Nanoparticules multifonctionnelles augmentées par ultrasons focalisés de faible intensité pour l'intégration de l'imagerie par ultrasons et de la thérapie synergique du cancer du sein métastatique

Introduction

Le cancer du sein a hanté les femmes pendant des années comme l'une des tumeurs malignes les plus menaçantes. En raison de la grande hétérogénéité et de la capacité métastatique élevée, il est rapporté que les métastases à distance du cancer du sein représentaient plus de 90 % de sa mortalité, alors que le taux de survie à 5 ans des patientes avancées ou métastasées n'est que de 26 %, ce qui entraîne une mauvais résultat clinique [1,2,3]. La caractérisation négative du cancer du sein a rendu difficile sa guérison complète, ce qui fait que la stratégie de traitement est plus difficile à éliminer la tumeur primaire ainsi que la métastase à distance.

Les approches thérapeutiques traditionnelles telles que la chirurgie et la chimiothérapie sont toujours considérées comme efficaces dans le traitement du cancer du sein [4]. Parmi tous les médicaments chimiothérapeutiques, le docétaxel (DTX) joue un rôle important dans le traitement du cancer du sein métastatique (MBC) et du cancer du sein avancé (ABC) [5]. En tant que médicament antitumoral de première intention synthétisé par les substances chimiques de l'if, l'effet antitumoral du DTX est principalement obtenu en détruisant la mitose et la prolifération cellulaire [6]. Grâce à son efficacité antitumorale étendue, le DTX est en train de devenir l'un des agents chimiothérapeutiques les plus efficaces dans le traitement du cancer du sein [7]. Cependant, l'agent chimiothérapeutique induit généralement des effets indésirables ainsi qu'une toxicité pour l'ensemble du corps, qui ont fortement limité l'efficacité thérapeutique [8]. Par ailleurs, différentes étapes cliniques et diverses conditions personnelles révèlent qu'une seule approche thérapeutique peut ne pas être suffisamment efficace pour répondre à toutes les attentes dans le traitement du cancer du sein. Par conséquent, il est urgent de réduire les effets secondaires toxiques et d'améliorer l'efficacité du traitement du DTX dans les futures exigences d'application.

L'échographie a d'abord été explorée dans le diagnostic clinique en raison de ses avantages extraordinaires tels que l'absence de rayonnement, le caractère non invasif et la rentabilité [9, 10]. Malgré les caractéristiques uniques mentionnées ci-dessus, il a également attiré beaucoup d'attention dans les perspectives thérapeutiques basées sur des matériaux nanostructurés [11]. La thérapie sonodynamique a été initialement réalisée par la cavitation et « l'effet de sonoporation » déclenché par les ultrasons. La génération de ROS au cours de ce processus induit efficacement une cytotoxicité envers les cellules cancéreuses, entraînant des dommages rapides à l'ADN et l'apoptose des cellules tumorales [9]. Contrairement à l'emploi superficiel de la thérapie photodynamique (PDT), la SDT obtient un résultat thérapeutique plus agréable dans le traitement des tumeurs profondes par ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU), qui a le mérite de prévenir les lésions thermiques indésirables pendant le traitement [12, 13]. En tant que l'un des éléments essentiels de la TSD, les sonosensibilisateurs ont été explorés dans diverses thérapies tumorales [14]. Le chlore e6 (Ce6) était à l'origine utilisé comme photosensibilisateur commun, mais sa capacité thérapeutique souhaitable et son excellente affinité avec le tissu tumoral l'ont rendu capable de s'appliquer également comme sonosensibilisateur [15]. Joué comme une deuxième génération de la famille du chlore, Ce6 a suscité une grande attention dans le traitement des tumeurs pour sa génération ROS souhaitable [16]. Cependant, l'application unique de Ce6 a constamment suscité une instabilité ainsi qu'une toxicité cutanée indésirable, qui ont toutes limité l'exploration approfondie du SDT.

Ces dernières années, le développement de la nanotechnologie a joué un rôle très important dans de nombreux domaines, notamment la biodétection, la pollution de l'environnement et la dégradation des contaminants [17,18,19,20,21,22,23]. Les nanoparticules basées sur la nanotechnologie présentent de nombreux avantages, tels qu'un diamètre plus petit, une surface externe plus grande et une résistance à la diffusion interne plus faible [24]. Auparavant, les nanoparticules ont été impliquées dans l'application de divers matériaux tels que le MOF [25], le dioxyde de titane [26] et le graphène [21]. La tendance à la croissance rapide des nanotechnologies combinées au traitement du cancer a également été largement explorée, ouvrant ainsi la voie à la promotion d'une stratégie thérapeutique combinée [27]. Pour réaliser des applications thérapeutiques efficaces contre les tumeurs, les nanoparticules délicatement conçues sont principalement conçues pour améliorer l'efficacité du transport des agents de chimiothérapie toxique via l'effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR), permettant une accumulation accrue dans le site tumoral [28, 29]. De plus, l'effet secondaire indésirable pourrait également être diminué grâce à l'encapsulation de la chimiothérapie. Il a été rapporté que le perfluoropentane (PFP) possède une capacité exceptionnelle de transformation de la phase liquide à la phase gazeuse sous irradiation, qui pourrait être appliquée comme une nouvelle sonde moléculaire à ultrasons, en particulier dans l'imagerie et le traitement par ultrasons [30]. Plus important encore, la phase liquide initiale permet au PFP d'être facilement encapsulé dans divers matériaux [31]. En outre, l'encapsulation de PFP peut considérablement améliorer la capacité d'imagerie par ultrasons au niveau du site tumoral selon l'effet EPR mentionné ci-dessus et éviter la limitation de taille provoquée par des microbulles plus grosses. À l'exception de l'imagerie tumorale, la combinaison de plusieurs approches thérapeutiques est d'une valeur énorme dans le traitement du cancer axé sur les nanosystèmes. Plus précisément, les pratiques comprenant l'intégration de la thérapie sonodynamique et de la chimiothérapie ont mis l'accent sur la révolution des efficacités thérapeutiques traditionnelles. Xu et al. [32] ont démontré qu'en raison de la TSD, un résultat thérapeutique amélioré pouvait être révélé avec des médicaments de chimiothérapie et ainsi conduire à l'activation de l'apoptose des cellules tumorales ciblées sur les mitochondries. Ce modèle dévoile le traitement synergique, qui est très concerné par l'utilisation future.

Ici, avec les inspirations mentionnées ci-dessus, nous avons l'intention d'utiliser les nanoparticules tout-en-un (CPDP NP) pour établir un système diagnostique et thérapeutique, qui est réalisé par la thérapie synergique orientée SDT combinée à la chimiothérapie, ainsi que l'amélioration de la imagerie par ultrasons. Possédant l'excellente sécurité et la stabilité métabolique idéale en tant que nanosupport souhaitable, la PLGA l'a rendu favorable à l'exploration de diverses capacités antitumorales [33, 34]. Par conséquent, dans cette stratégie, en utilisant le PLGA comme matériau de couche extérieure, le PFP pourrait améliorer considérablement l'imagerie par ultrasons grâce à sa capacité de déphasage déclenchée par LIFU, tandis que Ce6, un sonosensibilisateur souhaitable de deuxième génération, pourrait également être exposé au LIFU pour induire la génération de ROS. De plus, accompagnés de la libération de DTX, la chimiothérapie et le SDT seront réalisés pour obtenir une thérapie synergique à terme. Il est important de noter que la structure noyau-enveloppe des NP CPDP peut être administrée de manière constante sans endommager les tissus ou les cellules normaux et permet également aux nanoparticules d'avoir une efficacité d'encapsulation relativement plus élevée [35]. De plus, le contenu pourrait être bien protégé dans cette structure cœur-enveloppe [36,37,38], en particulier pour les PFP, qui peuvent être efficacement transformés de liquide en gaz en raison de l'existence de la structure. En utilisant cette structure core-shell, la stratégie synergique pourrait être simultanément démontrée de manière plus stable. Premièrement, la stratégie synergique permet de réduire de manière significative l'effet secondaire du DTX par une encapsulation efficace, ce qui est d'une grande importance pour soulager la souffrance dans le traitement des tumeurs malignes et agressives; deuxièmement, par rapport à la chimiothérapie unique, l'association du TSD et de la chimiothérapie s'est avérée être une stratégie prometteuse pour renforcer l'efficacité thérapeutique. Troisièmement, l'imagerie ultrasonore améliorée réalisée par PFP a optimisé la stratégie de diagnostic et a également permis de vérifier l'efficacité antitumorale. Dernier point mais non le moindre, l'ensemble du système est sûr et stable avec une excellente biocompatibilité. Il est souligné que dans cette stratégie, les métastases pulmonaires ainsi que la croissance tumorale ont été remarquablement inhibées à la fois in vitro et in vivo. En conclusion, la stratégie synergique a démontré une efficacité de traitement productive contre la tumeur maligne du sein et ses métastases à distance, et combinée à sa capacité d'imagerie par ultrasons, elle pourrait devenir la stratégie de traitement prometteuse dans d'autres applications cliniques.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Le PLGA-COOH (Mw 12 000 Da) a été acheté auprès de Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, Chine). Le perfluoropentane (PFP) et l'agarose ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO). Le chlore e6 (Ce6) a été acheté auprès de Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, Chine). Le kit d'essai de cytotoxicité Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été obtenu auprès de Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japon). Le diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCFDA) a été acheté auprès de MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA). L'iodure de propidium (PI) a été obtenu auprès de Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Pékin, Chine). L'annexine V-FITC/PI a été obtenue auprès de BD Biosciences (USA). Le docétaxel (DTX) a été acheté auprès de MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA). Tous les autres réactifs étaient des produits analytiques purs sans autre purification. Le milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (DMEM), le sérum bovin fœtal et la tyrisine ont été achetés auprès de Gibco (ThermoFisher Scientific, États-Unis) et d'un spectrophotomètre UV (UV-Vis, Hitachi, Japon).

Synthèse des NP CPDP

Des nanoparticules Ce6-PFP-DTX/PLGA (CPDP NPs) ont été préparées par une méthode de double émulsion E/H/E selon le rapport précédent [39, 40]. En bref, 2 mg de Ce6 ont d'abord été dissous dans 500 μL de méthanol. Ensuite, 50 mg de PLGA-COOH et de docétaxel (2 mg) ont été dissous dans 4 mL de dichlorométhane, puis la solution précédente y a été ajoutée simultanément. Ensuite, 200 μL de PFP ont été ajoutés à la solution ci-dessus. En conséquence, le mélange a été déclenché par une sonde à ultrasons (Sonics &Materials Inc., USA) pour obtenir une première émulsion (5 s on et 5 s off, 3 min). Pour acquérir la deuxième émulsion, 8 mL d'une solution d'alcool polyvinylique (PVA) (p/v  =  4%) ont été ajoutés à l'émulsion ci-dessus, en utilisant la même sonde à ultrasons pendant 2 min. Après avoir ajouté 10 mL d'alcool isopropylique à 2 % dans l'émulsion finale, la solution a été mélangée mécaniquement à température ambiante pendant au moins 4 h pour que le dichlorométhane se volatilise totalement. Enfin, les NP de CPDP ont été centrifugées trois fois (12 000 tr/min, 5 min), puis collectées et stockées à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Les NP PDP ont été préparées de la même manière à l'exception de Ce6. Tous les processus expérimentaux ont été opérés au-dessus de la glace et menés strictement dans l'obscurité.

Caractérisation des NP CPDP

La taille des particules et le potentiel zêta des CPDP NPs et PDP NPs ont été réalisés par l'instrument Malvern Zetasizer Nano (Malvern, Royaume-Uni). La morphologie a été caractérisée par microscopie électronique à transmission (MET) et microscopie optique. Pour évaluer la stabilité, les CPDP NPs ont été dissous dans une solution tamponnée au phosphate (PBS) et ont mesuré les tailles de 7 jours, respectivement. Chaque échantillon a été mesuré en triple. L'efficacité d'encapsulation des CPDP NPs a été calculée à l'aide de la formule suivante :

Efficacité d'encapsulation (%) = (Poids de chargement DTX ou Ce6/Poids de DTX total ou Ce6) × 100%. Pour vérifier l'encapsulation des différents matériaux, les spectres UV-Vis de divers échantillons ont été étudiés (UH5300, Hitachi). L'encapsulation effective a également été analysée par TEM.

Taux de libération de drogue des IP du CPDP

Pour évaluer la capacité de libération de médicament de Ce6 et de DTX dans les CPDP NP, deux solutions avec des pH différents (solution tampon phosphate, PBS :7,4, solution tampon acétate, ABS :5,6) ont été utilisées pour tester l'efficacité de libération cumulative. En bref, les NP de CPDP ont d'abord été dispersées avec 1 mL de PBS ou d'ABS après que le mélange a été scellé dans un sac de dialyse (Mw :10 000 ); la solution entière a ensuite été transférée dans une bouteille en verre (volume total :150 mL) dans laquelle 149 mL de PBS ou d'ABS ont été ajoutés pour maintenir le volume total de solution à 150 mL. La bouteille en verre a ensuite été placée dans un agitateur à température constante de 37 °C, et à différentes périodes (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h), la solution a été recueillie et immédiatement complétée avec le même volume de milieu. Chaque groupe a été répété trois fois. Enfin, les concentrations de Ce6 et de DTX ont été mesurées par Synergy Hybrid Multi-Mode Read (BioTek, États-Unis) à 403 et 229 nm, respectivement, et le taux de libération de médicament à chaque instant a été calculé.

Imagerie échographique in vitro

Pour étudier la capacité ultrasonore des NP CPDP, l'émulsion (1 mg/mL) a d'abord été déclenchée par un équipement de transducteur à ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) (Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center, Chongqing, Chine), et le motif conducteur a été défini comme un cycle d'utilisation de 50 %, durée d'impulsion de 1 s sous différentes intensités (1 à 2 W/cm ² ) pour des durées différentes. Pour l'imagerie par ultrasons, des NP CPDP irradiées ont été ajoutées au modèle d'agarose préparé précédent, respectivement, à l'aide de l'instrument de diagnostic par ultrasons Philips EPIQ5 (fréquence de la sonde :12 MHz, MI :0,06) pour observer à la fois l'imagerie 2D et CEUS des NP CPDP. Pendant ce temps, le logiciel ImageJ a été appliqué pour analyser la valeur en niveaux de gris de chaque groupe.

Captation cellulaire et génération de ROS in vitro de CPDP NP par irradiation LIFU

La lignée cellulaire murine de cancer du sein 4T1 a été obtenue de la banque de cellules de Shanghai de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine) et incubée dans un milieu RPMI 1640 mélangé avec 10 % de FBS et 1 % de streptomycine/pénicilline à 37 °C dans un mélange à 5 % de CO ₂ incubateur humidifié.

Les cellules 4T1 ont d'abord été incubées dans les conditions précédentes à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules par boîte pour tester l'absorption cellulaire à l'aide du CLSM à différents intervalles de temps (1 h, 2 h, 4 h, 8 h). Pour vérifier la génération de ROS, les cellules ont été séparées dans les 5 groupes suivants :contrôle, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. Après 24 h de culture conventionnelle, le milieu a été remplacé par des CPDP NPs (200 μL, 0,8 mg/mL) ou une solution de Ce6 (200 μL), respectivement, et les cellules ont été co-incubées pendant 3 h supplémentaires. Puis, irradiation LIFU (2 W/cm ² , 120 s) a été menée, respectivement, selon différents groupes. Après la co-incubation et le traitement LIFU, 100 L de solution diluée de DCFH-DA ont été ajoutés et chaque groupe a été cultivé dans l'incubateur précédent pendant 15 min. Un microscope confocal à balayage laser (CLSM) a été utilisé pour confirmer le résultat de la production d'espèces réactives de l'oxygène, et les intensités de fluorescence correspondantes ont été mesurées par le logiciel ImageJ.

Cytotoxicité in vitro et capacité de traitement concertée des NP CPDP

Un test CCK-8 a été appliqué pour évaluer la cytotoxicité des NP CPDP. Brièvement, des cellules de cancer du sein murin 4T1 ont été incubées dans une plaque à 96 puits, avec une densité de 1 × 10 ⁴ par puits pendant 24 h. Ensuite, les NP de CPDP ont été diluées avec du milieu RPMI 1640 sans sérum à diverses concentrations (0,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/mL, n = 3), avec ou sans irradiation LIFU (2 W/cm ² , 120 s). Après 24 heures supplémentaires de co-culture, la viabilité cellulaire des cellules 4T1 a été réalisée.

Pour évaluer l'efficacité de l'apoptose cellulaire d'un traitement concerté, les cellules 4T1 ont été co-cultivées comme précédemment pendant 24 h, puis séparées en cinq groupes suivants :(1) contrôle (sans aucun traitement), (2) LIFU (uniquement avec une exposition au LIFU à 2 W/cm ² ), (3) CPDP NPs (uniquement avec une solution de CPDP NPs à 0,8 mg/mL), (4) PDP NPs + LIFU et (5) CPDP NPs + LIFU. Après diverses co-incubation de nanoparticules (200 μL) et exposition au LIFU, chaque groupe a été traité avec de l'annexine V (5 μL) et de l'iodure de propidium (5 μL) en double coloration pendant 20 min et analysé par un protocole de cytométrie en flux.

Inhibition in vitro des métastases cellulaires

Pour étudier l'inhibition de la capacité métastatique cellulaire, un test de cicatrisation des plaies et un test transwell ont été conçus. Pour le test de cicatrisation des plaies, les cellules 4T1 ont été cultivées de manière conventionnelle comme précédemment dans la plaque à 6 puits. Après croissance cellulaire à une confluence de 80 %, une pointe de pipette (10 μL) a été appliquée pour effectuer une rayure artificielle le long du centre de la plaque à 6 puits. Ensuite, les cellules ont été traitées dans les mêmes groupes mentionnés ci-dessus. Après une co-incubation continue pendant 24 h, les cellules ont été lavées avec du PBS 3 fois et observées sous microscopie optique (Olympus, Japon).

Pour le test transwell, le compartiment supérieur de la chambre transwell (Corning, San Diego, USA) a été principalement appliqué pour imiter la matrice extracellulaire in vivo. Cellules 4T1 à une densité de 1 × 10 ⁵ les cellules par puits ont été ensemencées dans la chambre supérieure dans un milieu RPMI 1640 sans sérum, tandis que le compartiment inférieur a été rempli d'un milieu de culture complet mélangé à 10 % de FBS. Ensuite, les cellules ont été séparées de la même manière que les groupes ci-dessus et traitées pendant 24 h, respectivement. Après cela, les cellules de la surface inférieure ont été fixées avec du paraformaldéhyde et colorées avec du cristal violet. Les résultats ont été observés en microscopie optique (Olympus, Japon).

Imagerie échographique in vivo

Des souris BALB/c femelles saines (4 semaines) et des souris Kunming (4 semaines) ont été obtenues auprès du Ningxia Medical University Laboratory Animal Center. Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux directives approuvées par le Comité d'examen éthique du bien-être animal de l'Université médicale du Ningxia. Pour établir le modèle de souris porteuses de tumeurs, des souris BALB/c ont été inoculées avec des cellules de cancer du sein 4T1 (1 × 10 ⁷ /mL) sur le flanc droit. Après que la taille de la tumeur ait atteint 60 à 80 mm ³ , des souris BALB/c ont reçu une injection de CPDP NP (200 μL, 1 mg/mL) par la veine caudale par voie intraveineuse. 24 h plus tard, les sites tumoraux des souris ont été réalisés avec du LIFU (2 W/cm ² , 120 s), puis, les images 2D et CEUS ont été acquises via l'instrument de diagnostic par ultrasons Philips EPIQ5 mentionné précédemment. L'analyse en niveaux de gris a été mesurée par le logiciel ImageJ.

Efficacité thérapeutique synergique in vivo des IP CPDP

Après l'inoculation des cellules cancéreuses 4T1, la taille de la tumeur a été enregistrée tous les deux jours et le volume de la tumeur a été calculé par la formule suivante :Volume = 1/2 × Longth × Width ² . La taille de la tumeur et le poids corporel des souris ont été enregistrés tous les 2 jours, tandis que les images de la croissance tumorale ont été enregistrées tous les 3 jours. Lorsque le volume tumoral atteint 60 à 80 mm ³ , des souris avec une taille de tumeur similaire ont été réparties au hasard dans les cinq mêmes groupes :contrôle, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU et CPDP NPs + LIFU (n = 3). Chaque groupe a reçu une injection intraveineuse de diverses NP (200 L) via la veine caudale, à l'exception du groupe témoin (200 μL de PBS à la place). Vingt-quatre heures plus tard, le site de la tumeur a été exposé avec une irradiation LIFU (2 W/cm ² ) pendant 120 s. L'ensemble de l'administration du SDT a été répété tous les 3 jours et a duré 18 jours. Le poids corporel et le volume tumoral des souris ont été mesurés et calculés. Après le traitement, les souris ont été tuées et les tissus tumoraux ont été envoyés à H&E, TUNEL et PCNA pour une analyse histologique plus poussée.

Biosécurité des IP CPDP In Vivo

Pour étudier la biosécurité des nanoparticules CPDP in vivo, des souris Kunming femelles en bonne santé (n = 3) ont été séparés dans les 4 groupes suivants :contrôle, 5 mg/mL, 10 mg/mL et 20 mg/mL. Les NP CPDP (200 μL) ont été injectées dans la veine de la queue de la souris ; ensuite, les souris ont eu libre accès à la nourriture et à l'eau sans aucune autre administration. Le poids corporel des souris a été mesuré tous les 2 jours. Après 30 jours, les souris ont été tuées et les échantillons de sang ont été prélevés pour analyse des cellules sanguines et biochimie. Les principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) ont été collectés et étudiés pour la coloration H&E, respectivement.

Inhibition in vivo des métastases pulmonaires

Pour évaluer l'inhibition des métastases pulmonaires de chaque groupe, l'ensemble du processus a été mené en observant le nombre de nodules métastatiques dans les poumons ainsi qu'une évaluation histologique de la coloration H&E. Après que toutes les souris aient été euthanasiées, les tissus pulmonaires ont été retirés et fixés; ensuite, des photographies de nodules cancéreux ont été prises et les tissus pulmonaires ont été analysés plus avant avec une coloration H&E.

Analyse statistique

Les données de mesure ont toutes été effectuées 3 fois et exprimées en moyenne  ±  écart-type (SD) et analysées par ANOVA à un facteur ou un t standard de Student. tester via le logiciel SPSS (version :19.0), tandis que p value < 0.05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Caractérisation des IP du CPDP et efficacité de la libération des médicaments

Une méthode à double émulsion a été appliquée à la fabrication de CPDP NPs, qui ont encapsulé à la fois le matériau à déphasage PFP, le sonosensibilisateur Ce6 et le chimio-médicament DTX simultanément. Lorsqu'elle est dispersée dans du PBS ou de l'eau déminéralisée, la solution présente un aspect gris clair. Les NP CPDP présentaient une forme sphérique homogène et une structure noyau-enveloppe claire, qu'elles soient observées par microscopie optique ou microscopie électronique à transmission (Fig. 1a, b). Les diamètres moyens des CPDP NPs et PDP NPs étaient de 249,5 ± 77,46 nm et 246,6 ± 81,01 nm, et les potentiels zêta de surface moyens étaient de − 18,47 ± 0,55 mV et − 3,987 ± 0,66 mV, respectivement (Fig. 1c, d). La taille des NPs CPDP garantissait qu'elles pouvaient s'accumuler passivement dans le site tumoral par effet EPR [40]. La charge différente entre les CPDP NPs et PDP NPs est principalement due au Ce6 chargé négativement [41]. De plus, le potentiel zêta négatif des NP CPDP indiquait une adsorption plus faible des protéines plasmatiques, vérifiant la stabilité relative des nanoparticules. Les distributions granulométriques ont été maintenues entre une plage de 249,5 et 385,1 nm en 7 jours (Fig. 1e), démontrant la stabilité relative des NP CPDP. Selon la courbe standard, l'efficacité d'encapsulation du DTX et du Ce6 était de 83,84 ± 1,39 % et 60,54 ± 3,79%, respectivement.

un TEM (barre d'échelle :500 nm) et b image au microscope optique de CPDP NPs (barre d'échelle :20 μm). c Distribution des tailles et d potentiel zêta des NP PDP et des NP CPDP. e La distribution de la taille des NP CPDP dans les 7 jours. f Le taux de libération de Ce6 et g le taux de libération de DTX dans différentes conditions (pH 7,4 et pH 5,6, n = 3). h Le spectre UV-Vis des NP Ce6, DTX, PFP/PLGA et CPDP, respectivement. Les flèches des CPDP NPs montrent les pics caractéristiques de Ce6 et DTX, indiquant l'encapsulation efficace des deux matériaux. je Le résultat MET de deux nanoparticules. La nanoparticule PFP/PLGA présente la coque mince et le noyau rond (à gauche). La nanoparticule CPDP encapsulée à la fois dans le Ce6 et le DTX montre la coque beaucoup plus épaisse et le noyau de forme ovale (à droite)

Comme l'efficacité de libération de médicament de Ce6 et de DTX à partir des NP CPDP est indiquée sur la figure 1f, g, une augmentation presque du double de l'indice de libération de DTX a été enregistrée à pH 5,5 par rapport aux nanoparticules dissoutes à pH 7,4, ce qui indique la libération de médicament raisonnable taux de DTX pourrait être atteint efficacement dans un microenvironnement tumoral acide. Les résultats ci-dessus ont tous montré que les NP de CPDP conçues délicates peuvent exercer une libération de médicament chimiothérapeutique régulière et opportune dans l'environnement tumoral acide, et également fondamentalement souhaitable d'être préparées pour le SDT.

Comme l'UV-Vis l'a montré, DTX et Ce6 ont révélé des pics d'absorption uniques à 229 nm et 403 nm, respectivement, et au contraire, PFP/PLGA n'a montré aucun des pics. Il convient de noter que le spectre des NP CPDP présentait des pics similaires à la fois près des deux longueurs d'onde ci-dessus, tandis que le reste montrait la même tendance du spectre PFP/PLGA, indiquant l'encapsulation réussie des divers matériaux (Fig. 1h). Pour vérifier davantage l'encapsulation efficace, la figure 1i a indiqué que la nanoparticule PFP/PLGA possède une coque beaucoup plus mince et un noyau rond, tandis que la nanoparticule CPDP révèle une coque relativement plus épaisse et un noyau de forme ovale en raison de l'encapsulation du DTX et du Ce6.

Imagerie échographique in vitro

Il est souligné que PFP possède une excellente capacité de déphasage. La transformation liquide-gaz aide non seulement les nanoparticules à s'agréger dans le site tumoral, mais permet également à sa capacité d'améliorer l'efficacité de l'imagerie par ultrasons [42]. Pour démontrer cela, l'irradiation LIFU a été appliquée comme déclencheur pour induire la transformation de phase de la PFP, à savoir l'effet de vaporisation acoustique de gouttelettes (ADV) [43]. Les résultats ont montré que les intensités des niveaux de gris étaient maintenues à un niveau relativement bas avant l'irradiation LIFU, tandis qu'après l'augmentation de l'intensité et du temps d'irradiation de LIFU, la tendance à l'imagerie ultrasonore améliorée a été révélée à la fois en 2D et en CEUS (Fig. 2a). L'analyse acoustique d'ImageJ a en outre convaincu le résultat par une valeur élevée en niveaux de gris (Fig. 2b, c), ce qui était cohérent avec les résultats de l'imagerie. Il convient de noter que le résultat le plus significatif de 2D et CEUS obtenu lorsque l'intensité LIFU a atteint 2 W/cm ² et a duré 120 s. Les résultats ci-dessus ont démontré que la PFP était encapsulée avec succès dans les NP CPDP et que la capacité d'imagerie par ultrasons avait été considérablement améliorée sous une intensité plus élevée ainsi qu'une durée d'administration de LIFU plus longue.

un Images échographiques de 2D et CEUS sous différentes intensités LIFU et durées. b L'intensité correspondante en niveaux de gris à différentes intensités et temps d'imagerie 2D et c Imagerie CEUS (**p < 0,01, n = 3)

Captation cellulaire et génération de ROS in vitro de CPDP NP par irradiation LIFU

Comme le montre le résultat du CLSM sur la figure 3, l'absorption cellulaire des NP CPDP a montré une tendance accrue à différents intervalles de temps, atteignant l'agrégation la plus significative à la coincubation de 8 h.

L'absorption cellulaire 4T1 des NP CPDP pendant différents intervalles de temps (Bleu :cellules 4T1 colorées au DAPI. Rouge :NP CPDP étiquetées DiR, la barre d'échelle est de 50 μm)

La stratégie principale de la thérapie sonodynamique (SDT) est la génération de ROS - une série de produits de réduction d'un seul électron - pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses et inhiber la prolifération cellulaire [44]. Il est souligné que lorsqu'il est exposé aux ultrasons, le sonosensibilisateur est susceptible de déclencher la production de ROS ; pendant ce temps, une quantité considérable d'énergie sera libérée pendant tout le processus [45]. Étant donné que les ultrasons et le sonosensibilisateur sont des éléments indispensables pour promouvoir la SDT, la génération intracellulaire de ROS a donc été conçue et analysée pour étudier les différences entre les groupes divisés. Selon la figure 4a, la quantité de ROS générée par le groupe d'irradiation Ce6 libre plus LIFU était négligeable, ce qui peut être dû au fait que le métabolisme rapide de Ce6 libre conduit à une production de ROS insatisfaisante. Au contraire, la plus forte intensité de fluorescence a été révélée par le groupe CPDP NPs + LIFU. On a supposé que le Ce6 encapsulé était bien protégé et avait donc été empêché d'être métabolisé. En conséquence, après la stimulation de LIFU, Ce6 a été libéré pour produire des ROS abondants. En comparaison, aucun signal fluorescent significatif n'a été trouvé dans les autres groupes (Fig. 4b).

un Images CLSM de génération de ROS avec divers traitements et b l'analyse d'intensité FL correspondante (****p < 0,0001, n = 3). Les barres d'échelle mesurent 50 μm

Cytotoxicité in vitro et capacité de traitement concertée des NP CPDP

Le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été introduit pour tester la cytotoxicité in vitro des NP CPDP. À cet égard, différents groupes ont été conçus avec ou sans irradiation LIFU à différentes concentrations. The results indicated that after a 24-h co-incubation without LIFU exposure, there was no obvious effect of the survival rate of CPDP NPs even at the highest concentration (0.8 mg/mL), demonstrating the desirable biosafety of CPDP NPs (Fig. 5a). By contrast, it showed that there was a striking decrease of cell viability after LIFU irradiation, showing the combination of CPDP NPs and LIFU has remarkably triggered 4T1 cell death, which was consistent with the in vitro ROS generation.

un Relative cell viability with or without LIFU irradiation under different CPDP NPs concentrations. b 4T1 tumor cell apoptosis and necrosis by flow cytometry assay and c the data of corresponding necrosis and apoptosis rate analysis (****p  < 0.0001, ***p  < 0.001, n  = 3)

To further evaluate SDT efficacy, a flow cytometry assay was introduced. As the results shown in Fig. 5b, c, the index of cell necrosis and apoptosis was highest observed in CPDP NPs + LIFU group, while other groups showed no obvious and necrosis and apoptosis. Notably, the necrosis and apoptosis rate of CPDP NPs + LIFU group was threefold higher than that of CPDP NPs only group, which ensured the significant tumor cell death efficiency of SDT from another respect. Intriguingly, compared with PDP NPs + LIFU group, cell necrosis and apoptosis rate in CPDP NPs + LIFU group was significantly increased, exhibiting the synergistic therapy efficiency of SDT and chemotherapy.

In Vitro Inhibition of Cell Metastasis

The invasive and migration capability of tumor cells are indispensable in tumor progression [46, 47]. As shown in Fig. 6a, the closure between the physical gap of CPDP NPs + LIFU group was significantly wider than other groups, indicating a relatively slower speed of migrating efficiency. According to the ImageJ software analysis (Fig. 6c), the migration rate of CPDP NPs + LIFU group was also remarkably reduced compared with other groups.

un The wound healing and b The transwell assay after various treatments. c The corresponding migration rate of wound-healing assay. d The corresponding migration number of tranwell assay (****p  < 0.0001, n  = 3)

Similarly in the transwell assay, compared with the swift migration speed of other groups, CPDP NPs + LIFU group revealed a significant reduction of cell number (Fig. 6b), which demonstrated an excellent anti-migration capability of the synergistic therapy. Specifically, with the absence of SDT (CPDP NPs only and LIFU only group), the number of tumor cells was mildly decreased (Fig. 6d). On the whole, due to the combination of SDT as well as chemotherapy, metastasis of 4T1 cells has been remarkably inhibited in vitro.

In Vivo Ultrasound Imaging

Since PFP was encapsulated in CPDP NPs, it is also necessary to evaluate the characteristic ultrasound imaging capability in vivo. After the injection via the tail vein of CPDP NPs, LIFU was then applied to the tumor site to acquire both 2D and CEUS imaging (Fig. 7a). The clear graphic difference between the two groups indicated that after LIFU irradiation, the corresponding intensity of CPDP NPs was elevated obviously compared with the pre-irradiation group. Further data of the average echo intensity also confirmed this result, which was also consistent with the in vitro imaging result previously (Fig. 7b, c).

un 2D and CEUS images with and without LIFU irradiation. b , c The corresponding grayscale intensity analysis measured by ImageJ (**p  < 0.01, *p  < 0.05, n  = 3)

In Vivo Synergistic Therapeutic Efficiency of CPDP NPs

Seeing from Fig. 8a, b, the tumor volume of CPDP NPs + LIFU group was significantly smaller after 18 days of treatment than that of other groups, which may attribute to the effectiveness of ROS originated from SDT treatment as well as chemotherapy to exert a valid synergistic therapy efficiency. Similarly, photographs of mice-bearing tumors (Fig. 8a) also showed the same trend, verifying the cooperative treating efficacy of CPDP NPs triggered by LIFU exposure. Furthermore, there was no obvious weight reduction of mice between different groups (Fig. 8c). The results above all indicated a much higher inhibition rate of CPDP NPs + LIFU group, revealing that the synergistic therapy could significantly prevent tumor growth.

un Images of tumor-bearing mice under various treatments within the certain 18 days (n = 3). b Tumor volume analysis according to various treatments (**p < 0.01). c Weights of tumor-bearing mice under various treatments (ns no significance, n = 3). d H&E, PCNA and TUNEL results under various treatments (scale bar:200 μm). e  Analysis of PCNA proliferation index of tumors under various treatments. f Analysis of TUNEL apoptotic index of tumors under various treatments (****p <0.0001, n =3)

To further testify the therapeutic results of all groups, both H&E, PCNA, and TUNEL staining were utilized (Fig. 8d). The proliferate rate of PCNA in CPDP NPs + LIFU group was only 20.50%, which was fourfold lower than control group, threefold lower than LIFU and CPDP NPs only group and twofold lower than PDP + LIFU group, respectively, demonstrating a significant anti-tumor proliferation rate (Fig. 8e). As it is shown in Fig. 8d, f, the TUNEL results indicated CPDP NPs + LIFU group exhibited an obvious apoptosis index of 72.86%, which was much higher than control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), and PDP NPs + LIFU (37.06%) group. The results above all demonstrated the effectiveness of synergistic therapy exerted in vivo, which was also proved consistent with the previous in vitro results.

Biosafety of CPDP NPs In Vivo

Despite the effective therapeutic outcome, it is of great importance to explore the biosafety of the novel established nanoparticles as well. On behalf of the safe distribution of CPDP NPs in vivo, the metabolic safety was conducted. The results showed that instead of apparent body weight loss, the mice body weight elevated gradually in all the groups of mice (Fig. 9a), which indicated a negligible negative influence of CPDP NPs. In addition, as various organs and the blood samples exhibited in Fig. 9b, no significant changes were observed in blood cell, biochemistry analysis index, and H&E staining (Fig. 9c) among different treating groups, indicating the excellent biosafety of CPDP NPs in vivo.

un The weights of healthy Kunming mice under various concentrations of CPDP NPs (n = 3). b The blood biochemistry and blood routine examination under various concentrations of CPDP NPs within a certain period of 30 days (n = 3). c H&E results of different organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of mice under the same treatment (scale bar:50 μm)

In vivo Inhibition of Lung Metastasis

It is well established that the lung is the main target organ for distant metastasis of breast cancer [48]. In order to evaluate the suppressing efficiency of metastasis, lung tissues of mice were utilized for anti-metastatic investigation. As seen from Fig. 10a, b, compared with control, LIFU, CPDP NPs, and PDP + LIFU group, the CPDP NPs + LIFU group exhibited the most remarkable decrease of lung nodules, which suggested its desirable lung metastatic inhibition efficiency. A similar trend of decreasing also further indicated by H&E staining (Fig. 10c), which in all demonstrated this synergistic therapy strategy could exert effective effort in eliminating lung metastasis in mice.

un Images of the general appearances of lung tissues. b The analysis of the metastatic lung nodules between various treatments (**p  < 0.01, n = 3). c Corresponding images of lung metastatic H&E staining results (scale bar:50 μm)

Discussion

It has been greatly acknowledged that the metastasis of breast cancer will extensively influence its poor prognosis [3, 49]. As a desirable therapeutic approach, SDT may serve for its high efficiency and deep penetrating capability has been extensively convinced [11, 50]. Admittedly, since certain limitations exist in the single application of sonosensitizers, using SDT alone may still be less sufficient in further cancer exploration. The development of nanotechnology combined with clinical medicine has been promoted significantly in recent years, owning to the inspiring merits such as negligible toxicity, none invasiveness, and excellent biocompatibility. Using this novel approach, researchers have made many efforts in exploring multifunctional therapeutic strategies to enhance antitumor efficiency.

The biosafety is the priority of nano-agents. As a widely accepted material approved by the Food and Drug Administration (FDA) certification, it is highlighted that PLGA could be performed as a desirable carrier in application [51, 52]. Based on its advantages, we established a nano-system to realize multifunctional therapy efficiency, exploiting PLGA as the outer structure to encapsulate sonosensitizer Ce6, phase-shift material PFP and chemotherapeutic agent DTX. The CPDP nanoparticles (CPDP NPs) were primarily observed by the core–shell structure and appropriate size so that a desirable aggregation through the EPR effect could be achieved. The cell viability of CPDP NPs has been proved to be above 80% after 24-h coincubation, indicating the well safety of this nanoplatform. Besides, the phase transformation of encapsulated PFP has also guaranteed CPDP NPs as a contrast-enhanced agent when activated by LIFU. The enhanced ultrasound imaging capability will not only ensure the ideal therapeutic window but also promote the promising future for CPDP NPs to realize an integration of accurate diagnosis and precise treatment.

The key strategy in SDT is the generation of ROS. Compared with the single employment of Ce6, the encapsulated Ce6 in PLGA exerted a desirable protection, which could be verified by the ROS result. In our study, there was only a negligible amount of ROS generated by single use of Ce6, while nanoparticle-encapsulated Ce6 produced a considerable amount of ROS, which was further proved by SDT efficiency. The result indicated that ROS generation was preserved by the encapsulated Ce6 in CPDP NPs, which could lay a firm foundation for later tumor inhibition. Besides, the drug-releasing rate showed even at pH 5.5, little Ce6 was released from nanoparticles, demonstrating a well protection of sonosensitizer by PLGA, which was further proved by the ROS production and SDT outcome with high efficiency. Interestingly, the drug-releasing efficiency of DTX and Ce6 at pH 5.5 was quite different according to the results (more than 40% and around 20%, respectively), which may possibly cause by the diverse encapsulation efficiency of the two drugs. The minor releasing rate of Ce6 demonstrated that it could be effectively protected in PLGA so that substantial ROS generation through LIFU stimulation could be reached to get a more convinced SDT efficiency. Another reason for this difference may be due to the different solvents of the two drugs during the preparation process. Specifically, DTX and PLGA were directly dissolved in dichloromethane, while Ce6 needed to be first dissolved in methanol and then added dropwise to dichloromethane, due to its poor solubility in the latter [53]. Since drug release in nanoparticles is directly related to the effectiveness of subsequent combination therapy, the assessment of drug-releasing rate as well as ROS generation result has mutually proved this point. Current researches have suggested that using chemotherapy alone may not significantly reverse tumor progression [41]. In this study, the nanoplatform we designed demonstrated strong evidence that compared with the single employment of chemotherapy, the synergistic treatment has remarkably elevated therapeutic efficiency both in vitro and in vivo. Since LIFU stimulation optimized the therapeutic strategy, an increased cell apoptosis rate was remarkably elevated. It is worth noting that due to this synergistic strategy, lung metastasis could be significantly inhibited both at tumor cell level and inoculated mice model, which is consistent with previous reports [16, 52].

Conclusion

In conclusion, the safe and stable CPDP NPs we designed and prepared plus LIFU irradiation could remarkably eliminate breast tumor progression and its lung metastasis. With an enhanced imaging capability, this nanoplatform was also considered to be a promising contrast-enhanced agent in clinical. Hence, the novel synergistic strategy combined with LIFU might be considered as an effective treating application to reverse the poor outcome of metastatic breast cancer.

Abréviations

LIFU:

Low-intensity focused ultrasound

SDT:

Sonodynamic therapy

PFP:

Perfluoropentane

EPR:

Enhanced permeability and retention effect

DCFH-DA:

Dichlorodihydrofluorescein diacetate

PI:

Propidium iodide

TEM :

Microscope électronique à transmission

ROS:

Reactive oxygen species

Ce6:

Chlorin e6

DTX:

Docetaxel

FBS:

Fetal bovine serum

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CPDP NPs:

Ce6/PFP/DTX/PLGA nanoparticles

PDP NPs:

PFP/DTX/PLGA nanoparticles