Réglage de la chimie de surface du polyétheréthercétone par revêtement d'or et traitement au plasma

Contexte

L'un des problèmes du vieillissement humain est l'usure des articulations, qui est liée à une forte augmentation de l'abondance de diverses affections du système squelettique et articulaire, notamment les fractures, les dégénérescences vertébrales, l'arthrite et les tumeurs osseuses. Les chirurgies orthopédiques utilisant des implants artificiels sont actuellement la principale méthode utilisée pour le renouvellement structurel et fonctionnel des os et des articulations endommagés. Les matériaux couramment utilisés pour les implants orthopédiques sont en particulier les métaux, les céramiques, les polymères et les composites. Les implants métalliques (par exemple, en or) sont largement utilisés dans la pratique clinique soit comme remplacements permanents (par exemple, remplacements de la hanche, dents artificielles) soit comme prothèses temporales (par exemple, disques, charnières, vis et tiges utilisés pour réparer les fractures). Les métaux sont privilégiés en raison de leur résistance mécanique, de leur résistance à l'usure et de leur non-toxicité [1,2,3]. En revanche, leur résistance mécanique élevée et leur faible élasticité sont incompatibles avec le tissu squelettique humain. Cela pourrait avoir un impact négatif sur un implant osseux, ce qui peut entraîner l'absorption d'un tissu osseux adjacent et la libération de l'implant. Les polymères tels que le polyéthylène à poids moléculaire ultra-élevé (UHMWPE), le polytétrafluoréthylène (PTFE), le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polylactide (PLA), le polyglycolide (PGA) et le polyhydroxybutyrate (PHB) sont largement utilisés dans diverses applications biomédicales. Mais seul un nombre limité de polymères ont été utilisés comme substituts osseux ou articulaires, car ils ont tendance à être trop flexibles et faibles pour répondre aux exigences imposées aux implants orthopédiques mécaniques [4, 5].

Le polyétheréthercétone (PEEK) est un polymère thermoplastique aromatique polycyclique linéaire semi-cristallin synthétisé pour la première fois en 1978 [6]. Le PEEK est couramment utilisé comme matériau pour les espaceurs intervertébraux et les vis à os [7, 8]. En raison de sa structure chimique spéciale, le PEEK présente une résistance élevée aux changements chimiques et physiques [6, 9, 10] ; de plus, il résiste à l'usure et est stable à haute température [6]. De plus, la biocompatibilité du PEEK a été prouvée à la fois in vitro et in vivo et il ne provoque aucun effet toxique ou mutagène [11,12,13]. Son gros avantage est une élasticité similaire à celle d'un os humain, ce qui permet une répartition équilibrée du poids entre un implant et un os; par conséquent, il n'y a pas d'effet de protection contre le stress après l'implantation. Cependant, le PEEK présente des propriétés hydrophobes et bioinertes, qui ne sont pas favorables à l'adsorption des protéines et à l'adhésion cellulaire [14, 15]. Ainsi, afin d'améliorer ces propriétés, la surface du PEEK doit être modifiée.

Les caractéristiques de surface des matériaux peuvent être ajustées par diverses techniques [16]. L'une de ces méthodes est la modification d'une surface de biopolymère par plasma, qui utilise du gaz ionisé produit dans un système de réacteur fermé contenant du gaz sous basse pression et un appareil d'excitation électromagnétique de gaz. Par rapport aux techniques humides, la modification par plasma d'une surface de biopolymère est avantageuse pour la flexibilité chimique. Les particules réactives générées électromagnétiquement interagissent avec la surface du biopolymère dans un réacteur, provoquant une modification de ses propriétés physiques et chimiques. Les propriétés mécaniques, électriques et optiques du matériau en vrac, pertinentes pour son application, restent inchangées [17], ce qui est avantageux dans la conception, le développement et la fabrication de polymères biocompatibles. Une autre méthode utilisée pour améliorer les propriétés de surface du polymère est la pulvérisation cathodique. L'intégration de nanoparticules d'or dans un film mince est importante pour diverses applications, par exemple l'ingénierie tissulaire et la détection biologique [18]. La taille des nanoparticules influence le comportement et les propriétés de surface de la surface du matériau (par exemple, la densité, le paramètre de réseau, les propriétés électriques et optiques) [19]. En particulier, les nanoparticules inférieures à 100 nm améliorent souvent l'adhésion et la prolifération cellulaires [20].

L'objectif de ce travail était de former des nanostructures sur PEEK par traitement plasma et dépôt d'or pour améliorer l'adhésion et la prolifération cellulaires, en particulier des fibroblastes embryonnaires de souris (L929). Les caractéristiques de surface (polarité, chimie de surface et structure) avant et après traitement ont été évaluées par diverses techniques (gravimétrie, goniométrie, spectroscopie photoélectronique aux rayons X et analyse électrocinétique). En outre, la microscopie à force atomique a été utilisée pour examiner la morphologie et la rugosité de la surface du PEEK. Les résultats sont discutés dans le contexte d'applications biomédicales potentielles, principalement pour une utilisation possible dans la construction d'implants rachidiens et d'autres remplacements pour l'orthopédie et la traumatologie.

Méthodes

Matériaux et modifications

Une feuille de PEEK (l'épaisseur de 50 μm, la densité de 1,26 g cm ⁻³ , fourni par Goodfellow Ltd., Royaume-Uni) a été utilisé pour toutes les expériences. Tous les échantillons PEEK (circulaire, ø = 2 cm) ont été traités par plasma qui a été suivi d'un revêtement d'or de la moitié de chaque échantillon. Les échantillons PEEK ont été traités en direct (lueur, diode) Ar ⁺ plasma en utilisant le dispositif Balzers SCD 050 (BalTec AG, Pfäffikon, CH) dans les conditions décrites dans [18, 21]. Les temps de traitement étaient de 60 et 240 s, et la puissance de décharge était de 8,3 W. Le revêtement en or du PEEK a été réalisé par le dispositif Balzers SCD 050 à partir d'une cible en or (pureté de 99,95 %, fournie par Safina Ltd., CZ). Les conditions de dépôt étaient DC Ar ⁺ plasma; pureté du gaz de 99,995%; temps de pulvérisation de 30, 150 et 300 s, courant de 40 mA (puissance de décharge 15 W); et total Ar ⁺ pression. La distance des électrodes, la densité de puissance et le taux de dépôt moyen ont été ajustés de la même manière que décrit dans [18, 22]. Les échantillons préparés ont été conservés dans des conditions de laboratoire (24 °C, 40 à 60 % d'humidité) [23].

Techniques de mesure

Gravimétrie

L'épaisseur moyenne des films d'or a été mesurée par gravimétrie en utilisant la microbalance Mettler Toledo UMX2. L'épaisseur a été calculée à partir des poids des échantillons avant et après pulvérisation cathodique en utilisant la densité apparente de l'or. Dix échantillons de chaque type de modification ont été utilisés pour la mesure. L'erreur de la mesure gravimétrique était inférieure à 15 %.

Angle de contact

La mouillabilité des échantillons a été déterminée par la mesure de leurs angles de contact avec l'eau de surface (WCA). De plus, la caractérisation des changements structurels et compositionnels causés par le traitement au plasma et le dépôt d'or a été déterminée par le Drop Shape Analysis System DSA 100 (KRÜSS GmbH, DE) à température ambiante (24 °C, 40 à 60 % d'humidité) [23]. Des gouttes d'eau de 2,0 ± 0,2 μL ont été déposées sur les échantillons testés à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable. Les images des gouttes ont été prises après un délai de 2 s. Ensuite, les angles de contact ont été évalués à l'aide du système ADVANCE. Au moins sept mesures de différentes positions sur au moins trois répétitions de chaque échantillon ont été effectuées et moyennées pour donner le WCA final et son écart type. La mesure du WCA a été effectuée sur des échantillons « âgés » pendant 14 jours.

Spectroscopie photoélectronique à rayons X

La composition chimique des échantillons préparés a été déterminée à partir des spectres de photoélectrons aux rayons X (XPS) mesurés (trois mesures) par le spectromètre Omicron Nanotechnology ESCAProbeP (fourni par Omicron Nanotechnology GmbH, DE) avec une erreur relative de 10 %. La dimension de la zone exposée et analysée était de 2 × 3 mm ² . Les conditions de mesure ont été décrites dans [18, 21]. Le carbone caractéristique (1s ), oxygène (1s ), et de l'or (4f ) les pics ont été recherchés. La mesure a été effectuée dans un vide ultra-léger. L'évaluation des spectres acquis a été réalisée par le code CasaXPS [24]. Les échantillons utilisés pour la mesure ont été « vieillis » pendant 14 jours. Avant la mesure, les échantillons ont été stockés dans des conditions de laboratoire standard.

Potentiel Zeta

L'analyse électrocinétique (potentiel électrocinétique, potentiel zêta) de tous les échantillons a été déterminée par l'instrument SurPASS (Anton Paar). Les échantillons ont été étudiés à l'intérieur d'une cellule à espacement réglable au contact d'un électrolyte (0,001 mol L ⁻¹ KCl) ainsi que dans une solution tamponnée (solution saline tamponnée au phosphate (PBS)). Pour chaque mesure, une paire de films polymères avec la même couche supérieure a été fixée sur deux porte-échantillons (avec une section transversale de 20 × 10 mm ² et un écart entre eux de 100 μm). Tous les échantillons ont été préparés en deux répétitions ; tous ont été mesurés trois fois au pH constant de 6,8 avec une erreur expérimentale de 5 %. Pour la détermination du potentiel zêta, la méthode du courant de ruissellement a été utilisée et l'équation de Helmholtz-Smoluchowski a été appliquée pour calculer le potentiel zêta [25,26,27]. Les échantillons âgés utilisés pour la mesure du potentiel zêta ont été « vieillis » pendant 14 jours.

Microscopie à force atomique

La morphologie de surface des échantillons a été examinée par microscopie à force atomique (AFM) en utilisant le système VEECO CP II (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). La surface a été mesurée en « mode de taraudage » à l'aide d'une sonde au silicium dopé P RTESPA-CP avec une constante de ressort de 20-80 N m ⁻¹ (Bruker Corporation, Billerica, MA, États-Unis). Par des mesures répétées de la même région (1 × 1 μm ² ), nous avons vérifié que la morphologie de la surface n'avait pas changé après trois scans consécutifs. Les échantillons utilisés pour la mesure ont été vieillis pendant 14 jours.

Spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif

Un plasma à couplage inductif avec détecteur de spectroscopie de masse (ICP-MS) a été utilisé pour déterminer la quantité d'ions Au libérés dans le PBS (pH = 7,4). L'analyse des éléments traces des lixiviats d'Au a été réalisée à l'aide du spectromètre triple quadripôle Agilent 8800 (Agilent Technologies, Japon) connecté à un échantillonneur automatique. La nébulisation de l'échantillon a été réalisée à l'aide d'un appareil MicroMist équipé d'une pompe péristaltique. L'incertitude de la mesure (triplicates de chaque échantillon) était inférieure à 3 %. Les lixiviations pour ICP-MS ont été préparées par incubation statique des échantillons dans du PBS en atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂ à 37 °C pendant 6, 24 et 72 h. Les lixiviations ont été diluées avec de l'eau distillée dans un rapport de 1:8 et analysées.

Culture cellulaire

Selon la norme internationale EN ISO 10993-5, les tests de cytocompatibilité ont été réalisés in vitro en utilisant la lignée cellulaire L929 de fibroblastes de souris (Sigma, USA). Les échantillons de PEEK (vierges, traités au plasma et recouverts d'or) ont été stérilisés dans de l'éthanol à 70 % dans des flacons de compteur à scintillation pendant 20 min, insérés dans des plaques à 12 puits (Jet Biofil, Ø 2,14 cm), lavés par du PBS et montés sur le puits fond avec des cylindres en plastique creux en poly(méthacrylate de méthyle). Les cellules L929 ont été ensemencées au-dessus des échantillons à la densité de 30 000 cellules par puits dans 1 mL de milieu Eagle modifié par Dulbecco à haute teneur en glucose (DMEM, Sigma, USA) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS, Invitrogen, USA) et 2 mM l-glutamine stable (l-alanyl-l-glutamine, Sigma, USA). Les cellules L929 ont été maintenues à 37 °C en atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂ .

Microscopie à fluorescence

Après le temps d'incubation souhaité (6, 24 et 72 h), les cellules ont été fixées et colorées de la même manière que décrit dans [28, 29]. Les cellules L929 ont été lavées avec du PBS et fixées avec du formaldéhyde à 4 % (Thermo Scientific, USA) dans du PBS (37 °C, 20 min). Après lavage au PBS, l'actine F du cytosquelette cellulaire a été marquée avec de la phalloïdine-Atto 565 (Sigma, USA) dans du PBS pendant 20 min. Ensuite, les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI (dichlorhydrate de 4′,6-diaminido-2-phénylindole, Sigma, USA) pendant 10 min, et les cellules ont été rincées avec du PBS, recouvertes de milieu de montage (Vector Laboratories, USA), et monté entre une lame de verre microscopique et une lamelle. Tous les échantillons (« âgés » pendant 14 jours) ont été testés en triple.

Microscopie électronique à balayage

La morphologie détaillée des cellules examinées poussant sur du PEEK vierge, une interface plasma/or et un contrôle (lamelle de verre) a été caractérisée par microscopie électronique à balayage (MEB) TESCAN LYRA3 GMU (Tescan, CZ) dans un mode électronique secondaire. Les cellules destinées à l'analyse par SEM ont été lavées avec du PBS, fixées par la solution de Karnovsky [30, 31] dans du tampon cacodylate 0,1 M (pH 7.2), et déshydratées (augmentation du pourcentage d'éthanol suivie de deux étapes finales de 10 min d'incubation dans l'hexaméthyldisilazane et séchage à l'étuve à 40 °C pendant 2 h). Les échantillons déshydratés étaient recouverts d'une couche d'or de 10 nm.

Résultats et discussion

Toutes les mesures ont été effectuées à l'aide d'échantillons « vieillis » 14 jours après le traitement au plasma et la pulvérisation d'or. Il est bien connu que les groupes fonctionnels formés sur une surface polymère traitée au plasma ne sont pas stables et changent avec le temps [32]. La surface du matériau a tendance à retrouver son état non traité [33]. Par conséquent, il se produit de modifier la réorientation des groupes chimiques produits par le traitement plasma dans la masse du matériau [34, 35].

L'ablation du PEEK lors du traitement plasma suivi d'une pulvérisation cathodique d'Au a été étudiée par gravimétrie. La perte de masse d'un polymère provoquée par l'ablation et la croissance de masse par pulvérisation cathodique ont été successivement converties en épaisseur de polymère. Les pertes de masse déterminées après traitement au plasma (60 et 240 s, puissance de 8,3 W) sont présentées dans le tableau 1. Une perte d'ablation prononcée était apparente avec l'augmentation du temps d'exposition, mais elle était juste doublée. La légère perte a probablement été causée par le caractère aromatique du PEEK, qui a entraîné une résistance accrue au clivage que dans le cas, par exemple, des chaînes aliphatiques de polyoléfines (UHMWPE). Pour la pulvérisation d'or, les périodes de temps de 30 et 300 s ont été déterminées comme exemples représentatifs de couches discontinues et continues [19, 36]. La diminution des pertes par ablation a entraîné un meilleur ancrage de l'or sur la surface du PEEK, comme cela est évident pour les échantillons avec un revêtement d'or de 150 et 300 s.

Les valeurs d'angle de contact avec l'eau des échantillons mesurés en fonction du traitement au plasma et du temps de pulvérisation d'or sont présentées dans le tableau 2. Après traitement au plasma, le WCA est passé de 79,5 ± 2,4° (PEEK vierge non modifié) à 94,0 ± 5,5° et à 95,6 ± 2,1° (PEEK traité par plasma pendant 60 et 240 s, respectivement). La différence des valeurs WCA après le traitement plasma est négligeable par rapport aux écarts de valeur. Le WCA diminue avec le revêtement Au et la surface devient plus hydrophile par rapport à celle des échantillons traités au plasma.

La concentration en éléments sur la surface du polymère (la profondeur accessible de six à huit couches atomiques) a été examinée par la méthode XPS; les résultats sont résumés dans le tableau 2. Les données XPS ont été obtenues pour un PEEK vierge, un échantillon traité au plasma et un échantillon traité au plasma suivi d'un revêtement Au. A partir de la mesure XPS, on peut voir que la concentration en oxygène a augmenté avec un traitement prolongé. Ceci était probablement dû à la réorientation des groupes contenant de l'oxygène dans le volume du polymère [37,38,39]. Il a été prouvé que l'orientation des groupes se produit immédiatement après le traitement au plasma; ainsi, dans le « processus de vieillissement » de l'échantillon, des changements se produisent dans la surface de celui-ci. Pour cette raison, les échantillons ont été mesurés pendant 14 jours après le traitement plasma, lorsque l'état de « vieillissement » d'un échantillon est stabilisé [40, 41]. La concentration en oxygène a augmenté avec un traitement plasmatique prolongé. La surface du polymère est perturbée par une décharge de plasma plus forte avec création de sites radicalaires sur la surface ; plus la puissance du plasma est élevée, plus la modification du polymère est prononcée. Ces sites réagissent avec l'oxygène présent dans l'air et l'augmentation de la concentration en oxygène sur la surface traitée [42, 43]. Après la pulvérisation d'or, la concentration en oxygène diminue aux dépens de la couche d'or. La concentration de l'or était augmentée avec un temps de pulvérisation réduit, lorsque la surface n'était pas tellement perturbée.

La figure 1 montre la morphologie de surface du PEEK obtenue au moyen de l'AFM. Le traitement au plasma a provoqué des changements détectables sur la surface du PEEK pour les deux temps d'exposition (60 et 240 s), mais comme prévu, une exposition plus longue au plasma a entraîné une surface plus rugueuse qui a entraîné une différence de métallisation des échantillons. Les échantillons traités par plasma pendant des périodes plus longues formaient des amas métalliques mieux définis. Cet effet était particulièrement évident sur les échantillons avec des couches d'or épaisses (pulvérisation pendant 300 s) et également très minces (pulvérisation pendant 30 s). Les échantillons traités par plasma pendant une courte période (60 s) ont formé un plus petit nombre de grappes plus grandes et irrégulières. Quant aux couches pulvérisées seulement pendant 30 s, les amas métalliques n'étaient facilement reconnaissables que sur le substrat traité par plasma pendant 240 s. Comme prévu, la taille des amas et la rugosité de surface augmentent généralement avec le temps prolongé de pulvérisation d'or. Ce comportement correspond bien à la mesure XPS. Les échantillons pulvérisés avec du métal pendant 30 s avaient déjà la majeure partie de leur surface recouverte de métal et une pulvérisation supplémentaire a provoqué une croissance principalement verticale des grappes ; par conséquent, il n'a pas eu un impact aussi significatif sur la concentration en or et a quand même laissé une surface de polymère partiellement découverte. De plus, une différence dans la forme des amas en fonction de la durée du traitement au plasma correspondait bien aux résultats XPS. De grands amas irréguliers sur des échantillons traités par plasma seulement pendant une courte période (60 s) couvraient une partie relativement importante de la surface du PEEK ; par conséquent, la concentration en or déterminée au moyen de XPS a été légèrement augmentée. Les différences morphologiques entre les matériaux vierges pulvérisés avec une couche métallique d'épaisseur différente peuvent être comparées aux données obtenues pour l'acide poly-l-lactique (PLLA) [44] et le polytétrafluoréthylène (PTFE) [45]. Le PTFE vierge a une surface très rugueuse; par conséquent, nous n'avons pas observé de formation de petits amas métalliques mais une diminution générale de la rugosité de surface. Ceci est causé par un phénomène selon lequel un métal pulvérisé préfère remplir des « vallées » sur la surface du polymère pour rester sur des « pics ». D'autre part, la surface du PLLA montre une granulation accrue et la formation de structures similaires aux structures sur PEEK, mais avec une régularité plus faible. Ces données suggèrent que la formation d'une structure granulaire régulière sur les polymères pulvérisés est fortement influencée par la régularité de la surface du polymère; par conséquent, le PEEK (polymère avec la plus petite rugosité de surface parmi le PEEK, le PLLA et le PTFE) permet la formation de la plupart des amas métalliques réguliers sur la surface.

Images AFM de PEEK vierge, PEEK traité par plasma (pl) pendant 60 et 240 s, et or (Au) pulvérisé pendant 30, 150 et 300 s

L'analyse électrocinétique a montré des changements dans la chimie de surface et la charge du PEEK après des étapes individuelles de modification de surface. Dans la première étape, le traitement plasma a conduit à la création de nouveaux groupes polaires à la surface du PEEK, ce qui a entraîné une augmentation du potentiel zêta [19, 25, 26, 27]. Dans la deuxième modification, le dépôt d'amas d'or à la surface de l'échantillon a également eu un impact sur la chimie de surface et le potentiel zêta (Fig. 2). En raison de la présence d'un métal à la surface du polymère, l'effet d'un changement de charge de surface joue un rôle important :l'accumulation d'électrons [27, 46]. Nous avons également observé différents potentiels zêta pour les échantillons frais et « âgés ». Des changements plus spectaculaires ont été détectés pour le potentiel zêta mesuré dans le PBS, qui a été donné par différentes concentrations d'ions. En solution de KCl, la concentration de KCl est de 0,001 mol L ⁻¹ ; dans le PBS, la concentration en ions est de trois ordres plus élevée. Une concentration plus élevée d'ions dans le PBS provoque le pressage d'une double couche électrique et entraîne une diminution du potentiel zêta (en valeur absolue) [27, 46]. Par conséquent, la concentration beaucoup plus élevée d'ions a provoqué un changement dans la charge de surface, même de valeurs négatives à positives. Ainsi, les changements de potentiel zêta PEEK déterminés dans la solution de PBS étaient plus spectaculaires et les changements dans la chimie de surface et la charge étaient plus prononcés. Par conséquent, il est clair que le traitement au plasma et le dépôt d'Au ultérieur entraînent des changements spectaculaires dans la chimie de surface du polymère et la charge qui dépendent de la durée du traitement au plasma ainsi que du dépôt d'Au. Ces résultats ont confirmé d'autres analyses effectuées.

Potentiel zêta des échantillons de PEEK traités au plasma (60 et 240 s) et pulvérisés à l'Au (30, 150 et 300 s ; 40 mA actuels) des échantillons de PEEK dans une solution de KCl 1 mM (colonnes vertes — des échantillons frais ; colonnes marron —échantillons vieillis) et en solution PBS (colonnes grises )

Pour déterminer la concentration d'or libérée dans un milieu de culture lors de la culture cellulaire, nous avons utilisé un système aqueux simple de PBS afin de simuler ces conditions. L'or libéré dans le PBS après 6 (temps d'adhésion cellulaire) et 72 h (prolifération cellulaire) d'incubation statique a été mesuré par ICP-MS, et les résultats sont résumés dans le tableau 3. Le PBS a le même pH et la même osmolarité que le milieu de culture cellulaire; ainsi, il a été utilisé pour la mesure ICP-MS. D'une part, PBS est un système simplifié; d'autre part, aucun composant n'interfère potentiellement avec la mesure ICP-MS, comme c'est le cas pour un milieu de culture cellulaire complet. Nous avons constaté que la concentration d'Au libérée dans le PBS était plus élevée pour les échantillons de PEEK recouverts d'Au pendant 30 s que pour 300 s. Cela pourrait être causé par un caractère discontinu de la couche d'or formant éventuellement de petits amas d'or qui se dissolvent plus rapidement [47]. L'or a été libéré dans une plus grande mesure de l'échantillon PEEK/60/300 que de PEEK/240/300 car sa surface était moins ablée et l'or était apparemment moins ancré.

Dans l'étape suivante, il a été examiné si la modification de surface des polymères peut favoriser l'adhésion des cellules endothéliales. La surface du PEEK a été activée par traitement plasma et pulvérisation d'or. La cytocompatibilité PEEK a été déterminée sur la base des résultats de l'adhésion cellulaire (6 h) et de la prolifération (24 et 72 h), comme le montre la Fig. 3. Chacune de deux colonnes (PEEK/plasma (ab) et PEEK/(ab) /Au (cde)) représentent deux moitiés d'un échantillon. Les différences dans le nombre de cellules L929 poussant sur du PEEK vierge et du polystyrène de culture tissulaire témoin (TCPS) se situent dans la plage de l'erreur de mesure. L'adhésion cellulaire a été surveillée 6 h après l'ensemencement des cellules sur la surface de l'échantillon. Il est évident que le nombre de cellules de PEEK vierge a augmenté par rapport à celui des échantillons traités. Après 24 h de croissance cellulaire, nous n'avons observé qu'une très légère augmentation du nombre de cellules, qui pourrait être causée par une phase de latence, lorsque les cellules s'adaptent au nouvel environnement [48]. Il est évident que 72 h après l'ensemencement, il y avait un très petit nombre de cellules poussant sur des échantillons déposés pendant 30 s (60 et 240 s de plasma traité) par rapport aux autres échantillons mesurés. Ces valeurs correspondent aux résultats des mesures ICP-MS, dans lesquelles l'or a été libéré dans le PBS dans une large mesure. Dans ce cas, la couche d'Au déposée sur PEEK (pendant 30 s) avait un caractère discontinu [36] ; ainsi, les clusters Au pourraient être libérés dans le milieu de culture cellulaire. Par ce processus, le milieu pourrait devenir toxique pour les cellules cultivées. Le plus grand nombre de cellules croissant sur une couche d'or (par rapport à l'échantillon traité au plasma) a été observé sur l'échantillon PEEK/pl 60 s/150 s, sur lequel la couche d'or était continue. Ensuite, 72 h après l'ensemencement, l'environnement le plus approprié pour la croissance des cellules L929 était sur les échantillons traités par plasma pendant 60 ou 240 s puis recouverts d'or pendant 300 s. La couche d'Au sur ces échantillons était également continue [36]. Selon les données de l'ICP-MS, seule une très petite quantité d'Au a été libérée dans le milieu de culture cellulaire. Cependant, cet or libéré était la cause probable d'une prolifération cellulaire accrue sur la surface traitée au plasma.

Nombre de cellules L929 après 6, 24 et 72 h de culture sur TCPS, PEEK vierge et PEEK avec interfaces en or des régions traitées au plasma (60 et 240 s) et pulvérisées à l'Au (30, 150 et 300 s)

Pour évaluer plus en détail la morphologie cellulaire et les connexions intercellulaires, nous avons effectué une microscopie électronique à balayage à haute résolution de cellules L929 poussant sur les substrats testés; les résultats sont présentés sur la figure 4. Les scans de l'analyse SEM ont été effectués après 72 h de croissance cellulaire sur PEEK vierge et PEEK traité au plasma et recouvert d'or, et une lamelle de verre, qui a servi de contrôle (il est couramment utilisé pour l'analyse SEM [49] ainsi que pour les études d'immunofluorescence [29]). D'après la figure 4, il est évident que les cellules se développent sur du PEEK vierge, du PEEK traité par plasma pendant 60 s (la seconde moitié est de 300 s Au) et pendant 240 s (la seconde moitié est de 150 et 300 s Au), et sur une lamelle de verre avait une forme similaire après 72 h de culture. Les cellules étaient complètement étalées sur la surface traitée au plasma, et au-dessus de cette couche cellulaire, la formation d'une nouvelle couche de cellules proliférantes est apparente. Les cellules avaient une forme sphérique à la surface des échantillons de PEEK/60 (la seconde moitié est de 150 s Au) et de PEEK/240/30 s Au, même si l'environnement n'était pas propice à la prolifération cellulaire. Les cellules les plus arrondies ont été observées sur PEEK/240/300 s Au, ce qui correspond parfaitement aux données présentées sur la figure 3.

Images SEM de cellules L929 cultivées pendant 72 h sur PEEK vierge, PEEK traité par plasma (60 et 240 s) et leurs parties dorées pulvérisées pendant 30 et 300 s (une lamelle de verre microscopique a servi de témoin). La barre d'échelle correspond à 10 μm

Conclusions

Nous avons comparé deux manières différentes de modifier le PEEK afin de créer un matériau avec une adhérence et une croissance cellulaires améliorées. Les résultats obtenus ont confirmé des changements variables dans les propriétés de surface après des étapes de modification individuelles. Les deux méthodes de modification utilisées ont entraîné des changements dans la chimie de surface, la morphologie, la mouillabilité et la charge. Le traitement au plasma pendant 240 s a entraîné une perte de poids de PEEK jusqu'à deux fois plus élevée que le traitement pendant 60 s. La mouillabilité de la surface du PEEK n'a pas été significativement modifiée par le traitement au plasma. La mesure XPS a confirmé le fait général qu'avec l'augmentation du temps de traitement au plasma, la concentration de carbone diminuait à la surface du PEEK, contrairement à laquelle, la concentration d'oxygène augmentait. L'épaisseur d'un film d'or déposé était plus élevée après un traitement plasma pendant 60 s. La pulvérisation d'or a augmenté la mouillabilité de surface du PEEK. Les résultats de l'analyse XPS ont montré les mêmes tendances pour les deux échantillons traités au plasma (60 et 240 s), et les concentrations de carbone et d'oxygène ont diminué avec l'augmentation du temps de dépôt en faveur de la concentration croissante d'or. Les images AFM ont également confirmé les mesures XPS, en particulier pour les échantillons traités par plasma pendant 60 s et recouverts d'or pendant 300 s, sur lesquels de grands amas irréguliers couvraient une partie relativement importante de la surface du PEEK ; par conséquent, la concentration en or a été légèrement augmentée. Il a également été constaté que les échantillons avec une couche d'or mince et également plus épaisse ne sont pas adaptés à la propagation cellulaire.

Cette recherche montre que le traitement au plasma améliore la cytocompatibilité du PEEK par rapport au vierge. En outre, le traitement au plasma est une meilleure méthode de modification des polymères pour la croissance cellulaire que la pulvérisation d'or, lorsque l'or est libéré dans le milieu de culture cellulaire.

Abréviations

AFM :

Microscopie à force atomique

CO₂ :

Dioxyde de carbone

DAPI :

Dichlorhydrate de 4′,6-Diaminido-2-phénylindole

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

FBS :

Sérum fœtal bovin

ICP-MS:

Inductively coupled plasma mass spectrometry

KCl:

Potassium chloride

L929:

Mouse embryonic fibroblasts

PBS:

Phosphate-buffered saline

PEEK:

Polyetheretherketone

PGA:

Polyglycolide

PHB:

Polyhydroxybutyrate

PLA:

Poly(l-lactide)

PMMA:

Polymethylmethacrylate

PTFE:

Polytetrafluorethylene

SEM:

Scanning electron microscopy

TCPS:

Tissue culture polystyrene

UHMWPE:

Ultra-high-molecular-weight polyethylene

WCA:

Water contact angle

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X