L'actine F régule la différenciation ostéoblastique des cellules souches mésenchymateuses sur les nanotubes de TiO2 via MKL1 et YAP/TAZ

Résumé

Le titane et les alliages de titane sont largement utilisés dans les implants orthopédiques. La modification de la nanotopographie offre une nouvelle stratégie pour améliorer l'ostéointégration des substrats en titane. La polymérisation de l'actine filamenteuse (F-actine), en tant que structure de chargement mécanique, est généralement considérée comme impliquée dans la migration cellulaire, l'endocytose, la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire. Si la F-actine est impliquée et comment elle fonctionne dans la différenciation ostéogénique induite par les nanotubes de cellules souches mésenchymateuses (CSM) reste à élucider. Dans cette étude, nous avons fabriqué du TiO₂ nanotubes à la surface d'un substrat de titane par oxydation anodique et caractérisé leurs caractéristiques par microscopie électronique à balayage (MEB), analyse par dispersion d'énergie des rayons X (EDS) et microscopie à force atomique (AFM). Une coloration à la phosphatase alcaline (ALP), un transfert Western, une qRT-PCR et une coloration par immunofluorescence ont été réalisées pour explorer le potentiel ostéogénique, le niveau de F-actine et l'expression de MKL1 et YAP/TAZ. Nos résultats ont montré que le diamètre intérieur et la rugosité du TiO₂ les nanotubes ont augmenté avec l'augmentation de la tension d'oxydation anodique de 30 à 70 V, tandis que leur hauteur était de 2 m de manière constante. De plus, plus le diamètre du tube est grand, plus la capacité du TiO₂ est forte nanotubes pour favoriser la différenciation ostéogénique des CSM. L'inhibition de la polymérisation de l'actine F par Cyto D a inhibé la différenciation ostéogénique des MSC ainsi que l'expression des protéines contenues dans les complexes d'adhésion focale tels que la vinculine (VCL) et la kinase d'adhésion focale (FAK). En revanche, après le traitement Jasp, la polymérisation de la F-actine a amélioré l'expression de RhoA et des facteurs de transcription YAP/TAZ. Sur la base de ces données, nous avons conclu que TiO₂ les nanotubes ont facilité la différenciation ostéogénique des CSM, et cette capacité a été renforcée avec l'augmentation du diamètre des nanotubes dans une certaine plage (30-70 V). La F-actine a médié ce processus via MKL1 et YAP/TAZ.

Introduction

Le titane et les alliages de titane, en raison de leur excellente biocompatibilité, résistance à la corrosion et propriétés mécaniques, sont largement utilisés dans des applications cliniques telles que les prothèses articulaires totales et les implants dentaires [1,2,3]. Cependant, de nombreux défis restent à résoudre, notamment le descellement aseptique et l'infection [4, 5]. Ces dernières années, un certain nombre d'études visant à améliorer l'ostéointégration et les propriétés antibactériennes ont été menées. Par exemple, le MoS₂ Le revêtement /PDA-RGD sur les implants en titane peut non seulement favoriser l'intégration d'un implant en titane avec l'os hôte, mais également inhiber la croissance bactérienne avec une efficacité élevée [6]. De plus, la topographie de surface a attiré de plus en plus d'attention, et la modification topographique diffère des modifications chimiques en ne changeant que la structure à l'échelle micro et nanométrique. La stimulation des signaux chimiques sur les cellules est instable et cytotoxique. En comparaison, des signaux physiques sûrs et contrôlables peuvent éviter certains effets secondaires causés par des molécules chimiques. Par conséquent, la modification topographique de la surface des implants et la régulation de l'ostéointégration par la structure topographique peuvent fournir une nouvelle façon de résoudre le problème clinique d'une mauvaise ostéointégration après l'implantation de prothèses.

Dans le domaine de l'ingénierie du tissu osseux et de la régénération osseuse, l'interaction cellule-morphologie est considérée comme une stratégie de gestion prometteuse pour un contrôle précis de la fonction et de la différenciation des cellules souches. Dans le même temps, l'os lui-même a une hiérarchie élégante dans la gamme du nanomètre et du micron [7]. Par conséquent, la morphologie de surface peut fournir une niche similaire, qui peut imiter la structure osseuse naturelle et favoriser la différenciation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses à la surface de l'os hôte et de l'implant. Les morphologies de surface peuvent être constituées de nombreuses structures différentes, notamment des nanotubes, des nanofils, des nanopores, etc. En particulier, les réseaux de nanotubes ont suscité un grand intérêt dans de nombreux domaines ces dernières années en raison de leurs caractéristiques de surface uniques, telles qu'un rapport surface/volume élevé, une plasticité biologique et une capacité d'adsorption élevée. Par exemple, une nouvelle étude montre que les nanotubes de nitrure de bore (BNNT) constituent un matériau sensible aux gaz qui peut être utilisé comme capteur de gaz pour surveiller le fonctionnement des transformateurs en détectant la composition et la teneur en gaz dissous dans l'huile [8]. En biomédecine, la topographie de surface est également capable de diriger les comportements cellulaires, notamment la migration, l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaires. Les dernières études révèlent que la topographie à l'échelle nanométrique peut orienter les cellules souches mésenchymateuses (CSM) à se différencier en ostéoblastes afin de renforcer l'ostéointégration précoce [9,10,11,12]. Il est même rapporté qu'une modification de surface combinée à l'échelle micro et nanométrique peut amener les CSM à se différencier en cellules musculaires lisses contractiles [13]. Cependant, les mécanismes moléculaires de la façon dont la topographie de surface dirige le destin des cellules doivent encore être élucidés, ce qui est important pour l'évaluation de la sécurité des matériaux et la conception des matériaux.

L'actine filamenteuse (F), également appelée microfilament, est l'un des trois composants majeurs du cytosquelette des cellules eucaryotes. Il est composé de polymères d'actine (G) globulaire, modifiés par de nombreuses autres protéines. La F-actine a une polarité structurelle due au fait que toutes les sous-unités du microfilament pointent vers la même extrémité. L'extrémité barbelée est dirigée vers un monomère adjacent différent, tandis que l'extrémité pointue possède une sous-unité d'actine avec le site de liaison à l'ATP exposé. C'est-à-dire que l'ATP est impliqué dans le processus de transformation entre la G-actine et la F-actine. Ce processus est dans un équilibre dynamique, la polymérisation et la dépolymérisation se produisant simultanément, également connues sous le nom de tapis roulant, souvent observées dans les lamellipodes et les filopodes [14]. Par conséquent, il est évident que la dynamique de l'actine joue un rôle important dans des fonctions cellulaires telles que la migration cellulaire, la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire. Cependant, la F-actine agit non seulement comme une structure physique supportant la charge mécanique, mais participe également à d'autres comportements biologiques tels que la transduction du signal et l'expression des gènes. L'accumulation de preuves démontre que la F-actine peut convertir des signaux physiques en signaux chimiques en interagissant avec d'autres protéines [15,16,17,18]. Par exemple, la reconstruction biomécanique et géométrique favorise l'apoptose des cellules tumorales en empêchant la superposition de la polymérisation du monomère d'actine à la F-actine [15]. Les impulsions ultrasonores améliorent l'ostéogenèse des cellules souches mésenchymateuses humaines en inhibant la dépolymérisation de l'actine F [16]. Notre étude précédente a également montré que la contrainte mécanique augmente la stabilité de la F-actine [17]. Parce que la structure creuse des nanotubes offre moins de sites d'adhésion pour les cellules, le réarrangement du cytosquelette est inévitable afin de maintenir l'équilibre biomécanique. Par conséquent, nous avons certainement des raisons de croire que la F-actine est susceptible d'intervenir dans la différenciation cellulaire induite par la nanotopographie.

Dans cette étude, nous avons fabriqué du TiO₂ nanotubes, modifié leur topographie par oxydation anodique et exploré leur capacité à favoriser la différenciation ostéogénique des CSM. Ensuite, nous avons étudié si la F-actine joue un rôle critique dans la mécanotransduction. La cytochalasine D (Cyto D), qui se lie de manière compétitive à l'extrémité barbelée de la F-actine pour empêcher l'incorporation de la G-actine dans le filament, a été utilisée pour inhiber la polymérisation de la F-actine, et le jasplakinolide (Jasp) a été utilisé pour améliorer la stabilisation de la assemblage d'actine. De plus, nous voulions également élucider comment la F-actine fonctionne en transformant les signaux physiques en signaux biochimiques. Sur la base des résultats de notre étude précédente, nous avons émis l'hypothèse que la voie MAPK pourrait être impliquée dans ce processus [17]. Des facteurs de transcription tels que la protéine associée à Yes (YAP)/le coactivateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ) et MKL1, qui sont considérés comme des mécanocapteurs et des mécanotransducteurs, ont également fait l'objet de notre étude pour examiner comment la F-actine influence les cellules souches sort, car certaines études dans d'autres domaines impliquaient qu'elles étaient liées à la F-actine [19,20,21]. De manière générale, nous espérons clarifier le rôle de la F-actine dans le processus de différenciation des cellules souches induit par les nanotubes, afin de guider la conception des matériaux et l'évaluation de la biosécurité des implants modifiés par les nanotubes.

Matériaux et méthodes

Fabrication de TiO₂ Nanotubes

Des tranches de titane pur (pureté à 99,9 %, 2 mm d'épaisseur; Shengshida, Hebei, Chine), utilisées comme substrat, ont été polies avec du papier de verre au carbure de silicium de grains n° 400 et 1500. Les échantillons ont ensuite été lavés séquentiellement avec de l'acétone, de l'alcool anhydre et de l'eau déminéralisée dans une machine de nettoyage à ultrasons, et enfin séchés à température ambiante pendant 3 h. Pour fabriquer la nanotopographie, les échantillons prétraités ont été fixés comme anode, tout en utilisant une pièce de platine comme contre-cathode dans une solution aqueuse d'électrolyte de 0,15 M NH₄ F et 90 % de glycol pendant 1 h. La tension d'anodisation était une tension constante de 30, 40, 50, 60 ou 70 V. Après oxydation anodique, chaque échantillon a été rincé avec de l'eau désionisée pendant 30 min et lavé avec de l'alcool anhydre dans une machine de nettoyage à ultrasons pendant 15 min. Enfin, tous les échantillons ont été stérilisés en autoclave à 120 °C pendant 1 h puis humidifiés avec du milieu de culture avant utilisation.

Le mécanisme de réaction de la fabrication des nanotubes n'est pas clair et la théorie dominante actuelle est la théorie de la dissolution à champ amélioré. La formation de réseaux de nanotubes est le résultat d'un équilibre dynamique sous l'action de l'oxydation du champ, de la dissolution du champ et de la dissolution chimique (Fig. 1b). Le processus d'anodisation peut être décrit comme suit :dans la première étape, une couche barrière d'oxyde est formée sur l'interface électrolyte-métal :

$$ {\mathrm{Ti}}^{4+}+2{\mathrm{H}}_2\mathrm{O}\à {\mathrm{Ti}\mathrm{O}}_2+4{\mathrm{ H}}^{+} $$ (1)

Un tableau récapitulatif de notre étude. un Organigramme montrant l'oxydation anodique et l'induction de la différenciation cellulaire. b Le substrat de titane prétraité a été fixé comme anode dans une solution aqueuse d'électrolyte avec 0,15 M de NH₄ F et 90 % de glycol à tension constante pendant 1 h. Les nanotubes auto-assemblés devaient se former uniformément. Son mécanisme de réaction est décrit dans les matériaux et méthodes. c Schéma de principe du mécanisme de différenciation ostéogénique des cellules souches induite par les nanotubes

Ensuite, des fissures et des fentes étroites apparaissent à la surface en raison de la dissolution améliorée par le champ de la couche d'oxyde. Diffusion de F⁻ ions dans ces fissures et fentes améliore la vitesse de dissolution. Les fissures s'agrandissent et se connectent aux fissures voisines. Enfin, la vitesse de formation et la vitesse de dissolution de la couche d'oxyde de titane atteignent un équilibre dynamique, et les nanotubes ne croissent plus :

$$ {\mathrm{TiO}}_2+6{\mathrm{F}}^{-}+4{\mathrm{H}}^{+}\à {\gauche[{\mathrm{TiF}}_6 \right]}^{2-}+2{\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$ (2)

Caractérisation de surface

Des échantillons fabriqués avec différentes tensions (30, 40, 50, 60 ou 70 V) ont été rincés avec de l'éthanol et de l'eau déminéralisée pendant 15 min, puis séchés à température ambiante. La microscopie électronique à balayage (SEM450, FEI Nova Nano SEM ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) a été utilisée pour caractériser la structure de surface et mesurer le diamètre interne et la hauteur des nanotubes après avoir recouvert les échantillons d'une fine couche d'or. Pendant ce temps, une analyse dispersive d'énergie des rayons X (EDS) a été réalisée pour analyser la composition élémentaire des nanotubes. La microscopie à force atomique (AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, Belgique) a été utilisée pour étudier la morphologie de surface et la rugosité de surface des échantillons. Trois zones différentes ont été sélectionnées dans chaque échantillon et les mesures ont été répétées trois fois.

Culture cellulaire

Des rats mâles Sprague-Dawley (SD) âgés de quatre semaines ont été achetés au centre d'expérimentation animale du Shanghai Ninth People's Hospital (Shanghai, Chine). Des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat (BMSC) ont été isolées de manière aseptique des fémurs et des tibias. Les BMSC ont été purifiés et étendus davantage dans un milieu essentiel α-minimal (α-MEM ; Hyclone, Logan, UT, États-Unis) contenant 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis ), 100 mg/mL de streptomycine (Gibco) et 100 U/mL de pénicilline (Gibco), et incubés à 37 °C dans une atmosphère humidifiée composée de 95 % d'air et de 5 % de CO₂ . Le milieu de culture a été renouvelé tous les 2 jours, et les cellules ont été trypsinisées et repiquées à 80% de confluence. Toutes les cellules utilisées dans cette étude se trouvaient entre les passages 3 et 5. Le milieu d'induction ostéogénique était composé d'un milieu de croissance complété par 100 nM de dexaméthasone, 10 mM de β-glycérophosphate et 50 mM d'acide ascorbique (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) .

Test de prolifération cellulaire

Le TiO₂ des tranches de titane modifiées par des nanotubes ont été découpées en formes circulaires et placées dans les puits d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Les BMSC entre les passages 3 à 5 ont été cultivés sur TiO₂ nanotubes à une densité de 3 × 10⁴ cellules/disque dans un milieu de croissance ou un milieu ostéogénique. Après 2 jours de culture cellulaire, de la cytochalasine D (Cyto D, Sigma-Aldrich) et du jasplakinolide (Jasp, Sigma-Aldrich), utilisés pour perturber la polymérisation de l'actine F, ont été ajoutés au milieu chaque jour pendant 3 jours. La concentration finale et le temps de travail de Cyto D et Jasp étaient de 5 M, 1 h et 2 M, 3 h respectivement. Le milieu de culture a été renouvelé après incubation avec les réactifs. La viabilité et la prolifération cellulaires ont été évaluées à l'aide du test Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japon) 12 h après le traitement par Cyto D ou Jasp. Les cellules ont été incubées avec une solution de CCK8 à 10 % (v/v) pendant 2 h dans un incubateur de cellules à 37 °C sous 5 % de CO₂ . Ensuite, nous avons transféré 100 L du mélange réactionnel dans les puits d'une plaque à 96 puits et l'absorbance (DO) du produit colorant formazan dans la culture a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible Multiscan (Safire2; TECAN, Mannedorf, Suisse ). De plus, nous avons également compté le nombre approximatif de cellules à l'aide d'un compteur de cellules automatisé (AMQAX1000, Life Technologies). Avant le comptage cellulaire, les BMSC ont été détachés par voie enzymatique de TiO₂ nanotubes et colorés au bleu Trypan (Sigma-Aldrich).

Coloration à la phosphatase alcaline et analyse de l'activité ALP

Les BMSC ont été ensemencés sur cinq TiO₂ différents tranches de titane modifiées par nanotubes (30, 40, 50, 60 ou 70 V) à une densité de 3 × 10⁴ par puits et cultivées en milieu ostéogénique. Les réactifs ont été ajoutés comme décrit ci-dessus. Après 7 jours d'incubation, BMSC cultivés sur TiO₂ les nanotubes ont été lavés trois fois avec du PBS, fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % et incubés dans une solution de travail de phosphatase alcaline (ALP) d'un kit ALP selon les instructions du fabricant (Hongqiao, Shanghai, Chine). Les résultats ont été observés au stéréomicroscope après lavage au PBS.

Pour l'analyse de l'activité ALP, les cellules ont d'abord été lysées avec du tampon RIPA sans inhibiteurs de protéase et de phosphatase, puis les lysats centrifugés ont été dosés à l'aide d'un kit de dosage ALP (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, Chine) en suivant le protocole fourni. L'activité a finalement été normalisée à la concentration en protéines du lysat correspondant.

Immunocytochimie

Après 3 jours de traitement Cyto D et Jasp, les BMSC ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 20 min à température ambiante puis lavées trois fois avec du PBS. Les cellules ont été perméabilisées avec 0,3 % de Triton-X 100 pendant 30 min, lavées trois fois avec du PBS et colorées avec de la phalloïdine conjuguée à la Rhodamine pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité. Ensuite, les cellules ont été rincées avec du PBS et contre-colorées avec du DAPI (Beyotime Institute of Biotechnology) pendant 10 min à température ambiante. Après trois lavages supplémentaires avec du PBS, les échantillons ont été fixés sur une lame de verre et observés par microscopie confocale.

Western Blot

Pour évaluer l'expression des protéines, des BMSC cultivés sur TiO₂ les nanotubes ont été récoltés avec de la trypsine (Gibco). Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et lysées avec du tampon RIPA additionné d'un cocktail d'inhibiteur de protéase et de phosphatase pendant 30 min sur de la glace. Le lysat a été collecté par centrifugation à 12.000×g pendant 15 min à 4°C. La concentration de protéines totales dans le surnageant a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage de protéines d'acide bicinchoninique (BCA) (Beyotime) selon les instructions du fabricant. Un tampon de chargement a été ajouté aux échantillons de protéines comme ci-dessus, qui ont ensuite été bouillis à 95 °C pendant 15 min. Pour l'analyse par Western blot, 10 L de la préparation protéique ont été chargés sur un gel SDS-PAGE 12,5 % (EpiZyme Inc., Cambridge, MA, USA) et soumis à une électrophorèse à 120 V pendant 1 h, puis électro-transférés sur un polyvinylidènedifluorure (PVDF) membrane à 250 mA pendant 2 h. Les membranes ont ensuite été bloquées avec 5 à 10 % de lait en poudre écrémé dans du TBST pendant 1 h sur un agitateur à température ambiante et incubées avec un anticorps primaire dilué dans du tampon de dilution (Beyotime) à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, un anticorps secondaire conjugué fluorescent dilué dans un tampon de dilution a été ajouté aux membranes après lavage trois fois avec du TBST pendant 5 min, et les membranes ont ensuite été incubées à température ambiante pendant 1 h dans l'obscurité. Les bandes de protéines ont été détectées par un système d'imagerie par fluorescence infrarouge à deux couleurs (Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, USA). En particulier, si les bandes de protéine de référence interne étaient unifiées, la membrane était strippée et résondée avec un autre anticorps primaire, suivi du même processus. Nous avons utilisé l'anticorps GAPDH comme protéine de référence interne pour normaliser l'expression de la protéine, et les autres anticorps primaires utilisés dans cette étude étaient anti-vinculine (dilution 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-FAK (dilution 1:1000 , Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-Runx2 (dilution 1:1000, Cell Signaling Technology), anti-RhoA (dilution 1:1000, Cell Signaling Technology), anti-F-actine (dilution 1:500) , Abcam), anti-Osx (dilution 1:500, Abcam) et anti-pYAP (dilution 1:1000, Cell Signaling Technology). Les anticorps secondaires étaient les IgG H&L de chèvre anti-souris (IRDye® 680RD, dilution 1:5000, Abcam) et les IgG H&L de chèvre anti-lapin (IRDye® 680RD, dilution 1:5000, Abcam).

PCR quantitative en temps réel

Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée au jour 7 pour évaluer l'expression génique du facteur de transcription 2 lié au runt (Runx2), Osterix (Osx), Alp, osteocalcin (OCN), RhoA, YAP, TAZ, vinculin (VCL), kinase d'adhésion focale (FAK) et leucémie mégacaryoblastique 1 (MKL1) dans des cellules cultivées en milieu ostéogénique sur TiO₂ nanotubes. L'ARN total a été extrait des cellules en utilisant un kit d'ARN total (R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA). La concentration et la pureté des échantillons d'ARN ont été déterminées par densité optique à une longueur d'onde de 260 et seuls les échantillons présentant à la fois des ratios A260/280 et A260/230 supérieurs à 1,8 ont été analysés. Les échantillons d'ARN ont été rétro-transcrits en ADNc à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc qScript (Takara, Shiga, Japon) selon les instructions du fabricant. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara) en utilisant un système de PCR en temps réel QuantStudio 6 Flex (Life Technologies). GAPDH, un gène domestique, a été utilisé comme référence interne. Les données ont été analysées en utilisant la comparaison Ct (2^-ΔΔCt ) méthode et exprimée en changements de pli par rapport au témoin. Les séquences des amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau 1.

Analyse statistique

Toutes les données sont représentatives d'au moins trois expériences indépendantes utilisant des échantillons en triple, sauf indication contraire. Les données sont exprimées en moyenne ± écart type (SD). Les différences entre les groupes ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur suivie du test post-hoc de Student-Newman-Keuls ou du t de Student. test. P les valeurs < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Caractérisation de surface

Pour fabriquer la nanotopographie, TiO₂ des nanotubes ont été formés sur un substrat de titane pur en utilisant un équipement d'oxydation anodique à différentes tensions constantes (30, 40, 50, 60 et 70 V) pendant 1 h (Fig. 1). Un réseau uniformément réparti de nanotubes auto-assemblés a été observé par microscopie électronique à balayage (MEB). Les vues de côté et de dessus des nanotubes sont illustrées sur les figures 2a, b. La hauteur des nanotubes dans tous les échantillons de cette étude était d'environ 2 m, tandis que les diamètres intérieurs des nanotubes étaient d'environ 74 nm (30 V), 92 nm (40 V), 112 nm (50 V), 128 nm (60 V) et 148 nm (70 V) (Fig. 2c). Cela indiquait que la hauteur des nanotubes était liée au temps d'oxydation anodique et que le diamètre intérieur était lié à la tension d'oxydation anodique. Une analyse dispersive en énergie des rayons X (EDS) a ensuite été réalisée pour analyser la composition élémentaire des nanotubes. Cela a montré que les nanotubes ne sont constitués que de deux éléments, O et Ti (Fig. 2d, e). La microscopie à force atomique (AFM) a été utilisée pour détecter les structures nanotubulaires et mesurer l'écart moyen arithmétique du profil des nanotubes comme la rugosité de surface (Ra) (Fig. 2f). Les données ont montré que la rugosité de surface des nanotubes augmentait à mesure que le diamètre (c'est-à-dire la tension d'oxydation anodique) augmentait (Fig. 2g).

Caractérisation de surface de nanotubes. un Vue latérale des nanotubes. Barres d'échelle :1 m. b Vue de dessus des nanotubes. Barres d'échelle :500 nm. c Le diamètre intérieur des nanotubes à cinq tensions constantes différentes (30, 40, 50, 60, 70 V). d La composition en éléments chimiques EDS des structures de nanotubes. e Le rapport des éléments de Ti et O. f Images de microscopie à force atomique (AFM) de structures de nanotubes. g La rugosité de surface moyenne (Ra) des nanotubes

TiO₂ Différenciation ostéogénique des CSM induite par les nanotubes

Après 7 jours d'ostéoinduction, une coloration ALP a d'abord été réalisée pour évaluer la différenciation ostéogénique des CSM. Les résultats de coloration ont montré que les CSM cultivées sur TiO₂ les nanotubes avaient une activité ALP plus élevée que les cellules cultivées sur un substrat de titane lisse (groupe témoin) (Fig. 3a). L'analyse statistique de la zone de coloration a démontré que la capacité des nanotubes à induire une différenciation ostéogénique était significativement améliorée par rapport au groupe témoin. Pendant ce temps, nous avons observé une tendance selon laquelle dans la plage de diamètres de cette expérience, plus le diamètre du TiO₂ est grand. nanotubes, plus la capacité à induire une différenciation ostéogénique est forte (Fig. 3b). Ainsi, le groupe 70 V a été utilisé dans des expériences ultérieures pour mieux afficher les résultats. Ensuite, nous avons analysé l'expression des gènes ostéogéniques aux jours 3 et 7. CSM cultivées sur TiO₂ les nanotubes pendant 3 jours et 7 jours ont tous deux montré une promotion significative de l'expression des gènes ostéogéniques (RUNX2, ALP, OCN et OSX) par rapport au groupe témoin (Fig. 3d–g). Les résultats du Western blot ont confirmé que l'expression des protéines de RUNX2 et OSX a également augmenté après 7 jours d'ostéoinduction (Fig. 3c). Fait intéressant, nous avons constaté que la F-actine était régulée à la hausse dans le TiO₂ groupe des nanotubes. Par conséquent, il était évident que TiO₂ les nanotubes ont orienté les CSM vers la différenciation des ostéoblastes, qui était liée au diamètre des nanotubes. Nos résultats suggèrent également l'implication de la F-actine dans ce processus.

TiO₂ les nanotubes ont amélioré l'expression des gènes ostéogéniques des BMSC. un Coloration ALP du substrat de titane lisse et de cinq substrats de nanotubes différents. Les cellules ont été induites avec du milieu ostéogénique pendant 7 jours. b L'analyse statistique de la zone de coloration a été réalisée à l'aide d'ImageJ. c Les protéines associées à l'ostéogenèse (RUNX2 et OSX) et l'actine F dans les CSM ont été analysées par Western blot au jour 7. L'expression de l'ARNm de RUNX2 (d ), ALP (e ), OCN (f ) et OSX (g ) aux jours 3 et 7, analysés par qRT-PCR. NT le groupe des nanotubes. Les données représentent la moyenne ± SD de trois échantillons. *P <0,05, **P <0,01 et ****P <0,001

différenciation des ostéoblastes à médiation par l'actine F des CSM sur TiO₂ Nanotubes

Pour explorer davantage si la F-actine était impliquée dans la différenciation cellulaire induite par la nanotopographie, nous avons utilisé deux réactifs, le jasplakinolide (Jasp) et la cytochalasine D (Cyto D), pour réguler la polymérisation de la F-actine de manière respectivement positive et négative. Les photomicrographies confocales de la coloration Rhodamine-Phalloïdine ont montré que la F-actine dans le groupe de traitement Cyto D était presque dépolymérisée et que les structures fibreuses étaient rarement observées, tandis que Jasp stabilisait et polymérisait la F-actine, vérifiée par des structures en forme de faisceau plus distinctes et plus lumineuses que celles observées. dans le groupe témoin (Fig. 5a). En outre, l'analyse par transfert Western a également confirmé que l'expression protéique de l'actine F était affectée, ce qui a prouvé que Cyto D et Jasp agissaient comme prévu (Fig. 5b). Le test de prolifération cellulaire a montré que Cyto D inhibait de manière significative la prolifération cellulaire, tandis que Jasp favorisait la croissance cellulaire (Fig. 4a). Les résultats de la numération cellulaire étaient cohérents avec ce résultat (Fig. 4b).

L'assemblage d'actine F régule l'expression des gènes ostéogéniques dans les BMSC. un , b La prolifération cellulaire après le traitement par Cyto D et Jasp a été déterminée à l'aide du test CCK-8 ou d'un compteur de cellules automatisé aux jours 1, 2 et 3. c , d La coloration ALP et l'analyse de l'activité ALP ont été effectuées pour évaluer l'expression de l'ALP dans les MSC après un traitement médicamenteux pendant 3 jours. La zone de coloration a été analysée à l'aide d'ImageJ. c , e –h Western blot et qRT-PCR ont été utilisés pour comparer les changements des marqueurs liés à l'ostéogenèse dans le groupe NT+ Cyto D et le groupe NT+ Jasp avec ceux du groupe témoin (sans traitement médicamenteux). NT le groupe des nanotubes. Les données représentent la moyenne ± SD de trois échantillons. *P <0,05, **P <0,01 et ****P <0,001

Ensuite, nous avons évalué la capacité des CSM à se différencier en ostéoblastes pour déterminer si l'actine F médiait ce processus. Nous avons d'abord détecté l'ALP comme marqueur précoce de l'ostéogenèse. Par rapport au groupe témoin, le traitement Cyto D a réduit l'expression de l'ALP et son activité tandis que celle du groupe de traitement Jasp était régulée à la hausse (Fig. 4c, d). Conformément à ce résultat, le traitement Jasp a entraîné une augmentation des niveaux de protéines de RUNX2 et OSX tandis que Cyto D a eu l'effet inverse (Fig. 4c). En accord avec cela, les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes ostéo-spécifiques, y compris RUNX2, ALP, OCN et OSX, ont montré la même tendance après traitement médicamenteux (Fig. 4e–h). Surtout, ces données ont indiqué que la F-actine jouait un rôle important dans le processus de différenciation ostéogénique des CSM induite par TiO₂ nanotubes. La promotion de la dépolymérisation de la F-actine a inhibé la différenciation des ostéoblastes induite par la nanotopographie, tandis que la stabilisation et la polymérisation de la F-actine ont amélioré la différenciation des ostéoblastes.

Différenciation des ostéoblastes régulés par l'actine F des CSM sur TiO₂ Nanotubes via MKL1 et YAP/TAZ

Pour disséquer le mécanisme sous-jacent impliquant la F-actine dans la régulation du sort des MSC, nous avons étudié les protéines/molécules qui interagissent directement avec la F-actine ou affectent la polymérisation de la F-actine. Tout d'abord, nous avons essayé d'identifier comment la nanotopographie affectait l'équilibre entre la F-actine et la G-actine. TiO₂ les nanotubes en tant que signal physique diffèrent des signaux chimiques perméables à la membrane et doivent donc utiliser certains composants de la membrane cellulaire pour transmettre des stimuli dans les cellules. L'accumulation de preuves indique que le complexe d'adhésion focale, y compris l'intégrine, la taline, la kinase d'adhésion focale (FAK), la vinculine (VCL), la tensine et d'autres protéines, fonctionne comme un porteur de signal, qui informe les cellules sur l'état de la matrice extracellulaire (ECM ) et affecte ainsi leur comportement biologique [22, 23]. Plus important encore, la F-actine se lie aux intégrines par le biais de tels complexes d'adhésion focale et forme ainsi des liaisons mécaniques entre les faisceaux d'actine intracellulaire et la MEC [24]. Par conséquent, nous avons ensuite analysé l'expression des composants du complexe d'adhésion focale. Les résultats ont montré que l'expression de la protéine et de l'ARNm de VCL et de FAK était cohérente avec le changement de F-actine, indiquant que le complexe d'adhésion focale était impliqué dans le processus de différenciation ostéogénique des CSM induite par TiO₂ nanotubes (Figs. 5b et 6a, b). En outre, nous avons également constaté que RhoA, une petite protéine GTPase de la famille Rho des GTPases, était régulée positivement dans le groupe de traitement Jasp et inhibée par Cyto D (Figs. 5b et 6a, b). RhoA est une importante molécule de transduction de signal en amont dans la voie MAPK et pourrait être régulée par FAK [25, 26]. La fonction principale de RhoA est de favoriser la polymérisation et la stabilité des fibres de stress (F-actine) et l'assemblage du complexe d'adhésion focale [27]. Prises ensemble, ces données suggèrent que TiO₂ les nanotubes pourraient influencer la polymérisation de l'actine F via le complexe d'adhésion focale et RhoA.

La coloration par immunofluorescence a révélé le niveau de F-actine par coloration avec de la phalloïdine conjuguée à la rhodamine (a ). The protein expression of FAK and VCL contained in the focal adhesion complex, RhoA and phosphorylated YAP were investigated by Western blotting (b ). NT the nanotubes group

Effect of F-actin assembly on FAK (a ), vinculin (VCL) (b ), RhoA (c ), MKL1 (d ), YAP (e ), and TAZ (f ) gene expression in MSCs. NT the nanotubes group. Data represent the mean ± SD of three samples. *P <0.05, **P <0.01, and ***P <0.001

But how does F-actin regulate cell fate? Most studies have demonstrated that F-actin is involved in cell migration, cell division, endocytosis, and especially tumor cell invasion [28,29,30]. Few studies have suggested that F-actin could also regulate cell differentiation, let alone its specific molecular mechanism [31, 32]. Consequently, we searched for articles that mentioned the F-actin changes and found that YAP/TAZ, two closely related transcriptional co-activators in the Hippo signaling pathway, which shuttle between the cytoplasm and the nucleus, may serve as mechanotransducers in regulating MSC differentiation [33,34,35]. In addition, we also found that MKL1, a key regulator of smooth muscle cell differentiation, which interacts with the transcription factor serum response factor, could bind to G-actin and also circulate between the cytoplasm and the nucleus [21, 36]. Our results ultimately identified the involvement of YAP/TAZ and MKL1 in nanotube-induced osteoblast differentiation mediated by F-actin (Figs. 5b and 6d–f). Interestingly, the protein expression of phosphorylated YAP showed the opposite trend, indicating that not only was the expression of YAP changed, but the phosphorylation of YAP was also changed by Cyto D and Jasp (Fig. 5b). This result was consistent with the report that the phosphorylation of YAP/TAZ could be sequestrated in the cytoplasm [35].

In summary, our results preliminarily demonstrated that F-actin regulated osteoblast differentiation of MSCs on TiO₂ nanotubes through MKL1 and YAP/TAZ (Fig. 7).

Schematic representation of F-actin assembly induced by nanotubes, and the putative role of MKL1 and YAP/TAZ in acting as the downstream mediators of F-actin signaling to regulate gene expression

Discussion

Titanium and titanium alloys are the most widely used metal materials in orthopedic clinical implants due to the good properties of titanium [3]. However, aseptic loosening is still an urgent problem to be solved and improved, and the key is likely to lie in improving the integration of the implant and the host bone. Previous studies have shown that surface coating and modification or immobilization of biofunctional molecules will be beneficial to osseointegration [37]. Recently, the surface topography of implants has attracted the attention of many researchers thanks to studies into the cell response to physical cues [9,10,11, 13, 38]. In this study, we demonstrated the ability of nanotubes to promote osteogenic differentiation of MSCs, and this ability was enhanced with increasing inner diameter of the nanotubes (30–70 V). This will help guide the diameter of the nanotubes on the surface of the implants.

As a topographical structure, nanotubes first change the physical properties of the material, such as adsorption capacity and electrical and thermal conductivity. These physical properties determine their application in the industrial field. For example, most high-voltage power transformers need to be filled with insulating material, which is usually transformer oil or insulating gas. When the insulation of a transformer fails due to overheating and partial discharge, a serious discharge accident will occur. Therefore, finding an effective method that accurately detects the concentration and types of dissolved gases or insulating gas decomposition components in a transformer is necessary to monitor the operating state of the transformer [8, 39,40,41]. The traditional approach is to look for materials with good gas adsorption in transition elements, which are rich in d electrons, such as Pd(1 1 1) [39]. Nowadays, nanotubes are widely studied for their good gas adsorption properties. He et al. found that CuO-BNNT was suitable for the adsorption of C₂ H₂ , because of its stronger adsorption on C₂ H₂ [8]. Meanwhile, TiO₂ itself can be a gas-sensing material. Gui et al. found that Co-doped TiO₂ further enhanced gas adsorption capacity and exhibited a superior adsorption ability and conductivity change toward C₂ H₄ molecules [40]. Consistent with this study, Mn-doped graphene also exhibited enhanced conductivity and superior capability of C₂ H₂ and CO detection than pristine graphene [41]. The above research indicates that the TiO₂ nanotubes prepared in our experiment have a potential application in the field of monitoring the operative state of a transformer. However, the adsorption capacity and electrical conductivity of the nanotubes to gases need to be further studied, especially whether these properties are enhanced after doping with transition elements (e.g., Mn).

In addition to changing the physical properties of a surface, nanoscale morphology also affects the biological behavior of the cells attached to it. Cells first adhere to the surface of the material and then migrate, proliferate, and differentiate. Compared to a flat surface, the hollow structure of the nanotubes provides fewer adhesion sites for cells. Therefore, in order for the cells to adhere to the nanotube surface steadily and maintain the biomechanical balance within the cell, the focal adhesion complex begins to assemble and mature, and F-actin becomes strong and stable.

F-actin, a linear polymer microfilament consisting of G-actin monomers, is one of the three major components of the cytoskeleton. As a mechanical-loading structure, F-actin is generally believed to be involved in cell division, cell migration, endocytosis, and tumor cell invasion [28,29,30], but some recent studies showed that it can also affect cell differentiation [31,32,33, 36]. For example, actin cytoskeletal depolymerization by simvastatin induces chondrocyte differentiation [31], and actin depolymerization enhances adipogenic differentiation in human stromal stem cells [32]. Our results also revealed that, compared with the control group, MSCs cultured on nanotubes had higher F-actin levels and a more obvious fibrous structure. Meanwhile, promotion of F-actin polymerization by Jasp enhanced osteogenic differentiation, while the depolymerization of F-actin inhibited osteogenic differentiation, suggesting that F-actin mediates TiO₂ nanotube-induced osteoblastic differentiation of MSCs.

F-actin can be regulated by Rho GTPases, members of the Ras superfamily [23, 42], and Rho can induce actin reorganization through at least two effectors, ROCK and Dia. ROCK is activated by binding to Rho-GTP and then myosin light chain (MLC), the substrate of ROCK, plays an important role in F-actin assembly. ROCK inhibits the activity of MLC phosphatase, leading to an increase in MLC phosphorylation, which stimulates the ATPase activity of myosin II and promotes the assembly of F-actin. In addition, ROCK also targets LIM kinase (LIMK). Phosphorylated LIMK inactivates cofilin by phosphorylation, which can disassemble F-actin in its active state. Another effector is Dia, a member of the formin-homology (FH) family of proteins which contains two FH domains. These domains contain multiple proline-rich motifs which bind to the G-actin-binding protein, profilin. This interaction contributes to actin polymerization and F-actin organization [42]. We detected one of the Rho GTPases, RhoA, and found that the expression of RhoA was consistent with the level of F-actin. However, we were unable to clearly describe how the nanotubes regulate the expression of RhoA, because there are many other regulators, including integrin signaling, other adhesion receptors, G protein-coupled receptors (GPCRs), soluble factors such as LPA, receptor tyrosine kinase signaling, and so on [43].

Knowing that F-actin can be regulated by RhoA, we next asked what role focal adhesion played in this process, because focal adhesion complexes, containing integrins, talin, vinculin, paxillin, and focal adhesion kinase (FAK), are formed and mature when cells attach to the surface of nanotubes. Integrins are transmembrane heterodimers that couple the ECM to the other focal adhesion proteins so as to facilitate cell attachment. They not only act simply as hooks but also transmit to the cell critical signals about the nature of its surroundings, which along with other signals such as EGFR, prompt the cell to make decisions about its biological behaviors. These signals are further transmitted to F-actin, which is directly connected to the focal adhesion complexes. On the one hand, the nanoscale morphology causes focal adhesion complex assembly and maturation. On the other hand, kinases such as FAK and Src kinase family members will recruit molecules such as CRK to self-regulate the assembly and maturation of focal adhesion complexes [44,45,46]. Our results demonstrated that the formation and maturation of focal adhesion complexes were impaired by F-actin depolymerization, suggesting that there was a feedback from focal adhesion complexes to actin assembly in line with published reports.

However, it should not be ignored that these proteins contained in focal adhesion complexes have the function of signal transduction [47]. That is to say, nanotubes may directly regulate gene expression through signal cascades, and F-actin may just participate in or be affected by this process. For instance, the dual kinase complex of FAK and Src can regulate Rho GTPases such as RhoA. This shows that nanotubes can regulate RhoA through integrins and the FAK/Src complex. In addition Src, a non-receptor tyrosine kinase protein, can activate Ras (small GTPase) by phosphorylating FAK at tyrosine residue 925 [47, 48]. Then, Ras activates numerous biochemical pathways, including the well-studied MAPK pathway and the PI3K/AKT/mTOR pathway. In the MAPK pathway, Ras activates c-Raf, followed by mitogen-activated protein kinase kinase (MAP2K) and then MAPK1/2, also known as extracellular signal-regulated kinase (ERK). ERK in turn activates transcription factors such as serum response factor (SRF) and c-Myc that are involved in regulating growth and differentiation [49]. What is more, Runx2, a key transcription factor in osteogenic differentiation, can also be regulated by ERK [50], and our previous study confirmed that mechanical strain promoted osteogenic differentiation of BMSCs through the FAK-Erk1/2-Runx2 pathway [17]. Therefore, we cannot rule out that ERK plays a role in nanotube-induced osteogenic differentiation and further study is still needed.

So what exactly is the role of F-actin in inducing differentiation of nanotubes, because its change can affect cell differentiation? One possibility is that the change of F-actin assembly can inversely regulate the level of FAK so as to induce osteogenic differentiation through the FAK-Erk1/2-Runx2 pathway as described above, because in our results, focal adhesion complexes and actin polymerization showed the same trends of change, indicating that they act as a whole in response to the extracellular environment. However, some other possibilities also exist, and a number of articles have shown that MKL1 and YAP/TAZ act downstream of the actin dynamic balance [20, 51,52,53,54]. Both of them shuttle between the cytoplasm and the nucleus, and may help to transduce signals from the cytoskeleton to the nucleus.

MKL1, also termed myocardin-related transcription factor A, is sensitive to changes in G-actin levels. When cytoplasmic G-actin levels increase, monomeric G-actin binds to MKL1 and prevents it from binding to SRF and activating transcription. SRF target genes include actins such as smooth muscle actin (SMA) as well as other actin-binding proteins, including immediate early genes like c-fos and egr1. Recent studies have demonstrated that changing SRF activity could regulate adipogenesis by activating the adipogenesis transcription factor peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), and also regulate bone formation via IGF-1 and Runx2 signaling [55, 56].

YAP and TAZ are two transcriptional coactivators in the Hippo signaling pathway, identified as an important regulatory pathway that restricts cell proliferation, thereby controlling organ size and morphogenesis [20]. Large tumor suppressor genes 1 and 2 (LATS1/2) phosphorylate them, thereby creating a binding site for 14-3-3 proteins, the binding of which prevents their nuclear import [53, 54]. As a consequence, phosphorylated forms of YAP/TAZ are sequestered in the cytoplasm, preventing the expression of genes like Ctgf and Areg. In addition, some studies have shown that YAP/TAZ can interact with T-box 5 (TBX5), RUNX2, and p73 to regulate gene expression [57,58,59]. Further, cell adhesion to cell matrix proteins has been shown to trigger YAP nuclear localization through an integrin/FAK/Src axis. In our study, the results suggested that this pathway was possibly involved in nanotube-induced differentiation. Further study into the downstream mediators of the integrin/FAK/Src axis should be carried out to clarify the specific mechanism.

On the other hand, more and more studies illustrate that F-actin interacts with Hippo signaling, and somehow inhibits the phosphorylation of YAP [54, 60], which is consistent with our experimental results that promoting F-actin polymerization reduces the expression of phosphorylated YAP. We hypothesize that ATP involved in the process of the transformation between G-actin and F-actin may also play an important role in the phosphorylation of YAP, which is yet to be studied.

After understanding the above possible molecular mechanisms, we can try to explain some of the experimental phenomena found in this study. Our results revealed that the larger the diameter of the nanotubes, the stronger the ability of the nanotubes to promote osteogenic differentiation. This is consistent with previous research [61, 62]. The reason for this phenomenon is that the larger the diameter of the nanotubes, the less adhesion sites they can provide to the cells, and the greater the assembly and maturity of focal adhesion complexes. Along with these, stress fibers made of F-actin will have greater strength and stability. These structures enhance the signaling that promotes osteogenic differentiation. Predictably, however, this effect is significantly reduced when the nanotubes become too large in diameter, making it difficult for the cells to adhere to the surface [12]. Similarly, when the height of the nanotubes is inconsistent, the differences in height can result in a change of adhesion site and rearrangement of the cytoskeleton, which will further affect cell differentiation. Intriguingly, even flat surface materials without nanotube modification can induce changes in cell differentiation. A number of studies have demonstrated that focal adhesion formation and stress fiber organization are regulated by substrate stiffness [63,64,65], and YAP/TAZ also plays an important role in this process. Therefore, it is obvious that the integrins–FAs (focal adhesions)–F-actin axis plays a role in the transduction of physical signals into intracellular chemical signals.

In summary, our results demonstrated that F-actin regulates osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells on TiO₂ nanotubes through MKL1 and YAP/TAZ, whose target genes partly explained the proliferation and differentiation of MSCs. We know that there is no single change in the signal network and any change is regulated by numerous molecules and proteins. One type of biological behavior must be the result of the regulation of a series of signaling pathways. Nanotubes induce cell differentiation by triggering a complex network of signals, including integrins, proteins contained in focal adhesion complexes, FAK, Src, Rho GTPase, the MAPK pathway, the Hippo pathway, and other reported signaling pathways. At least as important, there are many signal cycles in the signal network and a downstream signal can regulate the upstream signal via feedback. In this study, we found that vinculin and FAK can be regulated backwards by F-actin assembly, increasing the uncertainty of molecular function. Therefore, more details of the molecular mechanism await further study.

Conclusions

Our results showed that TiO₂ nanotubes promoted the osteogenic differentiation of MSCs, and this ability was enhanced with the increasing diameter of nanotubes within a certain range (30–70 V). F-actin mediated nanotube-induced cell differentiation through MKL1 and YAP/TAZ, providing a novel insight into the study of cell differentiation.

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données utilisés et analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.