Effets ostéoinductifs potentiels des nanoparticules d'hydroxyapatite sur les cellules souches mésenchymateuses par interaction avec les cellules endothéliales

Introduction

La reconstruction des défauts osseux causés par un traumatisme, une malformation congénitale ou une résection chirurgicale représente un grand défi pour la chirurgie orthopédique [1]. L'hydroxyapatite (HA), une céramique bioactive représentative, avait été utilisée comme substitut osseux [2]. Cependant, des propriétés mécaniques et ostéoinductives indésirables restreignent son application clinique [3]. Ces dernières années, le nano-HA a démontré une meilleure bioactivité plus optimale et des performances mécaniques améliorées en raison de ses caractéristiques bioniques uniques et a suscité un intérêt significatif dans les domaines biomédicaux liés à la médecine régénérative [4]. Lorsque le nano-HA est implanté dans des défauts osseux, plusieurs cellules impliquées dans la réparation osseuse y seront exposées. En tant que tel, il est nécessaire d'évaluer le comportement biologique du nano-HA. Plusieurs sources de preuves ont directement démontré que les nanoparticules HA (HANP) peuvent être absorbées par les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton (hWJ-MSC) et les cellules ostéoblastiques du cordon ombilical humain, entraînant une différenciation ostéogénique améliorée [5,6,7]. Dua et al. ont précédemment rapporté la capacité des HANP à favoriser l'intégration du cartilage modifié dans le cartilage de novo [8] ; à l'inverse, les HANP inhibent la capacité angiogénique des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) [9]. En termes de santé humaine, une compréhension plus complète de l'impact des HANP sur la régénération osseuse est justifiée, et les applications en cours d'os artificiel à base de nano-ingénierie ajoutent à l'urgence de telles études.

La régénération osseuse s'accompagne inévitablement d'une invasion de néovaisseaux. Les CE sont la paroi cellulaire interne du système vasculaire qui servent à acheminer passivement le sang et jouent également un rôle dans l'induction, la spécification et le guidage de la régénération des organes ainsi que dans le maintien de l'homéostasie et du métabolisme [10, 11]. Les CSM font partie de la niche périendothéliale et possèdent des capacités d'auto-renouvellement et de multi-différenciation sous l'induction de microenvironnements physiologiques et biochimiques particuliers au sein de leurs niches résidentes [12]. Tsai et al. ont trouvé que les CE peuvent sécréter de l'endothéline-1 pour diriger les CSM vers la différenciation ostéo- et chondro-lignée [13]. De plus, Saleh et al. ont utilisé l'analyse des données de microarrays pour identifier les protéines sécrétées par les HUVEC et les voies de signalisation de diaphonie associées qui interagissent avec les récepteurs membranaires des MSC pour améliorer la prolifération et la différenciation ostéogénique [14]. Dans l'ingénierie du tissu osseux, les HANP peuvent entrer en contact avec les néovaisseaux et être endocytosées par les CE, ce qui s'est avéré altérer la fonction physiologique de ces cellules [9, 15]. Cela peut également influencer les cellules ostéoprogénitrices environnantes et affecter la réparation osseuse en modifiant la signalisation paracrine. Cependant, bien que l'impact direct des HANP sur les MSC ait été exploré, on ne sait toujours pas clairement si les HANP peuvent indirectement induire une différenciation ostéogénique des MSC par le biais des CE, ce qui est essentiel pour notre compréhension de l'effet des HANP en ce qui concerne à la réparation osseuse.

Dans cette étude, dans un effort pour mieux comprendre les effets biologiques des HANP sur l'interaction entre les CE et les MSC, un modèle de co-culture indirecte a été établi à l'aide des HUVEC et des hWJ-MSC. En utilisant ce système, la cytotoxicité et les effets ostéoinducteurs des HANP sur les hWJ-MSC via la signalisation paracrine médiée par HUVEC ont été évalués. Pour identifier les facteurs clés influençant les interactions cellules endothéliales-MSC induites par HANP, les facteurs solubles dans le surnageant des HUVEC qui avaient été stimulés par les HANP ont été évalués en mettant l'accent sur les mécanismes connexes au niveau des gènes et des protéines. Les résultats ont démontré que le facteur inductible par l'hypoxie (HIF)-1α joue un rôle essentiel dans ces interactions.

Pour observer et prédire quantitativement l'impact de HIF-1α sur le processus d'ostéogenèse, un modèle mathématique qui combine une lignée cellulaire en deux étapes avec HIF-1α a été établi. Ici, en analysant les données empiriques, le modèle de lignée cellulaire en deux étapes a été utilisé pour prédire le nombre de MSC et le degré de différenciation à tout moment, en fonction de la densité d'ensemencement cellulaire initiale définie et de la concentration de HIF-1α, ce qui peut à son tour fournir des suggestions appropriées pour les conditions de culture initiales et les temps d'incubation. Les résultats de cette étude permettront de faire la lumière sur les interactions entre les substituts osseux nano-basés et les systèmes biologiques, qui peuvent servir à promouvoir le développement de biomatériaux innovants pour une utilisation en médecine régénérative.

Matériaux et méthodes

Préparation et caractérisation des particules

Des HANP à 20 nm (np20), 20 * 80 nm (np80) et des particules d'AH microscopiques (m-HAP) avec une pureté 99,0 % ont été achetés auprès de la Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, Chine). La taille et la forme des particules ont été observées par microscopie électronique à transmission (MET ; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, États-Unis) et par microscopie électronique à balayage (SEM ; LEO1530VP, Allemagne). La taille hydrodynamique et le potentiel zêta des particules HA (HAP) ont été déterminés via Zetasizer Nano ZS90 et Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni).

Préparation et culture cellulaires

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université médicale de Nanjing. Les HUVEC et les hWJ-MSC ont été récoltés à partir de cordons ombilicaux humains frais, comme décrit précédemment, après avoir obtenu le consentement éclairé écrit des donneurs [16, 17]. En bref, le cordon ombilical et la veine ombilicale ont été rincés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % de pénicilline et de streptomycine (PS ; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Autriche). Ensuite, la veine ombilicale a été remplie avec 0,1% de collagénase I (Sigma, St. Louis, MO, USA) et incubée pendant 15 min à 37 °C. Après la collecte, les HUVEC ont été cultivées en milieu EC (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, USA).

Par la suite, les vaisseaux sanguins ont été retirés et la gelée de Wharton a été coupée en 1 mm ² morceaux puis placés dans 25 cm ² flacons de culture tissulaire (Corning Incorporated, Corning, NY, USA). Ces cellules ont été incubées dans du L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, USA) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (GIBCO) et de 1 % de PS.

Les hWJ-MSC ont été évalués pour confirmer le phénotype à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 et CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Les HUVEC ont été évaluées en utilisant le facteur de von Willebrand (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai Chine). Les HUVEC entre les passages 3 à 7 et les hWJ-MSC entre les passages 3 à 5 ont été utilisés dans ces expériences.

Les suspensions de particules à 1 mg/mL dans du PBS ont ensuite été diluées dans du L-DMEM à la concentration finale. Comme le montre la figure 1, les HUVEC ont été incubées dans la concentration indiquée de HAP pendant 18 h. Le milieu de culture a été centrifugé à 15 000 tr/min à 4 °C pendant 15 min, et les surnageants additionnés de 10 % de FBS ont été utilisés comme milieu conditionné (CM) pour les hWJ-MSC afin de réaliser les expériences suivantes. Le CM consistait en un milieu ostéogénique complété par un liquide d'induction ostéogénique, qui contenait 10 mM de β-glycérophosphate, 50 μg/mL d'acide L-ascorbique-2-phosphate et 0,1 μM de dexaméthasone (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). De plus, le 2-méthoxyestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, États-Unis) a été utilisé comme inhibiteur spécifique de HIF-1α. Dans le groupe 2-MeOE2(+), hWJ-MSCs ont été cultivés avec CM de HUVECs, qui ont été prétraités avec 5 μM 2-MeOE2 pendant 40 min avant la supplémentation en HAP. PD98059 a été utilisé comme inhibiteur spécifique de MEK. Dans le groupe PD98059, les hWJ-MSC ont été cultivés avec du CM contenant 5 μM de PD98059.

Illustration de la co-culture indirecte HAPs/hWJ-MSCs médiée par les HUVECs. Abréviations :HAP particules d'hydroxyapatite, hWJ-MSCs Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton de cordon ombilical humain, HUVECs cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine

Détermination de la viabilité et du nombre de cellules

La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du kit de dosage MTS (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine). Les hWJ-MSC ont été laissées à adhérer pendant 24 h, puis cultivées avec du CM pendant 24 et 72 h. L'absorbance du formazan a été évaluée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA). L'absorbance a également été convertie en nombres de cellules en utilisant des courbes d'étalonnage standard dans les mêmes conditions.

Réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR)

Le réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a été utilisé pour isoler l'ARN total des cellules hWJ-MSCs incubées dans CM pendant la durée indiquée. L'ADN complémentaire a été transcrit à partir de 1,0 µg d'ARN à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc PrimeScript First Strand (TaKaRa, Tokyo, Japon) dans un thermocycleur T3 (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hambourg, Allemagne). Les niveaux d'expression des gènes indiqués ont été analysés à l'aide du kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Bâle, Suisse) sur un système d'amplification quantitative en temps réel (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L'expression relative de l'ARNm du gène cible a été normalisée à GAPDH puis déterminée en utilisant la méthode \(2^{{ - \Delta \Delta C_{t} }}\). Les séquences d'amorces pour les gènes cibles sont répertoriées dans le tableau 1.

Coloration au rouge d'alizarine S (ARS) et analyse quantitative

Les hWJ-MSC ont été cultivées dans des plaques à 12 puits avec un milieu ostéogénique jusqu'à 14 jours, puis une minéralisation de la matrice extracellulaire a été observée à l'aide de la coloration ARS (Leagene, Leagene Biotechnology, Pékin, Chine) après le. En bref, les échantillons ont été fixés avec de l'alcool éthylique absolu pendant 15 min, puis colorés dans de l'ARS à 1 % (p/v) (pH, 4,2) à température ambiante pendant 5 min. Les cellules colorées ont été lavées deux fois avec de l'eau bidistillée puis photographiées. Pour l'analyse quantitative du processus de minéralisation, 300 L de chlorure de cétylpyridinium monohydraté à 10 % (p/v) (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, Chine) ont été ajoutés à chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 30 min. Un total de 90 μL de chaque échantillon a été transféré dans une plaque à 96 puits, et l'absorbance a ensuite été mesurée à 405 nm en triple.

Coloration et analyse quantitative de la phosphatase alcaline (ALP)

Après la culture des hWJ-MSC dans des plaques à 12 puits avec un milieu ostéogénique jusqu'à 14 jours, la coloration ALP a été réalisée à l'aide d'un kit de développement de couleur BCIP/NBT Alkaline Phosphatase (Beyotime). En bref, les hWJ-MSC ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, les échantillons ont été colorés dans un mélange de nitro-bleu de tétrazolium et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate pendant 4 h et photographiés. Pour quantifier la synthèse d'ALP, les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse RIPA glacé (Beyotime) pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 12 000 tr/min à 4 °C pendant 10 min, et les surnageants ont subi une analyse quantitative ALP à l'aide d'un kit ALP Assay (Beyotime). L'absorbance a été mesurée en triple à 405 nm et convertie en activité ALP à l'aide d'une courbe standard.

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Les HUVEC ont été ensemencées à 2 × 10 ⁵ cellules/puits. Le CM a été collecté à partir de HUVEC cultivées avec des HAP pendant 18 h (Fichier supplémentaire 1), et le surnageant a été soumis à une analyse ELISA (Fig. 1). Un kit ELISA humain HIF-1α (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, Chine) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant.

Immunofluorescence

Les HUVEC ont été ensemencées sur des lames dans des plaques à 12 puits (7,6 × 10 ⁴ cellules/puits). Après exposition au CM pendant 18 h, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % (Biosharp, Pékin, Chine) et perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % (Beyotime) dans du PBS avant incubation avec un anticorps anti-HIF-1α à 1 % [EPR16897 ](ab179483, Abcam, Royaume-Uni) pendant la nuit à 4 ℃. Par la suite, les cellules ont été incubées avec 1% de CoraLite594-conjugué Goat Anti-Rabbit IgG(H + L) (Proteintech, USA) dans l'obscurité pendant 1 h. Ensuite, les noyaux ont été teints avec du DAPI (Beyotime, Shanghai, Chine), qui a été ajouté aux cellules et a réagi pendant 30 s. Les échantillons ont été examinés à l'aide d'un microscope confocal laser (Olympus, Japon). L'intensité de fluorescence a été quantifiée à l'aide du logiciel d'analyse ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, USA).

Analyse Western Blot

Les hWJ-MSCs ont été incubés dans CM pendant 24 h (kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK)1/2, p-ERK1/2) ou dans un milieu ostéogénique pendant 7 jours (facteur de transcription lié à l'écoulement (RUNX)-2, type 1 collagène/collagène 1 (COL I)). Ensuite, les cellules ont été lysées dans du tampon de lyse RIPA pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont été centrifugés et les surnageants ont été conservés à - 20 °C pour analyse. Après 12 % de SDS-PAGE, les protéines ont été transférées sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). Les principaux anticorps utilisés étaient anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I et GAPDH (1:1 000, anticorps polyclonaux de lapin ; Cell Signaling Technology, Boston, MA, États-Unis ). Après avoir éliminé les anticorps non liés, la membrane a été incubée avec des anticorps secondaires pendant 1 h. Le signal sur les membranes a été détecté à l'aide d'un système d'imagerie sur gel par chimiluminescence (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suède). Le rapport p-ERK à ERK et RUNX-2/COL I à GAPDH a été quantifié à l'aide du logiciel d'analyse ImageJ v.1.4 (Bethesda).

Évaluation de l'apoptose cellulaire

Les hWJ-MSC ont été ensemencés à une densité de 10 ⁵ cellules par puits dans des plaques à 6 puits. Les cellules adhérentes ont été traitées avec les concentrations indiquées de HIF-1α pendant la durée indiquée. Les cellules ont ensuite été collectées et marquées avec FITC-Annexin V et PI (Fcmacs, Nanjing, Chine) pendant 15 minutes dans l'obscurité. Tous les échantillons ont été testés à l'aide d'un cytomètre en flux FACScan (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Les données ont été analysées à l'aide de FlowJo v10 (BD Biosciences).

Modèle de lignée cellulaire en deux étapes

Compte tenu de l'énorme potentiel des HAP et de la difficulté d'analyser le système de co-culture, un modèle mathématique était nécessaire qui pourrait fournir une analyse quantitative et une prédiction fiable était nécessaire pour comprendre le rôle de HIF-1α dans la différenciation ostéogénique de hWJ- MSC.

Les hWJ-MSC ont été cultivées avec 0, 300, 500, 1 000, 1 500, 2000, 3 000 et 4 000 pg/mL de HIF-1α ainsi qu'avec du liquide d'induction ostéogénique. Après avoir ajusté les données à ces concentrations, nous utilisons les concentrations de HIF-1α (produites par les HUVEC) dans les groupes témoins, m-HAP, np80 et np20 (respectivement 240, 300, 325 et 375 pg/mL) pour tester les équations d'ajustement à l'aide de MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA). Afin de simplifier le modèle, nous avons considéré que leurs schémas de croissance similaires aux différentes concentrations de HIF-1α étaient identiques. Le degré de différenciation moyen a été utilisé pour ajuster l'équation degré-temps de différenciation. Le taux de prolifération, le taux d'apoptose et les degrés de différenciation ostéogénique des hWJ-MSC dans les différents groupes ont été détectés à des moments définis.

Un modèle de lignée cellulaire simplifié à deux étapes, qui était similaire à un modèle de lignée cellulaire à plusieurs étapes [18, 19], a été établi selon les données expérimentales. C ₀ et C ₁ représentent respectivement le numéro de cellule des hWJ-MSC et des cellules terminales. C ₀ et C ₁ sont régis par :

Ici, p , affecté par HIF-1α et le temps, représente la probabilité de réplication des hWJ-MSCs. En conséquence, d = 1 − p est le taux de différenciation qui peut être obtenu en ajustant les données estimées et expérimentales du nombre de cellules. Le paramètre v₀ quantifie la rapidité avec laquelle les cellules se divisent à chaque étape de la lignée (en particulier, v = ln2/c , où c est la durée d'un cycle cellulaire). Le taux d'apoptose des cellules terminales est symbolisé par A . Par souci de simplicité, nous avons négligé le fait que le taux d'apoptose varie légèrement dans le temps, et donc, A = 4,5 % est une constante. K désigne la capacité environnementale car les cellules ne pourraient pas subir une prolifération illimitée [20]. HIF-1α augmente le taux de différenciation des hWJ-MSC, conduisant à un taux de différenciation modélisé par :

Par la présente, H représente la concentration de HIF-1α; d ₀ désigne le taux de différenciation à 0 pg/mL HIF-1α ; r représente l'intensité de la régulation (ici, représentant l'intensité de la régulation de HIF-1α sur les MSC) ; et m correspond au coefficient de Hill [21], scilicet la relation entre le taux de différenciation MSC et la concentration HIF-1α.

Analyse statistique

Toutes les données qui satisfont aux exigences de normalité et d'homoscédasticité sont exprimées comme la moyenne  ± déviation standard (SD) de trois expériences indépendantes ou plus. Le logiciel SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) a été utilisé pour effectuer les analyses statistiques via une ANOVA unidirectionnelle ou une ANONA bidirectionnelle. Un P value < 0.05 a été considérée comme statistiquement significative. L'analyse statistique est présentée à l'aide de GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Résultats

Caractérisation des HAP

Comme le montre la figure 2, les HAP ont été préparés avec une taille et une forme particulières. Les diamètres du np20 de forme quasi sphérique étaient de 20 nm en moyenne, et le np80 était en forme de tige avec une longueur moyenne de 80 nm et une largeur de 20 nm. Les m-HAP étaient également de forme presque sphérique et d'environ 12 μm de diamètre. Toutes les particules avaient une charge de surface négative dans le L-DMEM. Il a été suggéré que des valeurs négatives du potentiel zêta ont un effet favorable significatif sur la fixation et la prolifération des cellules osseuses, ainsi que sur la liaison osseuse directe et la formation d'os nouveau [22, 23]. Les particules, qui ont été observées dans le L-DMEM, ont tendance à s'agréger dans les systèmes aqueux. Leur taille hydrodynamique a également été testée, ce qui pourrait également être un facteur important affectant leurs comportements biologiques.

Caractérisation des HAP. Micrographies MET de a np20 et b np80, et micrographie SEM de c m-HAP. d Caractérisation des HAP (n = 6). Abréviations :TEM microscopie électronique à transmission, MEB microscopie électronique à balayage, HA hydroxyapatite, m-HAP microparticules HAP

Toxicité indirecte des HAP envers les hWJ-MSC

Pour évaluer la toxicité indirecte des HAP sur les hWJ-MSC, la viabilité cellulaire a été mesurée via des tests MTS. CM avec 50 µg/mL de HANP pourrait stimuler de manière significative la viabilité de hWJ-MSC après 24 h et 72 h et surtout à 24 h. Cependant, CM avec 100 µg/mL de HANP a diminué la viabilité cellulaire de 15 à 20 % par rapport au témoin après 72 h. De plus, le CM avec 25 µg/mL de np20, mais pas de np80, a stimulé la viabilité cellulaire après 24 h. Ces phénomènes ont confirmé que 50 µg/mL de HANP étaient une concentration sous-cytotoxique qui a été utilisée dans toutes les expériences ultérieures (Fig. 3).

Toxicité indirecte des HAP envers les hWJ-MSC. La viabilité des hWJ-MSC cultivés indirectement avec des HAP a été mesurée pour a 24 et b 72 h. *P < 0,05 ; **P < 0,01 par rapport au témoin. Le groupe témoin était constitué de cellules incubées dans CM sans traitement aux HAP, et la viabilité cellulaire a été normalisée en pourcentage du témoin. Abréviations :HAP particules d'hydroxyapatite, m-HAP particules HAP micro-taille, hWJ-MSCs Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton de cordon ombilical humain

Effet ostéoinductif indirect des HAP sur les hWJ-MSC

Pour identifier les effets ostéoinducteurs indirects des HANP sur les hWJ-MSC, l'expression des gènes ostéogéniques a été évaluée par analyse quantitative RT-PCR. Le niveau de transcription pour le facteur de transcription 2 lié aux runes (RUNX-2) dans les groupes HANP, en particulier np20, a montré une augmentation notable du jour 7 au jour 21 (Fig. 4a). L'expression génique du collagène de type I (Col I) dans le groupe np20 a démontré une amélioration du jour 7 au jour 21, tandis que le groupe np80 a démontré une augmentation soutenue du jour 7 au jour 14 (Fig. 4b). L'ARNm de l'ostéocalcine (OCN) était clairement régulé à la hausse dans les groupes HANP au jour 14, indiquant un taux accéléré d'ostéogenèse (Fig. 4c). Les niveaux d'ARNm de phosphatase alcaline (ALP) ont évidemment augmenté dans les groupes HANP (Fig. 4d), indiquant la différenciation ostéogénique des hWJ-MSC. Cependant, le groupe m-HAP a présenté des changements limités en ce qui concerne les niveaux de ces trois gènes ostéogéniques par rapport au groupe témoin (Fig. 4). De plus, l'expression des marqueurs de pluripotence, NANOG, OCT3/4 et SOX2, a diminué dans les groupes HANPs par rapport au contrôle (Fig. 4e–g), ce qui implique que les hWJ-MSCs dans les groupes HANPs s'étaient différenciés, en particulier dans le groupe np20. Des résultats similaires ont été obtenus par analyse Western blot (Fig. 5c, d), indiquant que le groupe np 20 pourrait indirectement améliorer l'expression de RUNX-2 et COL I dans les hWJ-MSC.

Effets indirects des HAP sur l'expression des gènes liés à la différenciation ostéogénique. un RUNX-2, b Col I, c OCN, d ALP, e NANOG, f OCT3/4, et g Niveaux du gène SOX2 dans les hWJ-MSC cultivés avec CM pendant la durée indiquée. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au groupe témoin ; ^& P < 0,05 ; ^&& P < 0,01 ; ^&&& P < 0,001 versus le groupe m-HAP ; ^# P < 0,05 ; ^## P < 0,01 par rapport au groupe np20. Des cellules incubées dans un milieu ostéogénique sans traitement aux HAP ont été utilisées comme groupe témoin. Abréviations :HAP particules d'hydroxyapatite, m-HAP particules HAP micro-taille, hWJ-MSCs Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton de cordon ombilical humain, RUNX-2 facteur de transcription 2 lié à l'avorton, Col I collagène de type I, OCN ostéocalcine, ALP phosphatase alcaline, SOX 2 HMG-box 2 lié au SRY

Effet indirect des HAP sur le dépôt de calcium extracellulaire et l'activité ALP. Les hWJ-MSCs ont été incubés dans un milieu ostéogénique pendant 14 jours. un Le dépôt de calcium extracellulaire a ensuite été visualisé par coloration ARS; b L'activité ALP des hWJ-MSC a été évaluée par coloration ALP, barres d'échelle :200 μm. c L'analyse Western blot a indiqué l'expression de RUNX-2 et COL I de hWJ-MSCs dans un milieu ostéogénique au jour 7. d Mesures densitométriques de RUNX-2 et COL I à partir de la pièce (c ). Des cellules incubées dans un milieu ostéogénique sans traitement aux HAP ont été utilisées comme groupe témoin. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au groupe témoin ; ^& P < 0,05 ; ^&&& P < 0,001 versus le groupe m-HAP ; ^### P < 0,001 par rapport au groupe np20. Abréviations :HAP particules d'hydroxyapatite, m-HAP particules HAP micro-taille, hWJ-MSCs Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton de cordon ombilical humain, ALP phosphatase alcaline

Pour observer visuellement l'effet ostéoinducteur indirect des HANP sur les hWJ-MSC, les cellules ont été incubées avec le milieu ostéogénique indiqué pendant 14 jours, suivi d'une coloration ARS et ALP. Comme le montrent les figures 5a, b, un nombre accru de nodules minéralisés et une activité ALP plus élevée des hWJ-MSC ont été observés dans les groupes HANP par rapport aux groupes m-HAP et témoins. De plus, m-HAP, similaire au témoin, a démontré des effets limités sur la différenciation ostéogénique des hWJ-MSC.

Signalisation ERK1/2 activée par les HAP dans les hWJ-MSC indirectement co-cultivés avec les HUVEC

Pour étudier les effets sur la fonction paracrine des HUVEC par les HAP, des tests d'immunofluorescence et ELISA ont été utilisés pour identifier la protéine possible favorisant la différenciation ostéogénique des hWJ-MSC. Comme le montrent les figures 6a–c, la production intracellulaire et extracellulaire de HIF-1α a été considérablement facilitée par les HANP (en particulier np20), alors qu'il y avait un effet limité de m-HAP sur sa production.

Les HAP ont activé la signalisation ERK1/2 dans les hWJ-MSC indirectement co-cultivés avec les HUVEC. un Immunofluorescence de HIF-1α réalisée dans des HUVEC traités avec/sans HAP pendant 18 h. b L'intensité de fluorescence de HIF-1α de la partie (a ). c La concentration extracellulaire de HIF-1α dans le milieu de culture des HUVEC traités avec/sans HAP pendant 18 h a été mesurée par ELISA. Barres d'échelle :20 μm. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au témoin ; ^## P < 0,01 ; ^### P < 0,001 par rapport au groupe np20. Des cellules sans traitement aux HAP ont été utilisées comme groupe témoin. hWJ-MSCs ont été traités avec CM pendant 24 h. d Analyse Western blot indiquant l'activation de kinases clés dans les voies ERK1/2. e Mesures densitométriques de p-ERK1/2 à partir de la pièce (b ). **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au témoin ; ^## P < 0.01, ^### P < 0,001 versus groupe 2-MeOE2( −). Les cellules incubées dans CM sans traitement HAP ont été utilisées comme groupe témoin. Abréviations :HAP particules d'hydroxyapatite, m-HAP particules HAP micro-taille, hWJ-MSCs Cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton de cordon ombilical humain, HUVECs cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, ERK kinase régulée par le signal extracellulaire, HIF-1α facteur 1 inductible par l'hypoxieα

Pour mieux comprendre la voie de signalisation de différenciation des hWJ-MSC activés par HIF-1α, nous avons examiné les principaux régulateurs de la voie ERK1/2 via une analyse Western blot. Comme le montre la figure 6d, e, alors que les niveaux de protéines du total ERK1/2 sont restés inchangés, les niveaux de p-ERK1/2 ont été nettement augmentés dans les hWJ-MSC cultivés avec des HANP, et cela était particulièrement vrai dans le groupe np20. Cependant, le m-HAP a eu peu d'effet sur les niveaux de p-ERK1/2 dans les hWJ-MSC, similaire à son effet sur la production de HIF-1α dans les HUVEC. Il est important de noter que les niveaux accrus de p-ERK1/2 dans les hWJ-MSC activés par HIF-1α pourraient être bloqués par 2-MeOE2, un inhibiteur spécifique de HIF-1α, indiquant que HIF-1α fonctionnait en amont de la voie de signalisation ERK1/2 dans les hWJ-MSC.

HIF-1α Promotion de la différenciation ostéogénique des hWJ-MSC via la voie ERK1/2

Pour déterminer si HIF-1α était nécessaire pour la stimulation observée de la différenciation ostéogénique hWJ-MSC, un inhibiteur spécifique de HIF-1α (2-MeOE2) a été appliqué à ces cultures cellulaires. Comme le montre la Fig. 7, le dépôt de matrice minéralisée et l'activité ALP du groupe traité au 2-MeOE2 (+) hWJ-MSC cultivés en milieu ostéogénique ont été affaiblis, indiquant que HIF-1α était indispensable à la différenciation ostéogénique du hWJ- MSC. Sur la base de ces résultats, nous avons exploré davantage le rôle de la voie ERK1/2 dans la différenciation ostéogénique des hWJ-MSC activés par HIF-1α. Le dépôt de matrice minéralisée et l'activité ALP dans les hWJ-MSC cultivés avec un milieu ostéogénique ont été supprimés après l'administration de PD98059, un inhibiteur spécifique de la MEK.

HIF-1α a favorisé la différenciation ostéogénique des hWJ-MSC via la voie ERK1/2. Les hWJ-MSCs ont été incubés dans un milieu ostéogénique avec ou sans PD98059 pendant 14 jours. un Extracellular calcium deposition was visualized via ARS staining. b ALP activity of hWJ-MSCs was assessed via ALP staining. Scale bars:200 μm. c Quantitative analysis of extracellular calcium matrix. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 versus control; ^# P  < 0.05; ^### P  < 0.001 versus the np20 group. Cells incubated in osteogenic medium without HAPs and PD98059 treatment were used as the control group. Abbreviations:HAPs hydroxyapatite particles, m-HAP micro-sized HAP particles, hWJ-MSCs human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, HUVECs human umbilical vein endothelial cells, ERK extracellular signal-regulated kinase, HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α, ALP alkaline phosphatase

Two-Stage Cell-Lineage Models

To quantitatively reveal the intrinsic connection between the concentration of HIF and osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, 0–4000 pg/mL of HIF-1α was used to treat eight groups of hWJ-MSCs. A two-stage cell-lineage mathematical model was used to analyze the proliferation, apoptosis, and osteogenic differentiation rates of these hWJ-MSCs treated with different concentrations of HIF-1α. As shown in Fig. 8a, fitting data were employed to obtain the simulated formula (\(\frac{d}{{d_{0} }} =\frac{1}{{0.14H^{2} - 0.43H + 1}}\)) and curve (blue curve), showing that the differentiation rate first increased and then decreased with the increase in HIF concentration. More specifically, the differentiation rate reached a peak at 1500 pg/mL HIF-1α.

Two-stage cell-lineage models. hWJ-MSCs were incubated in a defined concentration of HIF-1α for the indicated times. un Relative differentiation rates of hWJ-MSCs at different concentrations of HIF-1α, b relative ALP activity (differentiation degrees of hWJ-MSCs) and relative osteoblast cells on different culture days. c Three-dimensional surface of differentiation degree evolving with time and HIF-1α. Cell number with an initial seeding density of 1500 cells per well (in a 96-well plate), as well as d 0, e 375, and f 1500 pg/mL HIF-1α. Abbreviations:hWJ-MSCs human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α, ALP alkaline phosphatase

According to our study, the concentrations of HIF-1α produced by HUVECs in the control, m-HAP, np80, and np20 groups were 240, 300, 325, and 375 pg/mL, respectively. The black square represents the differentiation rate promoted by 240, 300, 325, and 375 pg/mL HIF-1α, and this matches well with the simulated curve. In addition, the differentiation degrees of the hWJ-MSCs (relative ALP activity) treated with different concentrations of HIF-1α increased similarly increased with time. Therefore, in order to simplify the model, we consider their growth patterns to be similar or even identical. We found that the increase in ALP activity from Day 0 to Day 7 was proportional to the number of osteoblasts, and osteoblast cells reached their peak at the platform period. Therefore, after fitting the ALP activity with the relative osteoblasts cell number curve (osteoblasts cell number / maximum osteoblasts cell number), the maximum of ALP activity was predicted and relative ALP activity (ALP activity/ maximum of ALP activity), representing the differentiation degree, was acquired (Fig. 8b). Combining these two studies, the three-dimensional surface of the differentiation degree evolving with time and HIF-1α was obtained (Fig. 8c).

In order to estimate the optimal culture time, it was necessary to simulate cell numbers. After elucidating the differentiation rate under different concentrations of HIF-1α, we simulated the size of each population. The simulation utilized an initial seeding density of 1500 cells per well (in a 96-well plate) using different concentrations of HIF-1α. As shown in Fig. 8d–f, the experimental data (black square) match well with the simulated total cell numbers (blue curve), which is a sum of the number of hWJ-MSCs and osteoblasts, and this supports the ability of this model to predict the number of hWJ-MSCs and osteoblasts at any time point. Moreover, the osteoblast cell number approached the platform period at 21, 18, and 15 days with 0, 375, and 1500 pg/mL HIF-1α, respectively. This model provides the optimum culture time for guiding tissue engineering, and it also provides direct evidence that HIF-1α accelerates the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs.

Discussion

With recent advances in nanobiomaterials, nano-based artificial bone substitutes have been an area of intense investigation. The accumulating evidence suggests that there are complex interactions between cells and nanobiomaterials due to their capacity to penetrate cell membranes and increase internal retention times [24, 25]. A previous study revealed that collagen/alginate nanofilms can adsorb onto the MSC membrane to activate intracellular signaling cascades and promote osteogenic differentiation [26]. Elegant experiments by Wu and his colleagues clearly demonstrated that TiO₂ nanotubes can improve vascularization and osteogenic differentiation by facilitating paracrine effects and cell junctions via EC-MSC interactions [27]. For the purpose of developing excellent candidates for bone tissue engineering, it is necessary to clarify the direct crosstalk between nano-based bone substitutes and cells implicated in bone repair as well as their indirect interactions. However, our current understanding of this is still limited. In the present study, we utilized an indirect co-culture model to further elucidate the biological effects of HANPs on MSCs in regard to the indirect interactions mediated by ECs.

Cytotoxicity is a primary issue for assessing the biocompatibility of any nanobiomaterial. Although our previous study found that HANPs did not directly influence the viability or apoptosis of hWJ-MSCs, they may still exert different impacts via the mediation of other cells [28]. Thus, it was necessary to evaluate the cytotoxic effects of HANPs on hWJ-MSCs mediated by HUVECs. Interestingly, after incubation in CM for 24 h and 72 h, hWJ-MSC viability was maintained and even elevated in the 0–50 µg/mL HANP groups, especially in the np20 group, indicating the existence of effector molecules in the CM. When the concentration of HANPs reached 100 µg/mL, they became cytotoxic to the hWJ-MSCs. However, 0–100 µg/mL m-HAP had no influence on hWJ-MSC viability (Fig. 3). Jiang et al. have shown that engineered nanoparticles of a particular size can have distinct endocytic routes and kinetics associated with altered downstream signaling involved in regulating target cell functions [29]. In our previous study, we showed that np20 and np80 were endocytosed by HUVECs, and this was followed by morphologic changes and the appearance of large vacuoles, indicating the activated state of the HUVECs. Additionally, np20, with their faster uptake speed and increased accumulation, might result in a stronger activation of HUVECs, possibly resulting in increased hWJ-MSC viability via paracrine signaling. Conversely, few m-HAPs can be endocytosed by HUVECs, and this might account for their limited influence on the metabolism of hWJ-MSCs [9].

To further explore the potential osteoinductive effect of activated HUVECs, a subcytotoxic dose of 50 µg/mL HAPs was used in subsequent studies. The CM collected from the activated HUVECs promoted extracellular calcium deposition, ALP activity, and osteogenic proteins expression in hWJ-MSCs, as well as the mRNA expression of osteogenic genes (Figs. 4, 5). Runx2, an essential transcription factor involved in specifying the osteoblast lineage [30], showed a substantial enhancement in the np20 group, indicating a strong osteoinductive effect on hWJ-MSCs (Fig. 4a and Fig. 5c, d). The np20 group demonstrated a 1.5-fold improvement in COLI expression at Day 7 (Figs. 4b, 5c, d) and a double increase at Day 14, which implied the presence of additional differentiated osteoblasts in the HANP-treated groups (Fig. 4b) [30]. OCN is a mature stage bone marker [31], and this gene showed a significant increase in the HANP groups at Day 14 (Fig. 4c), indicating that np20 and np80 can accelerate bone maturation compared to m-HAP. ALP is an early marker of osteoblast differentiation, and it obviously increased with culture time in each group, especially the np20 group, revealing that additional transformation occurred from MSCs to osteoblasts (Fig. 4d). Pluripotency markers, NANOG, OCT3/4, and SOX2 imply the capacity for differentiation [32]. As shown in Fig. 4e–g, the decreased expression in the genes of the HANP groups implied that most of the hWJ-MSCs in HAP groups had transformed into osteoblasts.

Our data demonstrated that the endocytosis of HANPs by HUVECs was associated with an improved osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. However, the cause of this outcome is currently unclear. In terms of the paracrine function of HUVECs, we focused on soluble differentiation-inducing proteins in the supernatant of activated HUVECs. HIF-1α signaling is essential in coupling ossification and angiogenesis during bone regeneration [33, 34]. Heikal et al. reported that injured ECs secrete more HIF-1α even under normoxia conditions [35]. It has also been shown that exposure to HANPs inhibits the angiogenic ability of HUVECs [9]. Thus, we measured the concentrations of HIF-1α in the CM, and the results showed that the HIF-1α content increased in the HANP treatment groups compared to the m-HAP and control groups (Fig. 6a). To identify the role of HIF-1α in the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, we used 2-MeOE2, which is a specific HIF-1α inhibitor, was used. The decreased concentration of HIF-1α paralleled the impaired mineralized matrix deposition and ALP activity in these hWJ-MSCs, indicating that HANPs can promote the HIF-1α production of HUVECs to facilitate the osteogenesis of hWJ-MSCs (Fig. 7).

To properly apply HANPs for use in bone tissue engineering, it is necessary to gain further insights into the mechanisms by which HANPs promote the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs mediated by HUVECs. The ERK1/2 pathway is downstream of HIF-1α [36] and is fundamental to the differentiation of MSCs [37]. In this work, the concentrations of HIF-1α in the CM coincide well with the p-ERK1/2 levels in the hWJ-MSCs (Fig. 6b, c). When 2-MeOE2 was applied, the p-ERK1/2 expression in the hWJ-MSCs failed to be activated, indicating that HIF-1α functioned upstream of ERK1/2 signaling. To directly address the role of ERK1/2 signaling in the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, PD98059, a specific MEK inhibitor, was used. The suppression of ERK1/2 signaling resulted in the lowest osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. One possible reason for this occurrence is that the ERK1/2 pathway plays a key role in both HIF-1α signaling and in the apoptosis and proliferation signaling pathways, which could be responsible for the observed changes in osteogenic differentiation in these cells [38, 39]. Additionally, this could also be related to the presence of vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is one of the downstream effectors of HIF-1α signaling [33], and it can also promote the osteogenic differentiation of MSCs via activation of the ERK1/2 pathway [37]. Our previous study found that np20 induced the production of VEGF in HUVECs [9]; therefore, it is possible that the suppression of the ERK1/2 pathway may result in inhibition of VEGF, which would lead to the decreased osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. According to the available experimental results, we can summarize as follows. HANPs are able to more optimally process better direct [5] and indirect osteoinductive effects than m-HAPs. Compared to autogenous bone grafts and bone allografts, there is an extensive source of HANP and without secondary damage and potential immunogenicity. However, compared to m-HAPs, HANPs can suppress the angiogenic ability of HUVECs [9] and exhibit slight cytotoxicity in both a time- and dose-dependent fashion.

Recently, growing evidence has demonstrated the importance of HIF-1α in the bone regeneration. However, few studies have been able to quantitatively predict the MSC differentiation rate under specific initial conditions, such as the HIF-1α concentration. Taking cell proliferation, apoptosis, and osteogenic differentiation into account, we present a mathematical model that combines a two-stage cell lineage with HIF-1α that is highly correlated with our experimental data. By fitting the differentiation rate of hWJ-MSCs in 0–4000 pg/mL HIF-1α, we acquired the equations for describing the differentiation rate, HIF-1α concentration, and time. As shown in Fig. 8d, this model can depict the cell number map under different HIF-1α concentrations, so that it is possible to explore the intrinsic dynamics of the two-stage system [40]. Additionally, this model mathematically validates the effect of HIF-1α on the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. Moreover, based on a multi-stage cell-lineage model and logistic model, our model is sufficiently stable to enable long-term predictions without falling into the trap of population unlimited explosion [41].

By using the existing experimental data, both the cell number and differentiation rate can be predicted with a defined initial cell seeding density and HIF-1α concentration. As such, the optimum incubation time is also obtained. Consequently, we can predict the optimum concentration of HIF-1α and determine the most optimal time for osteogenesis, which is important for efficient tissue engineering. A two-stage cell-lineage model is applicable for predicting the proliferation and differentiation of stem cells, which have two cell lineages. On this basis, the model founded on the initial conditions and existing experimental data can be established to identify the optimum culture conditions in vitro, which will assist in optimizing bone repair in vivo.

Conclusion

In this study, we explored the specific biological effects of HANPs on hWJ-MSCs mediated by HUVECs. Compared to m-HAPs, both np20 and np80 showed slight cytotoxicity in both a time- and dose-dependent fashion. Importantly, the size of the HANPs appeared to have no significant impact on this cytotoxicity. Our data also showed that HANPs, especially np20, were capable of facilitating HUVECs to secrete increased levels of HIF-1α, which directly correlated with the enhanced osteogenic differentiation of hWJ-MSCs via the activation of the ERK1/2 pathway (Fig. 9). More remarkably, the results from the two-stage cell-lineage model suggested that HIF-1α exerted a dose-dependent stimulatory effect on the osteogenic differentiation rate of hWJ-MSCs. Additionally, the optimum concentration of HIF-1α and incubation time were estimated based on the initial conditions using an in vitro model, which could be invaluable in the future for tissue engineering applications. Collectively, these observations provide evidence that HANPs may improve bone regeneration by modulating cell–cell interactions.

A schematic illustration of the possible mechanisms

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données utilisés et analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Abréviations

HA:

Hydroxyapatite

HANPs:

HA nanoparticles

hWJ-MSCs:

Human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cell

m-HAP:

Micro-sized HAP particles

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

ECM:

EC medium

2-MeOE2:

2-Methoxyestradiol

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

RUNX-2:

Runt-related transcription factor 2

Col I:

Type I collagen

OCN:

Osteocalcin

ALP:

Alkaline phosphatase

SOX 2:

SRY-related HMG-box 2

ERK:

Extracellular signal-related kinases

VEGF:

Vascular endothelial growth factor