Synthèse en une étape, rapide et verte de nanoparticules d'or multifonctionnelles pour l'imagerie et la thérapie ciblées sur les tumeurs

Introduction

La doxorubicine (DOX) est un médicament anticancéreux couramment utilisé qui a été largement utilisé dans une variété de chimiothérapies anticancéreuses, telles que les tumeurs malignes du sang [1], une variété d'adénocarcinomes [2,3,4,5], le sarcome des tissus mous [6 ], etc. Cependant, des doses élevées et à long terme de DOX entraîneront une résistance aux médicaments [7], des nausées [8], une perte de cheveux [9] et une toxicité aiguë et chronique [10], pouvant conduire à une insuffisance cardiaque congestive [11]. Par conséquent, il est très nécessaire de développer un support de médicament avec une bonne biocompatibilité et une capacité de chargement de médicament élevée. Ces dernières années, de nombreux nanomatériaux, tels que les points quantiques [12, 13], le chitosan [14, 15] les nanomatériaux de silicium [16, 17], les nanomatériaux polymères [18,19,20], les nanoparticules fluorescentes [21,22, 23,24] et des nanomatériaux métalliques [25,26,27,28,29,30] ont été développés comme vecteurs de transport DOX pour le diagnostic et le traitement des tumeurs. Les nanomatériaux d'or ont été largement utilisés en raison de leurs propriétés chimiques et optiques uniques, de leur faible toxicité, de leur bonne biocompatibilité et de la modification de surface de la capacité de contrôle [31, 32] parmi ces nanomatériaux. Jusqu'à présent, il existe trois types d'approches pour la conjugaison de la DOX sur les PNB. La première consiste à conjuguer la DOX à la surface des PNB à l'aide d'hydrazine [25], de chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC) [26], d'agent sensible au pH [27], de DCC/ Système NHS [28]. La seconde consiste à incuber les PNB avec de la DOX pendant au moins 24 h [29]. Le troisième est de remplacer le citrate conjugué à la surface des nanoparticules d'or (PNB) par la DOX [30]. Bien que ces GNP conjugués à la DOX aient été utilisés en thérapie tumorale, l'application est encore limitée en raison du manque de spécificité suffisante. Récemment, le groupe d'El-sayed [27] a fonctionnalisé les PNB avec des peptides DOX, RGD et des peptides de signal de localisation nucléaire (NLS). Le point culminant de leur travail est que les GNP pénètrent dans les cellules tumorales via l'endocytose médiée par les récepteurs des peptides RGD, puis pénètrent dans le noyau à l'aide des peptides NLS, ce qui fait que la DOX interfère efficacement avec la synthèse de l'ADN. Malheureusement, il fallait au moins 120 h en couplant des peptides ou des médicaments couche par couche sur les PNB, et chaque processus nécessitait au moins 24 h. De même, toutes les méthodes mentionnées ci-dessus ont rencontré des problèmes communs tels que des étapes multiples, un coût élevé, une préparation compliquée et un post-traitement. Il est donc nécessaire de développer une méthode simple et rapide de synthèse de nanomatériaux d'or multifonctionnels.

Dans cet article, nous avons présenté pour la première fois une stratégie en une étape pour préparer les PNB conjugués à la DOX sur la base de la constitution chimique de la DOX. De plus, nous avons présenté une méthode synthétique pratique pour préparer un vecteur de transport DOX multifonctionnel pour améliorer le fonctionnement de la DOX, qui peut être utilisé dans le diagnostic et le traitement des tumeurs. La principale différence entre notre travail et les autres est que nous utilisons les peptides DOX, RGD et NLS comme réactifs réducteurs et réactifs stabilisants pour fabriquer les GNP et faire conjuguer ces trois substances à la surface des GNP pour former des DRN-GNP en attendant. Nos travaux antérieurs [33,34,35] avaient prouvé que le RGD et d'autres peptides pouvaient être utilisés pour réduire les ions d'or afin de fabriquer des nanomatériaux d'or. Le N-terminal du NLS peut être modifié en utilisant la séquence cystéine cystéine tyrosine (CCY) pour construire CCYNLS, ce qui peut réduire les ions or tout en conservant l'effet de ciblage du NLS [36]. Nous avons également constaté que la DOX possède deux groupes hydroxyle phénoliques avec une forte réductibilité dans des conditions basiques [37, 38], de sorte qu'elle peut également réduire les ions d'or pour former les PNB. De plus, l'effet anti-tumoral de la DOX pourrait ne pas être influencé car elle s'intègre dans l'ADN par le groupe amino du carbone 7 et le groupe hydroxyle du carbone 9 [39]. En attendant, le soufre, l'oxygène et l'azote sur les peptides et la DOX peuvent être combinés avec les PNB pour maintenir la stabilité colloïdale [33]. Les résultats montrent que les DRN-GNP ont été fabriqués avec succès et ont bien fonctionné dans l'imagerie, le diagnostic et la thérapie des tumeurs (Schéma 1). À notre connaissance, il s'agit du premier rapport sur la synthèse de peptides DOX, RGD et NLS conjugués à des GNP multifonctionnels avec une méthode en une étape, et leur application dans le diagnostic et le traitement des tumeurs.

Illustration schématique de la synthèse des DRN-GNP, de la captation par les cellules Hela et du diagnostic tumoral des DRN-GNP

Matériaux et méthodes

Matériaux

HAuCl₄ 4H₂ O a été acheté auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, les peptides cycliques RGD (la séquence d'acides aminés est l'acide arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamique (c(RGDyE))) et l'hydroxyde de sodium étaient les mêmes que la réf. [35]. La doxorubicine a été achetée auprès de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Les peptides CCYNLS (la séquence d'acides aminés est cystéine-cystéine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine, CCYPPKKKRKV) China Peptides Co., Ltd (Shanghai, Chine). La lignée cellulaire Hela et la lignée cellulaire MCF-7 ont été fournies par Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Le sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) ont été achetés auprès de GibcoBRL Life Technologies. Le kit de test de prolifération et de cytotoxicité (MTT) a été acheté auprès de Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Synthèse des DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP

Pour la préparation des DOX-GNP, une solution de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) a été ajoutée dans la solution d'acide chloroaurique (0,86 mM, 1,0 mL) sous agitation magnétique, puis NaOH (2 M, 5 L) a été ajouté à ajuster le pH. Pour la préparation des NLS-GNP, une solution de peptides CCYNLS (0,5 mM, 1,0 ml) a été ajoutée dans la solution d'acide chloroaurique (3,44 mM, 1,0 ml) sous agitation magnétique, puis NaOH (2 M, 20 L) a été ajouté pour ajuster le pH . Pour la préparation des DR-GNP, une solution de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) et une solution de peptides RGD (1,0 mM, 1,0 mL) ont été ajoutées à la solution d'acide chloroaurique (1,72 mM, 2,0 mL) sous agitation magnétique, puis NaOH (2 M, 15 L) a été ajouté pour ajuster le pH. Pour la préparation des DN-GNP, une solution de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) et une solution de peptides CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) ont été ajoutées à la solution d'acide chloroaurique (1,72 mM, 2,0 mL) sous agitation magnétique, puis NaOH (2 M, 20 L) a été ajouté pour ajuster le pH. Pour la préparation des DRN-GNP, des solutions de DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL), de peptides CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) et de peptides RGD (1,0 mM, 1,0 mL) ont été ajoutées à la solution d'acide chloroaurique (1,72 mM, 3,0 ml) sous agitation magnétique, puis NaOH (2 M, 35 L) a été ajouté pour ajuster le pH. Toutes les réactions se sont poursuivies pendant 30 min à 100 °C dans un système de reflux et la valeur du pH était de 10-12. Tous les GNP ont été purifiés par centrifugation à 55 000 rpm pendant 30 min (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Après prélèvement du surnageant, les PNB ont été redispersés dans de l'eau ultrapure.

Caractérisation

Les caractérisations des spectres des PNB ont été mises en œuvre en utilisant un spectrophotomètre UV 3150 (Shimadzu, Japon), un spectromètre Nicolet Avatar FTIR modèle 330 (Thermo, America), et une spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) ESCALab250 avec les mêmes conditions analytiques comme réf. [35]. Les images au microscope électronique à transmission (MET) des PNB ont été obtenues à partir d'un MET (JEM-2100F, JEOL, Japon) fonctionnant à une tension d'accélération de 200 kV.

Diffusion dynamique de la lumière et mesures de potentiel zêta

Un analyseur de potentiel Zeta PALS Zeta (Brookhaven Instrument Corporation) a été utilisé pour mesurer les diffusions dynamiques de la lumière (DLS) des DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP et DRN-GNP, qui fonctionnaient à 90° angle avec un laser à solide (λ =670 nm) à température ambiante. Lorsqu'il était équipé d'une électrode AQ-827, l'analyseur a été utilisé pour mesurer les potentiels zêta des PNB.

Analyse ICP

L'analyse quantitative de l'Au dans les PNB était la même que celle de la réf. [35].

La stabilité des DR-GNP, DN-GNP et DRN-GNP dispersés dans une solution de PBS, HCl, NaOH, NaCl

Nous avons mélangé 100 L de PNB précipités et 500 L de solution à haute concentration de 0,2 M de PBS, 0,5 M de HCl, 0,5 M de NaOH et 1,0 M de solution de NaCl, respectivement. Douze heures plus tard, nous avons pris leurs photos et testé leurs spectres d'absorption UV.

Culture cellulaire

Les cellules Hela et MCF-7 ont été cultivées dans un incubateur (humidifié avec 5% de CO₂ air équilibré) à 37 °C pendant 24 h. Le milieu de culture était du DMEM avec 10 % de FBS. Le nombre de cellules vivantes est compté par un tableau de comptage de cellules.

Test de cytotoxicité des DOX et DRN-GNP libres

Les cellules Hela et MCF-7 en phase exponentielle ont été ajoutées aux puits de plaques 96 puits (environ 5 × 10 ³ cellules/puits) et incubées pendant 24 h, respectivement. Ensuite, les DRN-GNP de concentrations 0, 20, 40, 60, 80 et 100 g/mL (la concentration de DOX correspondante était de 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 et 39,0 g/mL) ont été incubés avec chaque puits et incubés pendant 24 h à 37 °C, respectivement. Le groupe témoin a été défini en ajoutant uniquement une solution tampon PBS et sa viabilité a été définie à 100 %. Le MTT (20 L, 5 mg/mL) a été ajouté à chaque puits et incubé à 37°C pendant environ 4 h. Ensuite, le milieu de culture a été soigneusement aspiré et 150 L de deux diméthylsulfoxydes ont été ajoutés dans chaque puits pendant 10 min jusqu'à ce que le cristal soit complètement dissous. Un lecteur de microplaques (Thermo Multiskan Mk3) a été utilisé pour mesurer la valeur de DO de chaque puits à 490 nm. Trois puits pour chaque groupe ont été préparés et les valeurs calculées ont été exprimées en moyenne ± S.D.

Expérience de cytométrie en flux

Les cellules Hela et MCF-7 en phase exponentielle ont été ajoutées à chaque puits de deux plaques de 12 puits (environ 5 × 10 ⁴ cellules/puits) et incubées pendant 24 h, respectivement. Ensuite, la solution de DRN-GNPs a été ajoutée dans chacun des puits (concentrations finales avec 0, 20, 40, 60, 80 et 100 g/mL) et incubée à 37 °C pendant 24 h, respectivement. Retirer le milieu de culture et ajouter une solution de Trypsine (contenant de l'EDTA) dans les puits pour digérer les cellules. Retirer ensuite la solution de Trypsine des puits, ajouter le milieu de culture dans les puits et transférer les cellules dans des tubes à centrifuger. Après centrifugation à 1000 g pendant 5 min, le surnageant a été retiré et les cellules de chaque tube ont été collectées et comptées dans une solution PBS. Environ 5 à 10 × 10 ⁴ des cellules ont été prises dans d'autres tubes de centrifugation et ont été centrifugées à nouveau à 1000 g pendant 5 min. Retrait du surnageant et ajout de 100 L de solution tampon AnnexinV dans les tubes. Ajouter 5 L d'AnnexinV-FITC et 5 L d'iodure de propidium dans les tubes et les mélanger doucement avec les cellules. Les tubes ont été incubés à température ambiante (20-25 °C) pendant 15 min dans l'obscurité, puis testés par un cytomètre en flux (BD Accuri C6).

Études d'imagerie optique par diffusion en champ sombre et de microscopie électronique à transmission sur la culture cellulaire

Les cellules Hela et MCF-7 ont été implantées sur la lame de culture cellulaire à 8 trous d'environ 7 × 10 ³ cellules pour chaque puits, respectivement. Les DRN-GNP ont été ajoutés dans chaque puits avec la concentration finale de 35 g/mL. Après avoir été incubés pendant 24 h, nous avons éliminé les PNB absorbés physiquement et librement en rinçant ces cellules avec une solution de PBS trois fois. Ensuite, nous les avons fixés avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min, recouverts de quelques gouttes de glycérol, et scellé ces lames de culture cellulaire à 8 trous avec une autre lamelle. Un microscope à fond noir (Zeiss Imager Z1) a été utilisé pour évaluer les cellules avec un grossissement x 200 et un mode réfléchissant. Le temps d'exposition pour les images en fond clair et en fond noir à une tension de 5 V était de 1 ms et 400 ms, respectivement.

Pour les études TEM, les cellules Hela et MCF-7 ont été incubées avec les DRN-GNP (35 g/mL) pendant 24 h dans un flacon de culture cellulaire, respectivement. Après avoir incubé et aspiré la solution mixte de milieu et de DRN-GNP, nous avons rincé les cellules avec une solution de PBS trois fois, puis les avons digérées avec de la trypsine. Les cellules ont été transférées dans un tube centrifuge avec un petit volume de milieu DMEM. Les cellules ont été centrifugées (1500 tr/min) pendant 10 min, le milieu DMEM a été aspiré avec précaution et la solution de glutaraldéhyde à 3% (généralement 40 fois le volume de matériaux) a été ajoutée avec précaution dans le tube pour fixer les cellules au fond du tube. tube pendant plus d'1 h. Les cellules ont été fixées davantage en ajoutant du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 1 h, déshydratées avec de l'éthanol, puis incluses dans du Spurr (Sigma-Aldrich Co., USA). Les cellules ont été sorties du tube, coupées en sections, colorées avec de l'acétate d'uranyle aqueux et du citrate de plomb, puis montées sur une grille en cuivre (300 mesh). Les spécimens ont été mesurés à l'aide d'un microscope électronique à transmission FEI TECNAI-12 (tension de travail 120 kV).

Expériences animales

Animaux

Des souris nude femelles athymiques ont été achetées au Centre d'expérimentation animale de la Southern Medical University (Guangzhou, Chine) pourr in vivo test de thérapie tumorale. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux règles de gestion des animaux du ministère de la Santé de la République populaire de Chine (document n° 55, 2001) et aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Université pharmaceutique de Chine.

Efficacité thérapeutique de la DOX libre et de ses conjugués chez les souris porteuses de tumeurs

Brièvement, 36 souris nude (âgées de 5 à 6 semaines, pesant 16 à 18 g) ont été réparties au hasard en six groupes. Ils ont été injectés par voie sous-cutanée de cellules Hela (5 × 10 ⁶ cellules en PBS) dans la fosse axillaire droite. Cinq jours plus tard, les souris du groupe témoin ont reçu une injection par la veine caudale d'une solution saline (0,154 mol/L, 0,2 mL). Des souris des groupes DOX, DR-GNP, DN-GNP et DRN-GNP libres ont également été injectées par la veine caudale. Afin de comparer l'efficacité anti-tumorale des DRN-GNP entre l'injection intraveineuse et l'injection tumorale, nous avons défini un groupe à injecter avec une quantité égale de DRN-GNP sur le site de la tumeur. Ces cinq groupes ont maintenu une dose de 0,3 mg/kg d'équivalent de DOX libre ou conjuguée chez chaque souris. Chaque souris a subi une injection dans la veine caudale ou dans la tumeur une fois par jour. Le poids corporel et le volume tumoral de chaque souris ont été contrôlés chaque jour pendant 14 jours. Pour étudier plus avant les effets thérapeutiques de DOX, DR-GNP, DN-GNP et DRN-GNP, les tumeurs des six groupes ont été excisées pour analyse pathologique après 14 jours de traitement. Les tumeurs et les organes internes du cœur, du foie, de la rate, des poumons et des reins des souris ont été isolés des souris, fixés avec du formol tamponné neutre à 10 % et inclus dans de la paraffine. Les tissus tumoraux tranchés ont été colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) et examinés au microscope optique Olympus.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP

Dans la synthèse des DOX-PNB, lorsque la solution de NaOH a été ajoutée à la solution mélangée de DOX et d'acide chloraurique, la couleur de la solution a immédiatement changé de l'orange au violet peu profond, elle est alors devenue rouge vin à 100 °C dans un système de reflux sous agitation magnétique en une minute, indiquant la formation des DOX-GNP. Le résultat a indiqué que la capacité de réduction de la DOX est très forte car la DOX possède deux groupes hydroxyle phénoliques (le carbone n° 6 et n° 11) avec une forte réductibilité dans des conditions basiques. La réaction s'est poursuivie pendant 30 min jusqu'à ce que la couleur ne change pas.

Afin d'éviter de confondre la couleur rouge orangé de la DOX et la couleur rouge vin des PNB, nous avons avancé davantage de preuves en caractérisant leurs spectres d'absorption UV (comme le montre la figure 1a). La DOX a un pic d'absorption caractéristique proche de 485 nm et un pic à 530 nm; cependant, le pic à 480 nm a disparu dans le spectre de la solution du produit et un pic caractéristique à 520 nm du pic d'absorption caractéristique de la résonance plasmonique de surface (SPR) des GNP est apparu. Même ainsi, la formation des PNB n'est toujours pas complètement déterminée entre les 520 nm des PNB et les 530 nm du pic de DOX. Compte tenu du fait que les PNB seront précipités par centrifugation à grande vitesse et que les molécules de DOX ne le seront pas, nous pouvons voir un précipité violet dans le produit du fond du tube à centrifuger (encadré de la Fig. 1a (3-4)) et DOX ne pas non plus (encadré de la Fig. 1a (1-2)).

un Spectres d'absorption UV-Visible de la DOX et des DOX-PNB tels que préparés, l'encart de (a ) sont les images de DOX (1, ​​2) et DOX-GNP (3, 4) avant (1, 3) et après centrifugation (2, 4). b Image MET de DOX–PNB. c Spectres FTIR de la DOX et des DOX-PNB tels que préparés. d Spectre XPS de DOX-PNB

La DOX a une fluorescence rouge sous l'irradiation d'une lumière ultraviolette de 365 nm ; cependant, la fluorescence de la DOX a disparu après la synthèse des PNB. Il y a deux raisons possibles; la première est que le coefficient d'extinction des PNB est très fort, ils ont tendance à éteindre la fluorescence des molécules lorsqu'elles sont proches de la surface des PNB (< 5 nm) [40]. Si la distance augmente jusqu'à 20 nm ou plus, le champ plasmonique des nanoparticules est trop éloigné pour éteindre leur signal de fluorescence [41]. L'autre raison est que le groupe fluorescent de la DOX a été détruit après avoir joué le rôle d'agent réducteur. Comme le montre la figure 1c, bien que le nombre de pics d'absorption infrarouge des DOX-PNB soit nettement inférieur à celui du DOX, de nombreuses caractéristiques du DOX ont toujours été conservées, telles que les pics d'absorption IR caractéristiques à 2910 cm ⁻¹ (C-H, vibration d'étirement) [42], 1631 cm ⁻¹ (vibration d'étirement du carbonyle) [43], 1114 cm ⁻¹ (vibrations d'étirement C-O, C-N) [44] et 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, vibration de flexion hors du plan) [45], respectivement. Ces pics représentatifs de la DOX ont également été affichés dans les spectres des DOX-GNP, indiquant que la DOX s'est liée avec succès aux DOX-GNP. Fait intéressant, le pic à 1214 cm ⁻¹ le pic caractéristique de la vibration d'étirement C-O du groupe hydroxyle phénolique [46] a disparu dans les spectres des DOX-GNP. Le groupe phénolique peut réduire les ions Au en PNB, puis il a été transporté vers le groupe carbonyle. Nous supposons que l'effet de la DOX n'est pas affecté, car il s'intègre dans l'ADN par le groupe amino du carbone 7 et le groupe hydroxyle du carbone 9 [39].

Nous pouvons observer que la taille des particules des DOX-GNP est d'environ 6 nm à partir des résultats MET (Fig. 1b). Le rapport calculé de Au (I) était de 31,93 % à partir du spectre XPS des DOX-GNP (Fig. 1d), ce qui est suffisamment élevé pour maintenir la stabilité du colloïde. Cependant, lorsque le dépôt de DOX-GNP s'est dispersé dans une solution tampon PBS 0,2 M avec centrifugation à grande vitesse après élimination du surnageant, la couleur de cette solution est devenue noir violet et il y avait un floc insoluble visible. Il a indiqué que la stabilité des DOX-PNB n'était pas très bonne dans l'environnement de la concentration élevée en sel. On peut expliquer que DOX ne possède qu'un seul groupe amino mais ne possède pas de groupe sulfhydryle, ce qui n'est pas suffisant pour que DOX relie la surface des PNB via les liaisons Au-S et Au-N. Des efforts supplémentaires sont donc nécessaires si les DOX-GNP sont utilisés comme agent de contraste et matériau anti-tumoral pour l'imagerie et le traitement des tumeurs.

Nous avons synthétisé des DRN-GNP avec DOX, les peptides RGD et les peptides NLS comme agents réducteurs et stabilisants. Les peptides RGD peuvent cibler spécifiquement certaines cellules tumorales surexprimées le α_{v 3} integrain, et les peptides NLS peuvent cibler spécifiquement le noyau. La figure 2a montre les spectres UV-Vis des DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP fabriqués ; les caractéristiques de leur pic d'absorption des plasmons de surface étaient de 520 à 530 nm [33]. On peut également voir dans l'encart que les PNB ont montré une couleur de vin rouge vif. Les images MET (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1) montrent que la taille des particules des NLS-GNP et des DRN-GNP était d'environ 10 nm et 5 nm, et que les GNP sont distribués uniformément, aucune coagulation évidente n'a été trouvée.

un Les spectres d'absorption UV-Visible et les images photographiques des DOX-PNB (a ), NLS-PNB (b ) et DRN-PNB (c ). b Spectres d'absorption UV-Visible de la DOX basique, des peptides RGD, des peptides NLS et du surnageant des DRN-GNP. c Spectres FTIR des peptides NLS, NLS-GNP et DRN-GNP. La distance entre le spectre des GNP et le spectre des peptides NLS est nettement agrandie pour le contraste

Afin de valider la synthèse des NLS-GNP et des DRN-GNP, nous avons caractérisé les spectres FTIR des peptides NLS et des GNP sur la figure 2c. Certains pics FTIR de peptides NLS ont été trouvés dans les spectres des NLS-GNP et DRN-GNP, tels que le pic d'absorption des vibrations d'étirement C-H (2840-2972 cm ⁻¹ ) [47], C=O pic d'absorption des vibrations d'étirement (1630–1700 cm ⁻¹ ) [48], et =C-H pic de vibration de flexion dans le plan (1300–1475 cm ⁻¹ ) [49] ; il a indiqué que les peptides CCYNLS ont été conjugués avec succès à la surface des GNP. Nous avons également constaté que le pic de vibration du squelette benzénique de la tyrosine terminale dans le peptide NLS à 1529 cm ⁻¹ et le pic de vibration d'étirement de l'hydroxyle phénolique C-O à 1193 cm ⁻¹ [49] ont disparu dans les spectres infrarouges des NLS-GNP et DRN-GNP, cela signifie que le squelette benzénique de la tyrosine terminale a été transporté dans une structure quinone après avoir joué son rôle d'agent réducteur.

Nous centrifugons les DRN-GNP à grande vitesse, collectons le liquide surnageant, qui était presque incolore, puis testons s'il restait des réactifs via les spectres UV-Vis de la figure 2b. Les pics d'absorption UV des peptides RGD et NLS sont dérivés de résidus tyrosine, le pic d'absorption était situé à 275 nm. Cependant, le groupe hydroxyle phénolique est devenu des ions oxygène négatifs dans des conditions alcalines, ce qui augmente la densité électronique du cycle benzénique, le pic était décalé vers le rouge à 292 nm. Nous n'avons pas vu le pic caractéristique dans le spectre UV-Vis du surnageant des DRN-GNP, ce qui signifie que les deux peptides ont participé à la réaction. La DOX possède trois pics d'absorption dans la plage de 450 à 600 nm, mais le surnageant des DRN-GNP n'a pas ces pics. En plus de cela, aucune DOX n'a ​​été trouvée dans le surnageant des DRN-GNP car sa couleur était marron clair mais la couleur de la DOX dans des conditions basiques était violet clair transparent. On peut conclure que les trois matériaux réagissent presque complètement. De même, les DR-GNPs et DN-GNPs sont également expliqués de cette manière, voir Fichier supplémentaire 1 :Figure S2.

Nous avons utilisé la spectroscopie XPS pour examiner la valence de Au pour les NLS-GNP et DRN-GNP. Comme le montrent les figures 3a, b, deux pics avec des énergies de liaison d'environ 83,6 eV et 87,0 eV sont cohérents avec l'émission de photoélectrons Au 4f7/2 et 4f 5/2 [33]. Leur position énergétique de liaison Au 4f7/2 des deux GNP est de près de 84,0 eV. Pour les NLS-GNPs, il peut être déconvolué en Au (0) (83,5 eV) et Au (I) (84,1 eV), leur rapport de surface de pic est respectivement de 57% et 43%. De même, pour les DRN-PNB, il peut être déconvolué en Au (0) (83,6 eV) et Au (I) (84,4 eV), les rapports de surface de pic sont respectivement de 62 % et 38 %, ils ont donc une proportion plus élevée de Au (I). La charge peut former des complexes Au (I)-S, qui aident à maintenir la stabilité colloïdale des PNB. Fait intéressant, nous avons identifié trois types de S dans les spectres XPS des NLS-GNP, DN-GNP et DRN-GNP dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S3. Les courbes bleues et noires représentent les états d'oxydation du soufre, les courbes violettes représentent la liaison S-H et la courbe verte représente la liaison Au-S. La formation de la liaison Au-S a illustré que les peptides NLS ont été conjugués avec succès à la surface de ces trois GNP.

Spectre XPS de l'Au 4f du (a ) NLS-PNB, (b ) DRN-PNB. L'énergie de liaison Au 4f7/2 des spectres d'origine (noir) et des résultats ajustés (rouge) pourrait être déconvoluée en deux composantes, la courbe Au(0)-bleu et la courbe Au(I)-violet. Spectres d'absorption UV-Visible et images de DRN-PNB dispersés dans PBS, NaCl, NaOH et HCl, respectivement (c ).

De plus, les pics de N 1, C 1 et O 1 des spectres XPS ont démontré que les peptides et la DOX étaient attachés aux GNP (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4).

Les spectres XRD (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5) ont montré que la structure cristalline de ces PNB est une structure cristalline cubique à face centrée, car tous leurs spectres XRD contenaient quatre pics à 38,2°, 44,5°, 64,7° et 77,8° correspondant aux plans (111), (200), (220) et (311) [33].

Stabilité des DRN-PNB

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les données de potentiel zêta de ces cinq PNB ont été affichées dans le tableau 1 ; leur taille hydrodynamique est plus grande que celle caractérisée par la MET, ce qui peut être attribué à une certaine quantité de molécules hydratées autour du noyau des PNB hydrosolubles. Leurs potentiels zêta étaient négatifs à cause du groupe carboxyle conjugué à la surface des PNB. La solution de GNPs montre une bonne stabilité colloïdale lorsque la valeur absolue du potentiel zêta est supérieure à 30 mV; plus la valeur absolue est élevée, meilleure est la stabilité. On peut voir qu'ils possèdent tous une bonne stabilité colloïdale à partir du tableau 1. En comparaison, la valeur du potentiel zêta des NLS-GNP était la plus élevée, peut-être parce que leur surface est pleine de peptides NLS qui peuvent former une forte liaison Au-S via le groupe thiol. La valeur absolue du potentiel zêta des DOX-GNP était proche de 30 mV ; il était cohérent avec ce qui a été mentionné précédemment que les DOX-GNP n'étaient pas très stables lorsqu'ils étaient dispersés dans une solution tampon PBS. Les données des spectres ont été affichées dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S6.

Les changements des bandes de résonance plasmonique de surface (SPR) caractéristiques des PNB peuvent être utilisés pour déterminer l'agrégation des PNB en utilisant la spectrométrie UV-Vis [49]. Nous avons mesuré leurs spectres UV-Vis et pris les photographies des DRN-GNP (Fig. 3c) lorsqu'ils étaient dispersés dans une haute teneur en sel (1 M NaCl et 0,2 M PBS), un acide fort (0,5 M HCl) et une base forte ( 0,5 M de NaOH). Aucun changement de couleur de la solution ni changement de spectre UV-vis n'a été observé dans diverses conditions difficiles, sauf dans la solution de HCl, dans laquelle leur couleur est devenue légèrement violette et le pic d'absorption ultraviolette se déplace vers le rouge d'environ 20 nm, ce qui signifie que les PNB ont légèrement coagulé dans des conditions d'acide fort. . La raison pourrait être que la stabilité colloïdale des PNB chargés négativement a été affectée dans des conditions fortement acides, mais elle n'a pas été influencée dans le tampon PBS neutre et l'environnement alcalin. Nous pouvons conclure que les DRN-GNP sont très stables dans des conditions riches en sel et alcalines, ce qui indique que nos DRN-GNP synthétisés devaient être utilisés pour l'imagerie cellulaire in vitro et la thérapie antitumorale in vivo.

Imagerie plasmonique de diffusion en champ sombre des cellules tumorales et microscopie TEM cellulaire

Pour l'imagerie ciblée spécifique des cellules tumorales avec les DRN-GNP, nous avons sélectionné les cellules Hela comme groupe test et les cellules MCF-7 comme groupe témoin. La raison en est que les cellules Hela surexpriment l'intégrine _{v 3} [50] mais pas les cellules MCF-7, il n'a donc pas de liaison spécifique de RGD; c'est un bon groupe témoin [51]. L'absorption des DRN-GNP par ces deux lignées cellulaires après incubation pendant 24 h avec une concentration finale de 35 g/mL a été évaluée par une microscopie à fluorescence verticale dans le modèle à fond noir. Les cellules traitées sans GNP ne présentent pas de diffusion de la lumière plasmonique (Fig. 4 cellules A-Hela, cellules 5C-MCF-7). Les images de cellules Hela traitées avec les DRN-GNP montrent que les signaux de diffusion des GNP sont fortement localisés au niveau du noyau (Figs. 4b et 5e). However, we could hardly see the scattering light from the MCF-7 cells after they were incubated with the DRN-GNPs, even though little amount of GNPs might have entered the tumor cells through the tumor cells’ passive enhanced permeation and retention effect (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

un Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). b The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)

Conclusion

In this study, we have successfully developed a one-step method to prepare the multifunctional DRN-GNPs in about half an hour. The GNPs have also been successfully applied to the tumor targeted imaging and tumor therapy both in vitro and in vivo. The success shows that it is possible to make a fully use of the reducing and stabilizing ability of the DOX, RGD peptides, and CCYNLS peptides, which will make the GNPs’ synthesis process simple and efficient. More importantly, the one-step synthesized DRN-GNPs still possess good colloidal stability in the physiological system, and the peptides conjugated on the surface remained the targeted ability and DOX still possesses its anti-tumor ability. To our knowledge, this is the first report for synthesis of DOX, RGD and CCYNLS peptides conjugated multifunctional GNPs with a one-step method, and their application in tumor imaging, diagnosis, and therapy. This strategy is in line with the development direction of green chemistry, and it would lay the foundation for large-scale applications within the near future. We expect that our report will provide a new way for the one-step synthesis of multifunctional nanomaterials used for tumor imaging and therapy.

Disponibilité des données et des matériaux

Tous les ensembles de données sont présentés dans le document principal ou dans les fichiers de support supplémentaires.

Abréviations

CCYNLS peptides:

The sequence of amino acid is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine

Cyclic RGD peptides:

The sequence of amino acid is arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid

DOX :

Doxorubicine

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs:DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs:DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Nanoparticules d'or