morphologie de surface régulée des nanofibres composites polyaniline/acide polylactique via divers dopage d'acides inorganiques pour améliorer la biocompatibilité en ingénierie tissulaire

Introduction

La matrice extracellulaire (MEC) est un type de réseau macromoléculaire sécrété par les cellules dans le stroma extracellulaire. Il présente la fondation des cellules, des tissus et des organes, accompagné d'organes, et se caractérise par une structure de grille complexe [1, 2]. De plus, il fournit un site approprié pour la survie et l'activité des cellules, déterminant leur forme, contrôlant leur différenciation, participant à leur migration et leur métabolisme, et affectant finalement leur survie, leur croissance et leur mort [3, 4]. Les nanofibres électrofilées peuvent simuler l'action de la matrice extracellulaire pour réguler le comportement cellulaire en raison de leur surface spécifique élevée, de leurs propriétés mécaniques appropriées et de leur biodégradabilité. De plus, les nanofibres électrofilées peuvent être multifonctionnelles par modification de surface sur la base du maintien de sa structure poreuse. Par conséquent, les nanofibres électrofilées sont devenues un matériau candidat prometteur en ingénierie tissulaire, qui est largement appliqué dans l'administration de médicaments, la régénération orthopédique, la régénération nerveuse et la réparation [5,6,7,8,9,10].

Les polymères conducteurs (p. ex., polypyrrole [PPy], polythiophène [PTH] et polyaniline [PANI]) ont une bonne biocompatibilité in vitro et in vivo, ce qui peut affecter de manière significative l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaires ainsi que la régénération tissulaire [11,12 ,13]. Parmi ces polymères conducteurs, le PANI est considéré comme un matériau potentiel pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative en raison de sa bonne aptitude au traitement, de son excellente conductivité, de sa bonne stabilité redox et de sa biocompatibilité [14, 15]. Sous stimulation électrique, PANI peut réguler l'adhésion cellulaire, la prolifération, la migration et la différenciation [16, 17]. En fait, de nombreux rapports ont conclu que les nanofibres composites dégradables conductrices à base de PANI favorisent le comportement des cellules sous un champ électrique [18,19,20,21]. Cependant, cela implique un problème crucial que la conductivité de PANI dans l'environnement physiologique (pH = 7.4) sera affaiblie en raison de PANI dédopé, qui, comme des études précédentes l'ont démontré, diminue son activité électrique avantages de favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires [22] . Bien que cela présente clairement une limitation des nanofibres dégradables conductrices à base de PANI dans l'ingénierie des tissus osseux sous stimulation électrique externe, elles peuvent toujours favoriser la prolifération et la croissance cellulaires dans une mesure significative [23, 24]. Ici, nous avons supposé que la morphologie de surface du PANI augmente la rugosité des nanofibres composites, ce qui favorise l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaires.

La polyaniline dopée avec des acides inorganiques a généralement une bonne conductivité électrique. Cependant, les anions introduits par divers dopants acides inorganiques affecteront la conductivité et la structure de la polyaniline [25,26,27]. Dans cet article, trois acides inorganiques courants, à savoir l'acide chlorhydrique (HCl, HA), l'acide sulfurique (H₂ SO₄ , SA), et l'acide perchlorique (HClO₄ , PA), ont été sélectionnés comme dopants dans une polymérisation oxydante in situ PANI. Ensuite, les propriétés mécaniques, la mouillabilité, la morphologie de surface, la biocompatibilité et l'adhésion cellulaire des nanofibres PANI/acide polylactique (PLA) ont été étudiées sous différents dopants acides. Les résultats ont indiqué que plus la rugosité de surface du PANI est élevée, meilleure est la prolifération cellulaire, montrant ainsi une meilleure biocompatibilité.

Méthodes/Expérimental

Produits chimiques

L'aniline (AN) a été achetée auprès de Sigma, PLA (M w  =60 000) a été acheté chez Solarbio, le dichlorométhane (DCM) a été acheté chez Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., et le N,N-diméthylformamide (DMF) a été acheté chez Macklin. Pendant ce temps, le persulfate d'ammonium (APS) a été acheté auprès d'Aladdin, HCl et H₂ SO₄ ont été achetés auprès de Guangzhou Chemical Co., Ltd., et HClO₄ a été acheté chez Macklin.

Préparation de nanofibres de polyaniline/acide polylactique

Fabrication de nanofibres d'acide polylactique par électrofilage

Des particules de PLA avec une masse spécifique ont été ajoutées dans une solution mixte de DCM et de DMF (rapport volumique de 7:3) avant d'être agitées jusqu'à dissolution, et une solution mixte de 10 % de PLA a été obtenue. La solution de PLA a ensuite été distribuée dans une seringue et connectée à une alimentation haute tension. La machine d'électrofilage (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) a été réglée avec une tension de 15 kV et à une distance de 15 cm. Les nanofibres de PLA obtenues ont été séchées sous vide pendant une nuit à 40 °C.

Préparation de nanofibres de polyaniline/acide polylactique dopées avec différents acides inorganiques

Les nanofibres PLA ont été placées dans la chambre de la machine de nettoyage au plasma (PCE-6, MTI Corporation, USA) et déchargées pendant 2 min à une puissance RF de 30 W. Dans cet article, trois acides inorganiques courants, à savoir HCl, H₂ SO₄ , et HClO₄ , ont été utilisés comme dopants pour la polymérisation oxydative in situ dans la préparation de nanofibres PANI/PLA [24], et les nanofibres PANI correspondantes ont été marquées comme PANI-HA, PANI-SA et PANI-PA, respectivement, tandis que le PANI/PLA les nanofibres nanocomposites ont été étiquetées respectivement PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA. Le processus de préparation des nanofibres composites PLA et PANI/PLA est illustré à la figure 1.

Schéma illustrant le processus de préparation des nanofibres composites PLA et PANI/PLA

Des nanofibres nanocomposites PANI/PLA ont été préparées dans des conditions de bain de glace [16, 28]. L'APS et l'AN ont été ajoutés à une solution acide 1 M selon un rapport molaire de 1:1. Ici, nous prenons le HCl comme exemple pour illustrer le processus de préparation des nanofibres PANI/PLA. Dans des conditions de bain de glace, l'AN (930 mg, 0,01 mol) a été ajouté goutte à goutte dans de l'APS (2 280 mg, 0,01 mol) et dissous dans 50 ml de HCl 1 M. Immédiatement, la membrane de nanofibres PLA traitée par plasma a été immergée dans la solution et agitée pendant 2 h à 0°C. Après la réaction, la membrane de nanofibres PLA a été nettoyée plusieurs fois avec du HCl et de l'éthanol pour éliminer le PANI non attaché avant d'être séchée pendant la nuit à 40 ° C pour obtenir des nanofibres PANI/PLA-HA, qui ont été mises de côté pour une utilisation ultérieure. Les nanofibres composites PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA ont été obtenues suivant une approche similaire.

Caractérisation

Les tests de traction uniaxiale pour les nanofibres PLA et les nanofibres composites PANI/PLA ont été menés via un test de contrainte-déformation (Shimadzu AGX-PLUS, Japon). Ici, l'échantillon a été découpé en forme d'haltère, avec une vitesse de traction maintenue à une constante de 3 mm/min. Le module de Young a été calculé à partir de la région linéaire de déformation de 0 à 15 % dans la courbe contrainte-déformation, et la résistance à la traction et le taux de traction à la rupture de la courbe ont été déterminés à partir de la fracture de la membrane en nanofibres.

La morphologie des échafaudages de nanofibres a été caractérisée par microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japon) pour observer les différentes morphologies du PANI dopé avec différents acides inorganiques. Avant l'observation SEM, les échantillons de nanofibres ont été pulvérisés avec de l'or pendant 60 s pour permettre une observation plus claire de la morphologie. Parallèlement, la rugosité de surface des nanofibres composites PANI/PLA a été mesurée par microscopie à force atomique (AFM, Bruker Dimension Edge). Pour confirmer que PANI était complètement chargé sur les nanofibres PLA, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) a été utilisée pour mesurer le changement de longueur d'onde de 2000 ~ 500 cm ⁻¹ . La spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS ; Thermo ESCALAB 250) et Al-Kα ont été utilisés comme sources d'émission de rayons X pour déterminer davantage la composition de surface des nanofibres PANI/PLA, tandis que leur mouillabilité a été mesurée en termes d'angle de contact de les gouttelettes d'eau à température ambiante par analyse d'angle de contact (OCA 15 plus, Allemagne). La dégradation des nanofibres a été évaluée à l'aide d'une méthode de perte de masse [29, 30]. Les membranes en nanofibres ont été découpées en disques de 16 mm et placées dans 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) avec un pH de 7,4 avant que les échafaudages ne soient incubés à 37 ° C pendant 7, 14 et 21 jours et séchés à un poids constant .

Biocompatibilité des échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA

Biocompatibilité

Dans cet article, la biocompatibilité des échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA a été caractérisée par une expérience d'activité cellulaire de l'ostéosarcome humain (HOS). Les cellules HOS ont été achetées à la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences, Shanghai. Les cellules HOS ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco à faible teneur en glucose (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine avant d'être incubées à 37 °C et 5 % de CO_2. . Lorsque la croissance cellulaire a atteint un degré de fusion de 90 %, les cellules ont été repiquées dans un rapport de 1:3.

Les cellules HOS ont dû être ensemencées sur les nanofibres PANI/PLA avant le test de prolifération cellulaire. Ici, les nanofibres ont été placées dans une plaque à 96 puits de manière à recouvrir complètement le fond de la plaque avant d'être stérilisées par UV pendant 30 min et via une solution d'éthanol à 75 % pendant 30 min. Ils ont ensuite été lavés avec du PBS. Les nanofibres ont ensuite été ensemencées avec un 1 × 10 ⁴ la densité des puits, tandis qu'un groupe témoin et un groupe témoin ont été mis en place simultanément. Les cellules ont ensuite été incubées dans un incubateur à 37 °C pendant un, trois et cinq jours, le milieu étant renouvelé tous les deux jours.

La viabilité cellulaire des nanofibres PANI/PLA a été évaluée à l'aide d'un essai de bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2-H-tétrazolium (MTT). Après incubation à un, trois et cinq jours, le milieu a été retiré de la plaque à 96 puits et lavé avec du PBS trois fois avant d'ajouter 1 mL de DMEM contenant 10 % de 5 mg/mL de MTT. Le milieu a ensuite été incubé à 37°C pendant 4 h puis retiré avant d'ajouter du DMSO pour dissoudre la méthylprednisolone. Le milieu a été vibré pendant 10 min, puis l'absorbance a été déterminée (BioTek Synergy HTX, USA).

Immunocoloration fluorescente

Les cellules HOS ont été incubées dans l'incubateur à nanofibres PANI/PLA pendant 24 h et ont été lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min à température ambiante. Les cellules fixées ont été lavées avec du PBS trois fois (10 min à chaque fois) et 10 L de 100 nM de peptide marqué FITC ont été ajoutés avant que les cellules ne soient incubées pendant 30 min à température ambiante puis lavées avec du PBS trois fois (5 min à chaque fois ). L'actine extracellulaire des cellules HOS a été colorée, avec une microscopie confocale (Type A1, Nikon, Japon) utilisée pour observer la coloration des cellules à un grossissement de 20 ×.

Adhésion cellulaire

L'adhésion des cellules HOS sur les échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA a été observée via SEM. Ici, le milieu de culture a été retiré après la culture cellulaire de 24 h PANI/PLA nanofibre HOS et a ensuite été lavé avec du PBS trois fois avant l'ajout de 4% de PFA. Le milieu a été fixé pendant une nuit à 4°C, lavé trois fois avec du PBS, déshydraté avec une solution d'éthanol à gradient (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 90 % et 100 %, respectivement; 20 min à chaque fois) et puis lyophilisé pendant 24h. Avant l'observation SEM, les nanofibres ont été pulvérisées avec du platine pendant 120 s pour permettre une meilleure observation.

Activité de la phosphatase alcaline (ALP)

L'ALP est l'un des marqueurs de différenciation précoce des ostéoblastes couramment utilisés qui dépendent de l'expression de l'enzyme phosphatase alcaline. Ici, l'activité ALP a été réalisée à l'aide du kit de dosage ALP (Beyotime Biotechnology, P0321S). Les cellules HOS ont été cultivées sur différents échafaudages composites PANI/PLA pour le 7j désigné. Les cellules ont été lysées en utilisant 50 L de Tris-HCl (0,1 M, pH 8) avec 0,1% (v/v) de triton X-100. L'activité ALP est analysée en quantifiant la concentration de p -nitrophénol de p -nitrophényl phosphate (PNPP), qui est estimé en enregistrant l'absorbance à 405 nm. Le pourcentage d'activité ALP des cellules cultivées le long des nanofibres PANI/PLA est calculé en comparant l'activité ALP des cellules cultivées sur des nanofibres PLA vierges.

Analyse statistique

La signification statistique des résultats a été évaluée via une analyse de variance à un facteur (ANOVA) à l'aide de GraphPad Prism (version 8.02). Ici, les différences de propriétés mécaniques, de biodégradabilité in vitro et de viabilité cellulaire entre les différents échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA ont été analysées. Les résultats ont été considérés comme significatifs lorsque p < 0,05 (∗) et très significatif lorsque p < 0,005 (∗∗).

Résultats et discussion

Les propriétés mécaniques des échafaudages d'ingénierie tissulaire sont des indicateurs importants pour évaluer si les échafaudages peuvent résister à la dynamique des fluides. La présence d'acides inorganiques peut affecter les propriétés physiques et chimiques de la matrice PLA des nanofibres composites PANI/PLA dans le processus de polymérisation par oxydation chimique in situ de PANI. Par conséquent, l'exploration des propriétés mécaniques des nanofibres composites PANI/PLA dopées avec des acides inorganiques est nécessaire. Ici, les propriétés mécaniques des nanofibres composites PANI/PLA ont été évaluées via un test de traction, qui est illustré à la figure 2, y compris la contrainte-déformation, le module de Young, la résistance à la traction et l'allongement à la rupture. Comme le montre la figure 2a, les nanofibres PLA ont présenté un comportement élastique linéaire, et les nanofibres composites PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA ont présenté un comportement de rendement clair, tandis que les nanofibres composites PANI/PLA-PA se sont cassées immédiatement après la déformation élastique. . Le module de Young (Fig. 2b) des nanofibres composites PANI/PLA était supérieur à celui des nanofibres PLA. Par rapport au PLA, l'augmentation du module d'élasticité de PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA était de 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 et 28,43 ± 8,34 MPa, respectivement. En termes de résistance à la traction (Fig. 2c) et de rapport de rupture (Fig. 2d), celles de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA ont diminué, tandis que celles de PANI/PLA-SA ont légèrement augmenté; la résistance à la traction et l'allongement à la rupture de PANI/PLA-PA étaient les plus faibles. Par rapport aux nanofibres PLA, la résistance à la traction de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA a diminué de 0,15 ± 0,01 et 0,64 ± 0,03 MPa, respectivement, tandis que celle de PANI/PLA-SA a légèrement augmenté de 0,13 ± 0,05 MPa. L'allongement à la rupture de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA a diminué de 16,93 ± 1,38 % et 35,42 ± 3,94%, respectivement, tandis que celui de PANI/PLA-SA a augmenté de 3,32 ± 0,13%.

Propriétés mécaniques des nanofibres PLA et des nanofibres composites PANI/PLA. un Courbes de traction-déformation représentatives, b Module de Young, c résistance à la traction à la rupture, d allongement à la rupture

Comme le montre la figure 2, les acides inorganiques sélectionnés peuvent augmenter le module d'élasticité des nanofibres PLA grâce à la connexion du revêtement PANI. En termes de résistance à la traction et d'allongement à la rupture, par rapport aux nanofibres PLA, les propriétés mécaniques de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA ont varié à des degrés divers, tandis que celles de PANI/PLA-PA ont diminué le plus nettement, et dès comme la contrainte a été appliquée pendant l'essai, une rupture s'est produite en moins de 5 s. Ces résultats peuvent être dus à l'oxydation de HClO₄ , qui a entraîné le clivage de la liaison ester dans la chaîne moléculaire du PLA et la décomposition oxydative du groupe carboxyle, conduisant par la suite à des propriétés mécaniques inférieures [31]. Pendant ce temps, les différentes propriétés mécaniques de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA peuvent être liées à la densité différente du PANI dopé par HCl et H₂ SO₄ , tandis que l'introduction de l'APS dans le processus de réaction peut également avoir eu un léger impact sur les nanofibres PLA, l'effet global de ces facteurs présentant des propriétés mécaniques différentes [32].

L'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaires sont affectées par la morphologie, avec une surface rugueuse généralement considérée comme propice à l'adhésion cellulaire [33]. L'hydrophobie des nanofibres PLA implique que la polymérisation uniforme du PANI présente une barrière, tandis que le traitement de surface des nanofibres PLA avec du plasma peut améliorer considérablement la mouillabilité [34]. Suite à la polymérisation in situ à base de PANI avec différents dopants acides inorganiques, des nanofibres composites PANI/PLA avec un dépôt de surface uniforme ont été obtenues.

La morphologie PANI à la surface des différentes fibres PANI/PLA a été observée via FE-SEM (Fig. 3). La figure montre clairement que la surface des nanofibres PLA était recouverte de nombreuses nanoparticules irrégulières et que les nanofibres composites PANI/PLA dopées avec les acides inorganiques étaient capables de maintenir une bonne morphologie des fibres et une structure poreuse des nanofibres. Les observations morphologiques ont révélé que les nanofibres composites PANI/PLA ont été chargées avec succès avec PANI, qui a fourni une base pour l'adhésion et la prolifération cellulaires. Pendant ce temps, l'AFM a été utilisé pour mesurer la rugosité de surface des nanofibres composites PANI/PLA, comme le montre la figure 4. Ra, la valeur moyenne de la rugosité de surface à trois positions différentes de chaque échantillon, est généralement utilisée pour évaluer la rugosité de surface de l'échantillon. De plus, le Ra des nanofibres composites PANI/PLA était supérieur à celui des nanofibres PLA, et le Ra de PANI/PLA-PA était le plus élevé. Cette augmentation de la rugosité de surface a accéléré la surface et la polarité, fournissant potentiellement plus de sites de croissance pour les cellules et favorisant l'adhésion cellulaire.

Morphologie de a Nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, et d Nanofibres composites PANI/PLA-PA

Image AFM et rugosité de surface (Ra) de a Nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, et d Nanofibres composites PANI/PLA-PA

L'adhésion, la migration et la prolifération cellulaires sont significativement affectées par la mouillabilité des échafaudages [35, 36]. En général, la mouillabilité est évaluée en fonction de l'angle de contact entre l'échafaudage et l'eau. Étant donné que le PLA est hydrophobe, nous avons mesuré l'angle de contact des gouttelettes d'eau sur la membrane de nanofibres en 1 s, comme le montre la figure 5, et les angles de contact des nanofibres PANI/PLA après le traitement se sont avérés diminuer de manière significative. Les angles de contact correspondants de PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA étaient respectivement de 112°, 61,6°, 36,7° et 37,2°. La morphologie PANI de PANI/PLA a augmenté l'énergie de surface du système, la zone de contact augmentant au contact initial avec l'eau, entraînant la diminution de l'angle de contact et l'amélioration de la mouillabilité. L'angle de contact des nanofibres composites passe à 0° après 5 s de contact avec l'eau, démontrant ainsi une bonne hydrophilie. Cet échafaudage hydrophile a également fourni des conditions favorables à l'adhésion et à la diffusion cellulaires [37] puisque les groupes fonctionnels contenant de l'oxygène (par exemple, -OH et -COOH) sur la surface du PLA étaient plus liés à la surface des nanofibres après le traitement au plasma, et le PANI la morphologie et les groupes fonctionnels contenant de l'oxygène ont travaillé ensemble pour garantir que les nanofibres composites PANI/PLA étaient finalement complètement mouillées [38, 39].

Angle de contact de a Nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, et d Nanofibres composites PANI/PLA-PA

Les spectres FTIR des nanofibres composites PANI et PANI/PLA pures dopées par différents acides inorganiques sont présentés sur la figure 6. Dans le spectre PANI dopé pur (Fig. 6a), les forts pics caractéristiques à 1 565, 1 485, 1 298 et 1 125 cm ⁻¹ correspondent respectivement à un étirement C=C des anneaux quinoïdes et à un étirement C = C, C-N et = C-H des anneaux benzénoïdes. Dans le spectre PANI dopé pur (Fig. 6b), en plus du pic PANI caractéristique, un pic PLA peut également être observé (C–O étirant des pics de vibration de 1092 et 1184 cm ⁻¹ , C=O pic de vibration d'étirement de 1757 cm ⁻¹ ). Ces résultats indiquent que le PANI a été chargé avec succès à la surface des nanofibres PANI/PLA dopées avec des acides inorganiques. Pour étudier plus avant la composition chimique des nanofibres PANI/PLA, XPS a été utilisé pour analyser leur composition de surface. De plus, dans les spectres XPS (Fig. 7a), des pics N1s clairs étaient visibles à  ~ 400 eV dans les nanofibres composites PANI/PLA. De plus, les pics de Cl2p étaient visibles à  ~ 200 eV dans PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA, tandis que l'intensité de pic de Cl2p avec PANI/PLA-PA était plus élevée qu'avec PANI/PLA-HA. Un pic de S2p est apparu à  ~ 210 eV sur les spectres XPS dans PANI/PLA-SA. Les spectres XPS ont indiqué que Cl ⁻ , SO₄ ²⁻ , et ClO₄ ⁻ ont été dopées sur les nanofibres PANI/PLA correspondantes. De plus, les atomes d'azote imine de PANI ont été complètement ou partiellement oxydés pour produire une série d'états d'oxydation accompagnés de divers degrés de protonation. Les changements dans l'état d'oxydation et le niveau de protonation de PANI ont été mesurés en termes de spectres de niveau nucléaire N1s (Fig. 7b–d). Chaque spectre N1s peut être déconvolué en quatre composants principaux avec des énergies de liaison d'environ 398,7, 399,6, 400,4 et 401,8 eV, qui peuvent être attribués à l'imine quinonoïde (-N=), à l'amine benzénoïde (-NH-), à l'amine protonée (- N ⁺ ), et imine protonée (=N ⁺ ), respectivement [40, 41]. En référence à l'étude de Kumar [42], le pic d'ajustement du spectre N1s a été jugé affecté par la charge dans les anions liés par les atomes N protonés, ce qui a entraîné une délocalisation et un léger décalage.

Spectres FTIR de a PANI, b Nanofibres composites PLA et PANI/PLA

Spectres XPS (a ) des échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA préparés et le PANI/PLA-HA (b ), PANI/PLA-SA (c ), et PANI/PLA-PA (d ) du signal de niveau central des N1

En tant que modèle pour la réparation et la régénération des tissus, les échafaudages bioactifs sont dégradés et excrétés hors du corps après la réparation cellulaire et tissulaire induite [43]. Dans cet article, les propriétés de dégradation des échafaudages en nanofibres ont été évaluées à l'aide d'une méthode de perte de masse, comme le montre la figure 8. La perte de masse de tous les échantillons a augmenté à 7, 14 et 21 jours, et les taux de perte de masse du PLA les nanofibres étaient de 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% et 12,65 ± 0,83 %, respectivement. Pendant ce temps, la perte de masse des nanofibres composites PANI/PLA-PA a progressivement augmenté après la polymérisation oxydative in situ, avec des taux de perte de masse de 31 ± 2.15%, 34 ± 1.86% et 40 ± 2.54% à 7, 14 et 21 jours, respectivement, qui étaient significativement plus élevés que ceux des nanofibres PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA. Dans le processus de polymérisation oxydante in situ PANI, la présence de l'APS oxydant pourrait avoir détruit la liaison ester dans le PLA et induit une réaction d'hydrolyse, entraînant des microfissures dans les nanofibres de PLA. Avec l'allongement du temps d'immersion dans le PBS, les microfissures se sont progressivement accumulées et la matrice de PLA a commencé à se dégrader progressivement. Le PANI chargé en surface est également tombé, entraînant un taux de perte de qualité des nanofibres. Avec l'augmentation du temps, le rapport de perte de masse est devenu plus clair. Ici, la forte oxydation de HClO₄ a aggravé la dégradation du PLA et accéléré la perte de masse des nanofibres PANI/PLA-PA, ce qui est cohérent avec les propriétés mécaniques présentées sur la figure 2.

Propriétés de dégradation des nanofibres PLA et PANI/PLA

La biocompatibilité des échafaudages bioactifs est à la base de la promotion de l'adhésion, de la croissance et de la prolifération cellulaires [44]. Ici, nous avons étudié la prolifération cellulaire de HOS sur des nanofibres composites PLA et PANI/PLA pour illustrer l'adhésion et la biocompatibilité qui en découlent. Au cours du traitement chimique et de la fonctionnalisation [45], un certain nombre de facteurs d'influence potentiels pourraient entrer en jeu dans la préparation d'échafaudages bioactifs. Par conséquent, l'étude de leur biocompatibilité est essentielle pour évaluer leur application pratique.

Pour étudier la biocompatibilité des nanofibres composites PANI/PLA, leur viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'une méthode MTT. La figure 9 montre l'activité cellulaire incubée sur des nanofibres composites PLA et PANI/PLA après 1, 3 et 5 jours. La figure montre clairement qu'avec l'allongement du temps d'incubation, l'activité cellulaire des nanofibres augmente progressivement; les cellules PANI/PLA-PA présentaient la meilleure activité, et l'activité cellulaire après une culture de cinq jours était la plus élevée.

Viabilité cellulaire HOS cultivée pendant 1, 3 et 5 jours sur des nanofibres PLA et des nanofibres composites PANI/PLA (*p < 0,05 ; **p < 0.005)

Le PLA est biodégradable, mais hydrophobe, ce qui signifie qu'il ne favorise pas l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaires. Après le traitement au plasma, la surface des nanofibres composites PANI/PLA était chargée de groupes contenant de l'oxygène, et la surface fonctionnelle a démontré une bonne hydrophilie. La morphologie ci-dessus et les résultats de l'AFM indiquent que le PANI dopé avec différents acides inorganiques présentait des morphologies et des niveaux de rugosité différents à la surface des nanofibres PLA. Pendant ce temps, les nanofibres composites PANI/PLA présentaient une excellente mouillabilité. Par conséquent, nous avons considéré que les différentes morphologies de PANI dopées avec des acides inorganiques ont conduit à l'amélioration de l'énergie de surface et de la polarité des nanofibres composites PANI/PLA, ce qui a par conséquent affecté la croissance, la migration et la prolifération cellulaire, entraînant une amélioration des performances en termes de l'activité cellulaire [46].

Pour étudier plus avant le comportement cellulaire des nanofibres composites PANI/PLA, la croissance et l'adhésion sur les nanofibres ont été observées par immunocoloration par fluorescence (Fig. 10) et SEM (Fig. 11). Ici, nous avons comparé l'actine et la morphologie cellulaire à la surface de différentes nanofibres. Lorsque les cellules se sont développées sur les fibres PLA et les nanofibres PANI/PLA, les faisceaux d'actine ont démontré un bon état d'étirement. Pendant ce temps, la densité cellulaire des nanofibres composites PANI/PLA était supérieure à celle des nanofibres PLA du groupe témoin, la densité de croissance cellulaire suivant l'ordre PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. Les cellules HOS se sont développées sur les nanofibres PANI/PLA et ont adhéré sous une forme multipolaire plate. De toute évidence, de nombreuses cellules étaient incrustées dans les pores des fibres PANI/PLA mais étaient mal étirées sur les nanofibres PLA et ne pouvaient pas être complètement expansées. These results indicate that PANI/PLA composite nanofibers could promote the adhesion and proliferation of HOS cells.

Fluorescence micrographic images on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after the incubation of 24 h

SEM micrographs of HOS seeded on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after 24 h

Meanwhile, the cell immunofluorescence staining and cell adhesion results indicated that the different PANI morphologies on the surface of the PANI/PLA composite nanofibers affected the growth, adhesion, and proliferation of the HOS cells, which was consistent with the above results.

As an early osteogenic marker, the ALP test was conducted on PLA and PANI/PLA composite nanofibers scaffolds for 7 days. Compared to the pure PLA nanofibers, the result (Fig. 12) showed that the ALP activity was significantly improved in of PANI/PLA composite nanofibers. Obviously, the ALP activity of PANI/PLA-PA composite nanofibers is the best. These results proved that PANI/PLA composite nanofibers exhibited better biocompatible, which is consistent with the above results of cell adhesion, growth, and proliferation.

Alkaline phosphatase activity on PANI/PLA composite nanofibers scaffolds (ns = no significance)

Conclusions

In this paper, PANI/PLA composite nanofibers of different surface morphologies were prepared by three types of inorganic acid as dopant in in situ polymerization. We confirmed that PANI could be successfully loaded on the surface of PLA without changing the porous structure of the nanofibers. The mechanical properties and in vitro degradation experiments demonstrated that oxidizing acids can significantly weaken the mechanical properties and accelerate the degradation of polyester nanofibers. Meanwhile, the rougher surface resulted in a better wettability and promoted the cells adhesion, growth, and proliferation, which indicated a better biocompatibility. In conclusion, the regulated PANI morphology via different acids doping has positive effect on biocompatibility in tissue engineering.

Disponibilité des données et des matériaux

The authors declare that the materials and data are promptly available to readers without undue qualifications for material transfer agreements. Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article.

Abréviations

PANI:

Polyaniline

PLA:

Polylactic acid

ECM:

Extracellular matrix

PPy:

Polypyrrole

PTH:

Polythiophene

AN:

Aniline

DCM :

Dichlorométhane

DMF :

N ,N -Dimethylformamide

APS:

Persulfate d'ammonium

HOS:

Human osteosarcoma cells

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle medium

PBS :

Tampon phosphate salin

MTT :

3–2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

FE-SEM :

Microscopie électronique à balayage à émission de champ

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

ALP:

Alkaline phosphatase