore drastiquement détection cible bas niveau. GNS utilisé pour immobiliser anti-SCC-Ag sur IDE-TiO₂ pour augmenter liaison anticorps, menant détection SCC-Ag efficace.

Détection Comparative SCC-Ag sur Surface IDE-TiO₂ par Anticorps/GNS-Anticorps

GNS-anticorps montre immobilisation efficace sur IDE-TiO₂. 1 nM SCC-Ag détecté sur les deux surfaces, comparaison changements courant. Figure 4a : détection 1 nM SCC-Ag surface anticorps. Après blocage éthanolamine (courant 4,65E-12), ajout 1 nM SCC-Ag → 1,33E-09. Changements courant indiquent liaison SCC-Ag/anticorps. Surface GNS-anticorps : éthanolamine 1,33E-11 → 1,62E-09 après 1 nM SCC-Ag (Fig 4b). Changements courant plus élevés avec GNS-anticorps pour même concentration. Causes : plus grand nombre d'anticorps liés sur surface IDE-TiO₂ via GNS.

Limite Détection SCC-Ag sur Surface IDE-TiO₂ par Anticorps/GNS-Anticorps

Surfaces anticorps/GNS-anticorps montrent détection claire SCC-Ag, limite détection estimée sur les deux pour comparaison (Figure 5a,b). Concentrations 10 fM à 1 nM SCC-Ag diluées, déposées individuellement, changements courant notés. Figure 5a : concentrations SCC-Ag sur surface anticorps. Après éthanolamine, 10 fM : pas de changement. 100 fM : changement mineur 4,65E-12 → 6,54E-11. Concentrations 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM : courants 4,69E-10, 7,91E-10, 8,78E-10, 1,33E-09. Augmentation concentration = augmentation liaison. LOD calculée 3σ = 100 fM (Fig 6a).

Mêmes concentrations SCC-Ag sur surfaces GNS-anticorps. 10 fM : changement courant clair 1,33E-11 → 3,74E-11. 10 fM détectable avec GNS-anticorps, pas avec anticorps seul. Concentrations 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM : courants 4,69E-10, 9,23E-10, 1,41E-09, 1,48E-09, 1,62E-09 (Fig 5b). Écarts-types ±0,1-0,15×10⁻⁹ A. Surface GNS-anticorps montre changements plus élevés à toutes concentrations (Fig 6b). LOD 3σ = 10 fM (Fig 6a), 10 fois meilleure que surface anticorps seul. Précédemment, SCC-Ag évalué sur nanomatériaux (nanoparticules strontium, graphène) : sensibilité ~1000 fois inférieure à cette étude.

Détection Sélective SCC-Ag sur Surfaces Anticorps/GNS-Anticorps

Détection sélective SCC-Ag comparée deux protéines contrôle : serpine et albumine (abondantes dans sang). Serpine : inhibiteur protéase, fonctions physiologiques. Albumine : 45 mg/mL, 50-70% protéines sériques. Figure 7a : 1 nM chaque protéine contrôle et SCC-Ag déposées individuellement surfaces anticorps/GNS-anticorps. Changements courant uniquement avec SCC-Ag dans les deux cas : anticorps ne reconnaît que SCC-Ag, détection spécifique. Pas changements significatifs avec protéines contrôle. Expérience confirme détection/diagnostic spécifique SCC-Ag. Contrôles additionnels : SCC-Ag avec GNS seul, SCC-Ag avec surface TiO₂-IDE enduite anticorps non-immun-GNS. Pas changements significatifs vs interaction spécifique (Fig 7b).

Conclusion

Le cancer tête/cou affecte bouche, gorge, glandes salivaires. Diagnostic avec biomarqueur adapté obligatoire pour traitement nécessaire et amélioration qualité de vie. SCC-Ag biomarqueur important ; détecté sur surface IDE enduite TiO₂ (IDE-TiO₂). Anticorps SCC-Ag immobilisé sur IDE-TiO₂ détecte SCC-Ag. Limite détection 100 fM, améliorée 10 fois (10 fM) par conjugaison anticorps avec nanoétoiles or (GNS-anticorps). Amélioration due à plus grand nombre d'anticorps liés sur surface amine-TiO₂ via GNS. Expériences contrôle avec deux protéines : non reconnues par anti-SCC-Ag, détection sélective confirmée. Surface IDE-TiO₂ démontrée aide diagnostic cancer tête/cou, stratégie pour détection précoce.