Le microARN-301 inhibé retient l'angiogenèse et la croissance cellulaire dans le carcinome épidermoïde de l'œsophage en élevant PTEN

Introduction

Le cancer de l'œsophage (CE), le 8e cancer le plus fréquent dans le monde, est une tumeur maligne critique avec une mortalité élevée et un mauvais pronostic [1]. Représentant environ 90 % du nombre total de cas de CE, le carcinome épidermoïde de l'œsophage (ESCC) est la principale forme de CE en Chine [2]. De multiples causes, notamment un faible statut socio-économique, le tabagisme, la consommation d'alcool, un mauvais apport nutritionnel, des aliments riches en nitrosamines ou contaminés par des mycotoxines conduisent à l'apparition de l'ESCC [3]. Malgré les résultats cliniques favorisés ainsi que l'administration, le pronostic est toujours sombre chez les patients ESCC, accompagnant un taux de survie à 5 ans de 15 à 25 % [4]. Par conséquent, il est crucial de confirmer les oncogènes ou les gènes répresseurs de tumeurs qui pourraient fonctionner comme des biomarqueurs dans le développement de l'ESCC afin de fournir des méthodes thérapeutiques plus efficaces pour les patients ESCC.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants jouant un rôle essentiel dans la modulation de l'expression des gènes [5] et il est établi qu'ils ont la capacité d'influencer la progression tumorale en régulant la stabilité des ARNm et la capacité des ARNm [6]. Une quantité de miARN tels que miR-4324 [7], miR-889-3p [8] et miR-9 [9] se sont avérés être associés au processus d'ESCC. MiR-301 est un membre des miARN qui est formé par l'unité de transcription fam33a située en 17q22-23 dans le génome humain. La surexpression de miR-301 a déjà été identifiée, ce qui reflétait son implication dans les maladies humaines [6, 10]. Cependant, les mécanismes de fonction de miR-301 n'ont pas été découverts dans ESCC. De plus, il a été affirmé que l'homologue de la phosphatase et de la tensine (PTEN) est fréquemment perturbé dans les tumeurs et ciblé par des mutations germinales chez les patients cancéreux, ce qui joue un rôle inhibiteur des tumeurs [11]. Il a été validé que la dérégulation de la PTEN est corrélée au développement de l'ESCC [12]. Fait intéressant, une recherche récente a révélé que miR-301 cible PTEN dans le cancer du poumon non à petites cellules [13]. Cependant, cette relation de ciblage entre miR-301 et PTEN dans le développement d'ESCC reste à dévoiler. Notre recherche s'est concentrée sur les effets de miR-301 et PTEN sur la progression de l'ESCC, qui restent largement méconnus et sont une nouveauté. Nous en avons déduit que miR-301 peut influencer l'angiogenèse et la croissance cellulaire dans l'ESCC en modulant l'expression de PTEN.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Des consentements éclairés écrits ont été obtenus de tous les patients avant l'étude. Les protocoles de cette étude ont été approuvés par le comité d'éthique du deuxième hôpital de l'université de Jilin et basés sur les principes éthiques de la recherche médicale impliquant des sujets humains de la Déclaration d'Helsinki. Les expérimentations animales étaient strictement conformes au Guide de la gestion et de l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health. Le protocole d'expérimentation animale a été approuvé par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du deuxième hôpital de l'université de Jilin.

Sujets à étudier

Cent dix échantillons de tissus ESCC et de tissus normaux adjacents (>   5 cm de la tumeur) ont été prélevés sur des patients ESCC (78 hommes et 32 ​​femmes) qui avaient accepté une œsophagectomie dans le service de chirurgie thoracique du deuxième hôpital de l'université de Jilin à partir de janvier. 2015 à décembre 2017. Parmi les 110 patients, il y avait 84 cas > 60 ans, et 26 cas ≤ 60 ans; taille de la tumeur :65 cas ≥ 5 cm et 45 cas < 5 cm ; 71 cas sans métastase ganglionnaire (LNM) et 39 cas avec LNM ; le stade tumeur, ganglion et métastase (TNM) :60 cas étaient au stade I + II et 50 cas étaient au stade III; localisation de la tumeur :13 cas étaient des ESCC supérieurs et 97 cas étaient des ESCC inférieurs et moyens. Les patients ont tous été diagnostiqués avec ESCC et n'avaient pas accepté la radiothérapie ou la chimiothérapie auparavant. Les tumeurs ont été complètement excisées, et la marge chirurgicale négative a été confirmée par la pathologie. Selon les critères de stadification de l'ESCC proposés par l'Union for International Cancer Control (UICC) en 2009 [14], la stadification pathologique postopératoire des patients a été identifiée comme étant le stade pT1-4N1-2(I-IIIb). Il n'y a eu aucune complication significative chez les patients après la chirurgie, et les décès périopératoires ont été exclus.

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

Les ARN totaux dans les tissus et les cellules ont été extraits à l'aide de kits Trizol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA). La concentration et la qualité de l'ARN ont été mesurées. Les amorces d'ARN (tableau 1) ont été conçues et synthétisées par TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning Chine). L'ARN a été inversement transcrit en ADNc sur la base des instructions du kit de réactifs Takara PrimeScript™ RT avec g DNA Eraser (Takara). Nous avons effectué une qPCR sur le Light Cycler 480II (Roche) avec le master mix de PCR vert Power PCR SYBR (Takara). U6 a été utilisé comme contrôle de charge de miR-301, et la -actine a été utilisée comme référence interne de PTEN. Les données ont été analysées en utilisant 2 ^−△△Ct méthode [15].

Analyse Western Blot

Un tampon de lyse RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Chine) a été utilisé pour extraire les protéines totales dans les cellules et les tissus, et la protéine a été quantifiée par un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime). La concentration en protéines de chaque échantillon a été mesurée et une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 10 % a été réalisée. Les échantillons ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose, qui ont ensuite été bloquées avec 5% de poudre de lait écrémé à 4°C pendant une nuit. Ensuite, les membranes ont été complétées avec des anticorps primaires PTEN et -actine (tous deux à 1:500 et de Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) pour une incubation d'une nuit, puis ajoutées avec les anticorps secondaires respectifs et incubées pendant 1 h. Après immersion dans le réactif chimiluminescent amélioré (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, USA) pendant 1 min, les membranes ont été exposées dans un environnement sombre et développées à l'aide d'un mini imageur de chimiluminescence LAS4000. Les valeurs de gris ont été évaluées par un logiciel de système d'imagerie avec la β-actine comme contrôle ; par conséquent, la protéine relative finale exprimée a été obtenue. Les bandes de protéines ont été analysées par le logiciel ImageJ2x.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

La séquence 3'-non traduite (UTR) de PTEN devait interagir avec miR-301, ou une séquence mutée dans les sites cibles prédits a été synthétisée et insérée dans les sites XbaI et FseI du vecteur rapporteur de la luciférase de contrôle pGL3 (Promega, WI, États-Unis). Ensuite, les vecteurs pGL3-PTEN-wt et pGL3-PTEN-mut ont été produits. Les plasmides rapporteurs de luciférase wt et mut correctement identifiés avec miR-301 mimic et mimic NC ont été co-transfectés dans des cellules KYSE30 et Eca109 pendant 48 h. Par la suite, les cellules ont été lysées et les activités luciférase ont été respectivement déterminées par des kits de détection de luciférase (Promega).

Culture cellulaire, regroupement et transfection

Les lignées cellulaires ESCC (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 et KYSE-70) ont été acquises auprès de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine), et les cellules épithéliales œsophagiennes humaines (HEEC) ont été acquises. de Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, Chine). Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen) additionné de 10 % de sérum bovin foetal (FBS, Life Technologies, USA), 100 unités/ml de pénicilline G sodique (Sigma) et 100 µg/ml de sulfate de streptomycine (Sigma). L'expression de MiR-301 et l'expression d'ARNm de PTEN dans chaque lignée cellulaire ont été mesurées par RT-qPCR, et la lignée cellulaire avec l'expression relative la plus élevée et la plus faible a été choisie pour les expériences cellulaires ultérieures.

Les cellules KYSE-30 ont été séparées en 7 groupes et, respectivement, traitées avec un inhibiteur miR-301, un contrôle négatif inhibiteur (NC), pcDNA-PTEN (nommé overexpressed (oe)-PTEN), pcDNA-NC (nommé oe-NC), inhibiteur miR-301 + petit ARN interférent (si)-PTEN ou inhibiteur miR-301 + si-NC. Les cellules Eca109 ont également été séparées en 7 groupes et traitées séparément avec miR-301 mimic, mimic NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimic + oe-PTEN, miR-301 mimic + oe-NC. l'inhibiteur NC, l'inhibiteur miR-301, miR-301 mimic, mimic NC, si-NC et si-PTEN ont été achetés auprès de GenePharma Ltd., Company (Shanghai, Chine); pcDNA-PTEN NC et pcDNA-PTEN ont été obtenus auprès de (Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, Chine)). Les cellules ont été transitoirement transfectées dans des cellules ESCC par la lipofectamine 2000 (Invitrogen) lorsque la confluence cellulaire a atteint 60%.

Test du kit de comptage cellulaire (CCK-8)

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque 96 puits (1 × 10 ³ cellules/puits) et incubés pendant différentes périodes. Après incubation pendant 24 h, 48 h, 72 h et 96 h, chaque puits a été complété par 10 L de solution de CCK-8 (5 mg/mL), puis les cellules de chaque groupe ont été incubées à 37 °C sans lumière exposition pendant 2 h. Les valeurs de densité optique (DO) à 450 nm ont été analysées par un lecteur de microplaques (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Test de formation de colonie

Les cellules ont été ensemencées à 500 cellules/puits dans des plaques à 6 puits après transfection et cultivées pendant 14 jours. Les colonies ont été fixées avec du méthanol, colorées au cristal violet à 0,5 % et comptées au microscope inversé.

Test de Transwell

Cellules (5 × 10 ³ ) incubés dans du milieu RPMI 1640 ont été ensemencés dans des chambres apicales de dispositifs Transwell avec membrane non enduite ou enduite de matrigel (Corning, NY, USA). Après 24 h, les cellules sur les chambres apicales ont été retirées, tandis que les cellules restantes sur la face inférieure ont été fixées puis colorées en utilisant du cristal violet à 0,1 %. Un microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japon) a été utilisé pour compter sur 3 champs aléatoires afin de calculer le nombre de cellules.

Cytométrie en flux

Le cycle cellulaire et l'apoptose ont été évalués par cytométrie en flux. L'isothiocyanate d'annexine V-fluorescéine (10 µL) et l'iodure de propidium (PI ; 5 µL, Sigma) ont été incubés avec les cellules (5 × 10 ⁵ cellules/puits) dans l'obscurité à 4 ° C pendant 30 min. Le pourcentage de cellules apoptotiques a été calculé à l'aide d'un cytomètre en flux (BD Biosciences, CA, USA) avec le logiciel FlowJo version 10 (FlowJo LLC, OR, USA).

Pour évaluer le cycle cellulaire, les cellules (5 × 10 ⁵ cellules/puits) ont été fixés avec de l'éthanol à 75 % pendant la nuit à 4 °C et colorés avec 5 pi de PI/ribonucléase A (Sigma) à 4 °C pendant 30 min dans l'obscurité. Les données ont été analysées avec un cytomètre en flux (BD Biosciences). Les signaux de fluorescence (14 000) de chaque échantillon ont été collectés et calculés à l'aide du logiciel ModFit LT version 3.2 (Verity Software House, Inc., ME, USA).

Tumorogenèse sous-cutanée chez les souris nues

Quarante-deux souris nudes femelles BALB/c-nu (âgées de 4 w, pesant de 16 à 24 g) ont été obtenues auprès du Experimental Animal Center Jilin University (Changchun, Chine). Les souris nude ont été séparées en 14 groupes (n = 3). Des souris nude de sept groupes ont reçu respectivement une injection de cellules KYSE-30 en fonction du groupement cellulaire, et des souris nude des sept autres groupes ont reçu séparément une injection de cellules Eca109 en fonction du groupement. La concentration des cellules transfectées KYSE-30 et Eca109 a été ajustée à 5 × 10 ⁶ cellules/100 L. Les souris nudes ont été fixées et injectées par voie sous-cutanée avec des cellules ESCC correspondantes dans des conditions stériles. La plus grande longueur (L) et largeur (W) des tumeurs ont été mesurées chaque semaine et le volume tumoral (V ) = 1/2 × L × W ² . Les souris nude ont été euthanasiées au 5 ^ème semaine d'injection avec les tumeurs réséquées, et les tumeurs ont été pesées et photographiées. Le taux de formation de tumeurs a été calculé comme le nombre de souris avec une tumeur sous-cutanée/nombre total de souris nude injectées dans le groupe × 100 %. Le temps d'injection a été pris en abscisse, et la taille de la tumeur a été prise en ordonnée; ainsi, la courbe de croissance tumorale a été tracée.

Coloration immunohistochimique

Les tissus tumoraux de souris nude ont été fixés par du formaldéhyde à 10 %, inclus en paraffine et sectionnés en 4 µm. Ensuite, les coupes ont été séchées à 60 °C pendant 2 h, déparaffinées au xylène, déshydratées par gradient d'éthanol et incubées avec 50 L 3% H₂ O₂ pendant 10 minutes. Ensuite, les sections ont été trempées dans une solution tampon d'acide citrique 0,01 M, bouillies à 95 ° C pendant 20 min, bloquées par une solution de travail de sérum de chèvre normal à 37 ° C pendant 10 min et ajoutées avec CD₃₄ (1 : 100, Santa Cruz) à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, les coupes ont été complétées avec un polymère IgG anti-lapin/souris de chèvre marqué HRP (ZSGB-Bio, Pékin, Chine), contre-coloré à l'hématoxyline, déshydraté et perméabilisé, puis scellé avec du baume neutre. Le PBS a été utilisé pour remplacer les anticorps primaires en tant que NC. Mesure de la densité des microvaisseaux (MVD) :les coupes ont été observées au microscope à faible grossissement. Une cellule endothéliale ou un amas de cellules endothéliales colorées en jaune brunâtre et significativement distinguées des cellules tumorales environnantes, et des tissus conjonctifs ont été prélevés comme microvaisseaux. La structure de la branche a également été considérée comme un vaisseau si elle était déconnectée, tandis que les vaisseaux avec une taille de lumière>   8 érythrocytes, une couche musculaire ou une lumière plus épaisse ont été exclus. Les nombres de microvaisseaux de 3 champs visuels élevés ont été enregistrés, et le nombre moyen était MVD de chaque cas.

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPSS version SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) et présentées avec le logiciel Graphpad Prism 6.0. Les données ont été exprimées en moyenne  ± écart type. Les différences entre deux groupes indépendants ont été testées avec le test t de Student. Une ANOVA à un facteur a été réalisée pour comparer trois groupes ou plus. P value < 0.05 était indicatif d'une différence statistiquement significative.

Résultats

MiR-301 est fortement exprimé, alors que PTEN est mal exprimé dans les tissus et cellules ESCC

L'expression de MiR-301 et PTEN dans les tissus ESCC et les tissus normaux adjacents a été évaluée à l'aide d'une analyse RT-qPCR et Western blot pour révéler leurs rôles dans ESCC, et il a été constaté que (Fig. 1a-c) miR-301 était régulé à la hausse, tandis que PTEN a été régulée à la baisse dans les tissus ESCC. Les patients ont été divisés en groupes d'expression faible et élevée en fonction de la valeur médiane de l'expression miR-301 ou PTEN pour analyser la corrélation entre l'expression miR-301 ou PTEN et les caractéristiques clinicopathologiques des patients ESCC. Les résultats ont indiqué que l'expression de miR-301/PTEN n'était pas liée à l'âge, au sexe, à la taille de la tumeur, à l'emplacement et à la différenciation, alors qu'elle était corrélée au stade TNM et au LNM des patients ESCC (tableau 2).

MiR-301 est fortement exprimé, tandis que PTEN est faiblement exprimé dans les tissus et les cellules ESCC. un Expression de miR-301 et expression de l'ARNm de PTEN dans le tissu ESCC détectée par RT-qPCR ; b expression protéique de PTEN dans le tissu ESCC détectée à l'aide d'une analyse par transfert Western ; c bandes protéiques de PTEN dans le tissu ESCC en analyse Western blot; d expression de miR-301 et expression de l'ARNm de PTEN dans la lignée cellulaire ESCC détectée par RT-qPCR; e expression protéique de PTEN dans la lignée cellulaire ESCC détectée à l'aide d'une analyse par transfert Western ; f bandes protéiques de PTEN en analyse Western blot. *P < 0,05 par rapport à HEEC. Les données ont été exprimées en moyenne  ± écart-type, et le test t a été effectué pour les comparaisons entre deux groupes

Ensuite, l'expression de miR-301 et PTEN dans 4 lignées cellulaires ESCC et HEEC a été déterminée à l'aide d'une analyse RT-qPCR et Western blot. Nous avons constaté que (Fig. 1d-f) miR-301 était régulé à la hausse et PTEN était régulé à la baisse dans les lignées cellulaires ESCC, parmi lesquelles KYSE-30 avait l'expression de miR-301 la plus élevée et la plus faible expression de PTEN, tandis que Eca109 avait la tendance contraire. Ainsi, la lignée cellulaire KYSE-30 a été traitée avec miR-301/PTEN surexprimé et la lignée cellulaire Eca109 a été traitée avec miR-301/PTEN surexprimé dans les expériences cellulaires.

PTEN est ciblé par miR-301

Un logiciel bioinformatique (http://www.microrna.org/) a prédit que PTEN était le gène cible de miR-301 (Fig. 2a). Il a en outre été confirmé par le test du gène rapporteur double luciférase que l'activité de la luciférase était significativement diminuée dans les cellules ESCC co-transfectées avec le vecteur PTEN-wt et miR-301 par rapport à celles co-transfectées avec le vecteur PTEN-mut et miR-301 mimic, ce qui implique que miR-301 pourrait particulièrement se lier à PTEN (Fig. 2b, c).

PTEN est le gène cible de miR-301. un Les sites de liaison de miR-301 et PTEN ont été prédits par un logiciel de prédiction en ligne; b la relation cible entre miR-301 et PTEN dans les cellules KYSE-30 a été évaluée par double dosage du gène rapporteur de la luciférase; c la relation cible entre miR-301 et PTEN dans les cellules Eca109 a été évaluée par double dosage du gène rapporteur de la luciférase; d expression de l'expression de l'ARNm de miR-301 et PTEN dans les cellules KYSE-30 détectées à l'aide de la RT-qPCR après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; e expression protéique de PTEN dans des cellules KYSE-30 détectée à l'aide d'une analyse par transfert Western après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; f bandes protéiques de PTEN dans des cellules KYSE-30 dans une analyse par transfert Western après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; g expression de miR-301 et expression d'ARNm de PTEN dans des cellules Eca109 détectées à l'aide de RT-qPCR après une régulation positive de miR-310 ou une régulation négative de PTEN ; h expression protéique de PTEN dans des cellules Eca109 détectée à l'aide d'une analyse par transfert Western après une régulation positive de miR-310 ou une régulation négative de PTEN ; je bandes protéiques de PTEN dans des cellules Eca109 dans une analyse par transfert Western après une régulation positive de miR-310 ou une régulation négative de PTEN. *P < 0,05 versus le groupe inhibiteur-NC, &P < 0,05 par rapport au groupe oe-NC, ^# P < 0,05 versus le groupe inhibiteur miR-301 + si-NC, un P < 0,05 par rapport au groupe mimic-NC, b P < 0,05 versus le groupe si-NC, c P < 0,05 par rapport au groupe miR-301 mimic + oe-NC ; N =3. Les données ont été exprimées en moyenne   ± écart type, et le test t a été effectué pour les comparaisons entre deux groupes. L'ANOVA a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes

L'analyse RT-qPCR et Western blot ont été utilisées pour évaluer l'expression de miR-301 et PTEN dans les cellules transfectées, et il a été constaté que dans les cellules KYSE-30 (Fig. 2d-f), les cellules traitées avec l'inhibiteur miR-301 régulaient à la baisse miR-301 , tandis que PTEN est régulé à la hausse ; les cellules traitées avec pcDNA-PTEN (oe-PTEN) ont augmenté l'expression de PTEN et si-PTEN a inversé l'effet de l'inhibiteur de miR-301 sur l'expression de PTEN. Dans les cellules Eca109 (Fig. 2g-i), les cellules traitées avec miR-301 imitent miR-301 régulé à la hausse, tandis que PTEN régulé à la baisse ; les cellules traitées avec si-PTEN ont diminué l'expression de PTEN, et pcDNA-PTEN (oe-PTEN) a inversé le rôle inhibiteur de miR-301 mimic dans l'expression de PTEN. Ces données suggèrent que le miR-301 ciblait PTEN.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé restreint la viabilité des cellules ESCC ; MiR-301 élevé ou PTEN réduit favorise la viabilité des cellules ESCC

La viabilité cellulaire des cellules ESCC a été évaluée en utilisant la formation de colonies et des tests CCK-8. Les résultats ont révélé que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 3a–c), la transfection de l'inhibiteur miR-301 ou de l'oe-PTEN réprimait la capacité de formation de colonies et la viabilité cellulaire ; la transfection de PTEN silencieux a éliminé l'impact de l'inhibiteur de miR-301 sur la viabilité des cellules ESCC ; dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 3d-f), la transfection de miR-301 mimic ou si-PTEN a favorisé la capacité de formation de colonies et la viabilité cellulaire ; La surexpression de PTEN a inversé le rôle promoteur de l'élévation de miR-301 dans la capacité de formation de colonies et la viabilité des cellules Eca109. Ces résultats suggèrent que le knockdown de miR-301 ou la surexpression de PTEN réprime la viabilité des cellules ESCC, qui ont été favorisées par l'élévation de miR-301 ou l'inhibition de PTEN.

Le miR-301 inhibé ou le PTEN surexprimé limite la viabilité des cellules ESCC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit favorise la viabilité des cellules ESCC. un Nombre de colonies dans les cellules KYSE-30 après transfection détectées à l'aide du test de formation de colonies après régulation négative miR-310 ou régulation positive PTEN ; b capacité de formation de colonies de cellules KYSE-30 après transfection détectée à l'aide d'un test de formation de colonies après régulation négative de miR-310 ou régulation positive de PTEN ; c viabilité des cellules KYSE-30 après transfection détectée à l'aide du test CCK-8 après régulation négative miR-310 ou régulation positive PTEN ; d nombre de colonies dans les cellules Eca109 après transfection détectées à l'aide du test de formation de colonies après régulation positive de miR-310 ou régulation négative de PTEN ; e capacité de formation de colonies de cellules Eca109 après transfection détectée à l'aide d'un test de formation de colonies après régulation positive de miR-310 ou régulation négative de PTEN ; f viabilité des cellules Eca109 après transfection détectée à l'aide du test CCK-8 après régulation positive de miR-310 ou régulation négative de PTEN ; *P <0,05 versus le groupe inhibiteur-NC ; &P < 0,05 versus le groupe oe-NC ; ^# P < 0,05 versus le groupe inhibiteur miR-301 + si-NC ; un P < 0,05 par rapport au groupe mimic-NC ; b P < 0,05 par rapport au groupe si-NC ; c P < 0,05 par rapport au groupe miR-301 mimic + oe-NC, N =3. Les données ont été exprimées en moyenne   ± écart type, et l'ANOVA a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé réprime la migration et l'invasion des cellules ESCC ; MiR-301 élevé ou PTEN réduit induit la migration et l'invasion des cellules ESCC

Les capacités de migration et d'invasion des cellules ESCC ont été évaluées à l'aide du test Transwell. Les résultats suggèrent que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 4a, b), les capacités de migration cellulaire et d'invasion ont été restreintes par l'inhibition de miR-301 ou la surexpression de PTEN ; le rôle suppresseur de l'inhibiteur de miR-301 dans la migration cellulaire et les capacités d'invasion a été inversé par si-PTEN. Dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 4c, d), les capacités de migration cellulaire et d'invasion ont été favorisées après la transfection de miR-301 mimic ou si-PTEN; PTEN surexprimé a inversé l'impact de miR-301 sur la migration cellulaire et les capacités d'invasion. Les résultats ci-dessus impliquaient que la migration et l'invasion des cellules ESCC étaient inhibées par la répression miR-301 ou l'élévation de PTEN, alors qu'elles étaient facilitées par la régulation à la hausse ou à la baisse de miR-301.

Le miR-301 inhibé ou le PTEN surexprimé réprime la migration et l'invasion des cellules ESCC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit favorise la migration et l'invasion des cellules ESCC. un Capacités de migration et d'invasion des cellules KYSE-30 transfectées évaluées à l'aide du test Transwell après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; b résultats statistiques des cellules migrées et invasives dans les cellules KYSE-30 via le test Transwell après une régulation à la baisse de miR-310 ou une régulation à la hausse de PTEN ; c capacités de migration et d'invasion des cellules Eca109 parmi les groupes évaluées à l'aide du test Transwell après une régulation positive de miR-310 ou une régulation négative de PTEN ; d résultats statistiques des cellules migrées et invasives dans les cellules Eca109 grâce à la régulation positive du test Transwell miR-310 ou à la régulation négative PTEN. *P <0,05 versus le groupe inhibiteur-NC ; &P < 0,05 versus le groupe oe-NC ; ^# P < 0,05 versus le groupe inhibiteur miR-301 + si-NC ; un P < 0,05 par rapport au groupe mimic-NC ; b P < 0,05 par rapport au groupe si-NC ; c P < 0,05 par rapport au groupe miR-301 mimic + oe-NC, N =3. Les données ont été exprimées en moyenne   ± écart type, et l'ANOVA a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé induit l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules ESCC ; MiR-301 élevé ou PTEN réduit supprime l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules ESCC

La cytométrie en flux a été utilisée pour détecter la transition du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules après la transfection, et les résultats ont indiqué que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 5a–d), la transfection de l'inhibiteur miR-301 ou oe-PTEN a favorisé le taux d'apoptose. et augmentation des cellules en phase G0/G1, tout en diminuant celles des phases S et G2/M ; l'altération de l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire induits par l'inhibiteur de miR-301 pourraient être inversés par si-PTEN.

Le miR-301 inhibé ou le PTEN surexprimé induit l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules ESCC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit supprime l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules ESCC. un La distribution du cycle cellulaire des cellules KYSE-30 dans chaque groupe a été détectée par cytométrie en flux après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; b résultats statistiques du pourcentage dans les phases G0/G1, S et G2/GM des cellules KYSE-30 en cytométrie de flux après régulation négative miR-310 ou régulation positive PTEN ; c l'apoptose des cellules KYSE-30 a été détectée par cytométrie en flux après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; d taux d'apoptose des cellules KYSE-30 transfectées détectées par cytométrie en flux après une régulation négative de miR-310 ou une régulation positive de PTEN ; e la distribution du cycle cellulaire des cellules Eca109 dans chaque groupe a été détectée par cytométrie de flux miR-310 upregulation ou downregulation PTEN; f résultats statistiques du pourcentage dans les phases G0/G1, S et G2/GM des cellules Eca109 en cytométrie de flux après régulation à la hausse de miR-310 ou à la baisse de PTEN ; g l'apoptose des cellules Eca109 a été détectée par cytométrie en flux après une régulation positive de miR-310 ou une régulation négative de PTEN ; h taux d'apoptose des cellules Eca109 transfectées détectées par cytométrie en flux après une régulation positive de miR-310 ou une régulation négative de PTEN. *P <0,05 versus le groupe inhibiteur-NC ; &P < 0,05 versus le groupe oe-NC ; ^# P < 0,05 versus le groupe inhibiteur miR-301 + si-NC ; un P < 0,05 par rapport au groupe mimic-NC ; b P < 0,05 par rapport au groupe si-NC ; c P < 0,05 par rapport au groupe miR-301 mimic + oe-NC, N =3. Les données ont été exprimées en moyenne   ± écart type, et l'ANOVA a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes

Selon les résultats de la cytométrie en flux, nous avons découvert que dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 5e–h), la transfection de miR-301 mimic ou si-PTEN inhibait le taux d'apoptose, diminuait les cellules en phase G0/G1 et augmentait celui de la Phase S et phases G2/M ; La surexpression de PTEN a inversé l'effet de miR-301 sur le taux d'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire des cellules Eca109. Nous avons conclu à partir de ces résultats qu'une régulation négative de miR-301 ou une régulation positive de PTEN favorisait la transition du cycle cellulaire et l'apoptose dans les cellules ESCC, tandis que l'inhibition de miR-301 ou le silence PTEN exerçaient des effets opposés.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé freine la croissance tumorale et l'angiogenèse in vivo dans l'ESCC ; Un miR-301 élevé ou un PTEN réduit augmente la croissance tumorale et l'angiogenèse in vivo dans l'ESCC

La croissance et les modifications des tumeurs ESCC chez les souris nude ont été observées dans chaque groupe. La croissance tumorale a été évaluée et les résultats impliquaient que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 6a-e), les souris nudes injectées avec l'inhibiteur miR-301 ou oe-PTEN réduisaient le volume et le poids de la tumeur ; le rôle répressif de l'inhibiteur de miR-301 dans la croissance tumorale a été aboli par si-PTEN. Dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 6f–j), le volume tumoral et le poids tumoral ont augmenté chez des souris nudes injectées avec miR-301 mimic ou si-PTEN ; la surexpression de PTEN a inversé l'effet de miR-301 sur la croissance tumorale. Pendant ce temps, l'expression de CD34 dans les xénogreffes de souris nude a été évaluée à l'aide d'une coloration immunohistochimique et les résultats ont montré que (Fig. 7a–d) dans les xénogreffes KYSE-30, la MVD était restreinte après une régulation négative de miR-301 ou une régulation positive de PTEN ; silencieux PTEN a inversé l'impact de l'inhibition de miR-301 sur MVD. Dans les xénogreffes Eca109, la MVD a augmenté après une régulation à la hausse de miR-301 ou une régulation à la baisse de PTEN ; l'amélioration de la MVD induite par miR-301 régulé à la hausse pourrait être abolie par PTEN surexprimé. Ces données ont indiqué que l'inhibition de miR-301 ou la surexpression de PTEN réprimaient la croissance tumorale et l'angiogenèse dans l'ESCC, tandis que l'élévation de miR-301 ou l'extinction de PTEN avaient des effets inverses.

Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains tumor growth in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases tumor growth in ESCC. un Representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b–d changes of tumor volume of each group after KYSE-30 cells were transfected; e changes of tumor weight of each group after KYSE-30 cells were transfected; f representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after Eca109 cells were transfected; g–i changes of tumor volume of each group after Eca109 cells were transfected; j changes of tumor weight of each group after Eca109 cells were transfected. *P  < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group; ^# P  < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; a P  < 0.05 versus the mimic-NC group; b P  < 0.05 versus the si-NC group; c P  < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n  = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups

Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains angiogenesis in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases angiogenesis in ESCC. un Representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b comparisons of MVD of KYSE-30 in tumor tissues among the groups; c representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after Eca109 cells were transfected; d comparisons of MVD of Eca109 in tumor tissues among the groups *P  < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group; ^# P  < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; a P  < 0.05 versus the mimic-NC group; b P  < 0.05 versus the si-NC group; c P  < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n  = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups

Discussion

EC is a kind of invasive malignancy in the gastrointestinal tract [16]. As the major type of EC, ESCC is a malignant tumor occurring in esophageal epithelial cells [17]. The miRNAs, known as small non-coding RNAs, have been demonstrated to function as a significant roles in leading molecules in the silencing of RNA [18]. Our research was designed to explore the effects of miR-301 and its target gene PTEN on ESCC progression, and we have found that the inhibited miR-301 could suppress angiogenesis and cell growth in ESCC by elevating PTEN.

MiR-301 expression was assessed, and we found that miR-301 was highly expressed in ESCC cells in comparison with HEEC, and the higher expression of miR-301 has also been found in ESCC tissues in contrast to the adjacent normal tissues. Similar to this result, Li et al. have identified that miR-301 presented high expression in myocardial infarction tissues [19]. In addition, we have elucidated that PTEN was targeted by miR-301, and the target relation has been pointed out by an extant literature [20]. We have also discovered that PTEN, which has been affirmed to be targeted by miR-301, was downregulated in both ESCC tissues and cells. Similarly, a previous research has unearthed that PTEN was poorly expressed in ESCC compared with non-tumor esophageal epithelial tissue [21]. Furthermore, Ma et al. have illuminated that PTEN expression was degraded in Eca109 cell line [22], which has also been selected for a series of experiments in this research. These studies provide evidence for the high expression of miR-301 and low expression of PTEN in ESCC.

Another important outcome in this research indicated that the inhibited miR-301 could repress the colony formation ability as well as the cell proliferation of ESCC cells via enhancing the PTEN expression, and elevated miR-301 or reduced PTEN had contrary effects. Similarly, Han et al. have elucidated that the downregulation of miR-301 mediated by luteolin has the ability to restrain the cell proliferation in prostate cancer [6]. A recent literature has revealed that the overexpression of PTEN suppresses the proliferation of pancreatic cancer cells [23], and a same result has been summarized in a study focusing on prostate cancer [24]. Besides, we have also unearthed that the downregulation of miR-301 or the elevation of PTEN could inhibit migration and invasion of ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN exhibited the opposite trends. In accordance with this outcome, Shi et al. have supported that inhibited miR-301 attenuated migration and invasion of breast cancer cells [10], and it has been reported that the migration and invasion of ESCC cells could be repressed by the inhibition of miR-130b and the elevation of PTEN [25]. These publications helped verifying the oncogenic role of miR-301 and tumor-repressive effect of PTEN in diverse human cancers. Another result in our research was that inhibited miR-301 overexpressed PTEN to promote cell apoptosis and induce cell cycle arrest at the G0/G1 phase in ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN had the inverse results. Similarly, it has been uncovered by a recent literature that activated PTEN induces cell cycle arrest and apoptosis in ESCC [26]. Consistently, Tian et al. have found in their study that the elevation of PTEN inhibited the angiogenesis by reducing the expression of vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma [27]. Based on the above data, the roles of miR-301 and PTEN in cell apoptosis and angiogenesis in diverse diseases were further confirmed. Consequently, we concluded that the downregulation of miR-301 could restrain the tumor growth in ESCC through the high expression of PTEN, and the similar conclusion has also been unveiled in breast cancer [10] and prostate cancer [28]. On the contrary, miR-301 elevation or PTEN reduction induced the tumor growth in ESCC. It could be concluded that miR-301 and PTEN participated in the in vivo cancer cell growth.

Conclusion

In this study, we have shown that the repression of miR-301 prohibits angiogenesis, cell proliferation, migration and invasion but promotes apoptosis in ESCC cells by upregulating PTEN. This research may further the understanding on potential molecular mechanisms of ESCC and provide novel targets for ESCC treatment.

Abréviations

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

PTEN:

Phosphatase and tensin homologue

MVD:

Microvessel density

CE :

Esophageal cancer

miRNAs:

MicroRNAs

LNM:

Lymph node metastasis

UICC:

Union for International Cancer Control

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

3′UTR:

3′-Untranslated region

WT:

Wild type

MUT:

Mutant type

HRP :

Peroxydase de raifort

FBS :

Sérum fœtal bovin

OE:

Overexpressed

NC :

Negative control

CCK-8 :

Cell counting kit

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

IP :

Iodure de propidium

FITC :

Isothiocyanate de fluorescéine

MVD:

Microvessel density

ANOVA:

Analysis of variance