Imagerie et thérapie par ultrasons ciblées des tumeurs ovariennes par nanoparticules protéiques PFP sensibles au pH

Résumé

Dans cette étude, nous développons un agent thérapeutique multifonctionnel par ultrasons (US) encapsulant le perfluoropentane (PFP) dans la férritine (FRT) et conjuguant la molécule de ciblage tumoral acide folique (FA) (FA-FRT-PFP). Les FA-FRT-PFP préparés ont un diamètre moyen de 42,8 ± 2,5 nm, un potentiel zêta de −41,1 ± 1,7 mV et montrent une bonne stabilité en solution physiologique et à température. La FRT est une protéine cage sensible au pH qui, à pH 5,0, se désassemble pour former des pores chargeant le PFP. L'ajustement au pH neutre referme les pores et encapsule le PFP dans la FRT pour former des nanoparticules. À pH 5,0, 3 min d'ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU, 2 W/cm²) augmentent significativement le signal US des FA-FRT-PFP par vaporisation acoustique de gouttelettes (ADV). Dans les mêmes conditions, 4 min d'irradiation LIFU font éclater les bulles générées par FA-FRT-PFP. Les FA-FRT-PFP ciblent efficacement les cellules cancéreuses ovariennes et augmentent significativement le contraste US après 3 min LIFU. Après 4 min LIFU, la viabilité cellulaire diminue significativement par nécrose, probablement due à la libération médiatisée par FA-FRT-PFP du PFP dans l'environnement acide des lysosomes après entrée dans les cellules tumorales. Le PFP se transforme en bulles qui éclatent sous LIFU, formant des ondes de choc physiques détruisant la structure cellulaire et causant la nécrose, réalisant le traitement tumorel. Ensemble, cela démontre que FA-FRT-PFP est un agent thérapeutique US nouveau et prometteur pour application clinique future.

Introduction

Le cancer de l'ovaire est l'un des cancers féminins les plus mortels au monde. Le traitement reste cliniquement dépendant de radiothérapie, chimiothérapie, chirurgie et thérapies auxiliaires. Cependant, les lacunes de ces stratégies entravent l'amélioration des taux de survie. Pour les surmonter, des méthodes diagnostiques plus efficaces et sûres sont requises. Ces dernières années, l'intégration imagerie/thérapeutique en une plateforme unique est devenue un sujet brûlant.

La technologie ultrasons (US), non-invasive, non-irradiante, peu coûteuse et spécifique, est largement utilisée en diagnostic clinique et traitement tumoral. Ces dernières décennies, une plateforme de réponse acoustique (ARP) avec capacités imagerie/thérapeutique US a été développée pour diagnostic/traitement tumoral efficace. L'ARP inclut principalement microbulles/nanobulles (MB/NB) et plateformes nanoparticules (NP). MB/NB montrent bonnes capacités réponse acoustique, mais taille grande = pénétration tissulaire in vivo faible, stabilité échantillon médiocre. NP : perméabilité tissulaire plus forte, cycle pharmacocinétique plus long (taille petite). Cependant, capacités réponse acoustique NP limitées. Urgent de concevoir ARP petite taille, haute stabilité, forte réactivité.

Les fluorocarbures liquides subissent transition phase liquide-gaz sous stimulation externe. Natalya et collègues ont développé une nanoémulsion contenant fluorocarbone liquide produisant effets ADV sous LIFU. Émulsions formaient bulles et déclenchaient libération médicament, permettant traitement tumoral. Cependant, couche matériau d'étanchéité autour fluorocarbone liquide augmentait intensité/temps ultrasons requis, endommageant tissus sains environnants. Optimisation porteur fluorocarbone liquide nécessaire.

Dans cette étude, nous développons nanoparticule férritine (FRT) chargée fluorocarbone liquide perfluoropentane (PFP) combinée molécule cible tumorale acide folique (FA) → FA-FRT-PFP. Férritine : nanocage protéique endogène hautement biocompatible, sensible au pH. Protéine se désassemble environnement acide, se réassemble environnement alcalin. Permet chargement/libération contrôlés FRT réponse changements pH. PFP : matériau transformation de phase fréquent, température ébullition 29 °C. Basse température ébullition = transformation de phase facile par LIFU (plus sûr que HIFU). PFP chargé dans férritine → FA-FRT-PFP diamètre ~47,3 ± 2,8 nm, haute stabilité solutions physiologiques/températures. Avantages FA-FRT-PFP : (1) PFP chargé facilement dans FRT par changement pH acide→neutre ; (2) sous LIFU (2 W/cm², 3 min) et pH=5,0, FA-FRT-PFP libère PFP, transformation phase, renforce signaux US par ADV ; (3) sous LIFU long terme (4 min) et pH=5,0, PFP libéré explose, onde choc physique détruit cellules tumorales par nécrose. Première fois, à notre connaissance, chargement PFP dans FRT comme thérapeutique US tumoral. Résultats : FA-FRT-PFP + LIFU = nouvelle stratégie diagnostic/traitement tumoral intégré.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

Gel agarose, férritine (FRT), acide folique (FA), perfluoropentane (C₃F₈, PFP) : Sigma (St. Louis, MO, USA). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA, NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH : Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd (Chine). EDC, NHS : Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Kit CCK-8 : Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japon). DMEM, PBS, pénicilline-streptomycine, trypsine-EDTA, sérum fœtal bovin (FBS) : Gibco (Grand Island, NY, USA).

Culture Cellulaire

Ligne cellulaire cancer ovarien humain SK-OV-3 : Shanghai Institute of Cell Biology, Académie chinoise des sciences. Cellules épithéliales ovariennes normales HUM-CELL-0088 : PriCells, Wuhan, Chine. Culture DMEM 10% FBS, 1% pénicilline-streptomycine. Incubateur 5% CO₂, 37 °C.

Préparation FA-FRT-PFP

Étape 1 : Conjugaison FA-FRT par réaction estérification. NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (10 mg) + solution FRT + EDC (5 mg/mL) + NHS (20 mg/mL). Réaction 3 h température ambiante agitation légère. Purification dialyse eau distillée (seuil 1,2 kDa) 24 h → nanoparticules FA-FRT. Étape 2 : Chargement PFP dans cavité FRT par dénaturation/renaturation protéine. FA-FRT dilué 5 mL PBS 2 mg/mL, pH=5,0 ajusté 30 min agitation légère température ambiante → dissociation complète FRT. 500 µL PFP ajouté bain glace, sonication pulsée 5 s marche/5 s pause 5 min total 80 W bain glace. pH ajusté neutre (7,4). PFP état huile insoluble eau → excès PFP éliminé séparation liquide → FA-FRT-PFP. FRT-PFP préparé méthode similaire (NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH au lieu FA).

Caractérisation FA-FRT-PFP

Tailles/potentiels zêta : Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). Morphologie : MET (Hitachi, Japon), microscopie fluorescence inversée (Olympus, Japon). Structure chimique : spectroscopie infrarouge Fourier (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Allemagne). Prise cellulaire : microscopie confocale balayage laser (LEXT OLS4100, Olympus, Japon). Cellules double-marquage FITC/PI : cytométrie flux (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

Performance Génération Gaz Réponsive pH/Ultrasons

FA-FRT-PFP pH=5,0 et 7,5 irradiés différentes intensités acoustiques LIFU (1,5 et 2,0 W/cm²) et temps totaux (1, 2, 3, 4 min) modèle gel agarose, images US observées équipement US (Esaote Mylab 90, Italie) fréquence 5-12 MHz, indice mécanique (MI) 0,06. Apparence FA-FRT-PFP observée microscopie optique dans le temps. Intensité US région intérêt image analysée logiciel ImageJ.

Prise Cellulaire

1 mg FITC dissous 1 mL DMSO, mélangé FRT-PFP et FA-FRT-PFP 30 min agitation légère. Dialyse nuit eau déionisée élimination FITC/DMSO libres → nanoparticules marquées FITC. SK-OV-3 et cellules ovariennes normales (HUM-CELL-0088) cultivées 24 h, puis FITC libre, FITC-FRT-PFP, FITC-FA-FRT-PFP co-incubés SK-OV-3 5 h. De plus, FITC-FA-FRT-PFP incubé SK-OV-3 prétraités FA 5 h. Lavage 3× PBS, fixation 4% paraformaldéhyde, coloration 0,2 mg/mL DAPI 10 min. Imagerie microscopie confocale balayage laser. Signal fluorescence quantifié cytomètre flux.

Imagerie Ultrasons In Vitro

SK-OV-3 cultivées 24 h milieu sans FA, puis PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA incubés SK-OV-3 6 h. Cellules collectées, mélangées gel agarose, irradiées avec/sans LIFU 3 min (1 s marche/1 s pause total 3 min ; 1 MHz ; 2,0 W/cm²). Images US capturées.

Efficacité Anticancéreuse In Vitro

SK-OV-3 semées plaque 96 puits 1×10⁴ cellules/puits, adhésion 24 h. Cytotoxicité FA-FRT : concentrations 0, 20, 40, 100, 200, 500 µg/mL FA-FRT cultivées SK-OV-3. 24 h traitement, milieu DMEM 10% CCK-8 20 min incubateur. Absorbance 450 nm lecteur plaque multimode (Thermo Scientific) → viabilité cellulaire. De plus, SK-OV-3 et cellules ovariennes normales traitées PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 3 h, puis irradiées LIFU (1 s pause 1 s total 4 min ; 1 MHz ; 2,0 W/cm²). Cellules traitées incubées 21 h supplémentaires. Témoin : sans LIFU, cellules traitées PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 24 h. Viabilité détectée CCK-8.

Analyse Mort Cellulaire

Évaluation type mort cellulaire : SK-OV-3 semées plaques 6 puits 5×10⁴ cellules/mL. 24 h, traitement PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 3 h, puis irradiation LIFU (1 s pause 1 s total 4 min ; 1 MHz ; 2,0 W/cm²). Incubation 23 h supplémentaires. Témoin : sans LIFU, traitement 24 h. Trypsinisation, centrifugation 1500×g 3 min, lavage 3× PBS glace, resuspension 200 mL tampon liaison. 5 µL annexine V-FITC + 10 µL PI ajoutés, incubation 15 min obscurité. Cellules colorées analysées cytomètre flux.

Western Blot

Selon littérature antérieure. Cellules traitées 40 µg/mL PBS (témoin), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP avec/sans irradiation LIFU (2,0 W/cm², 4 min) + 21 h incubation. Lysat tampon RIPA (Sigma). 50 µg protéines + tampon Laemmli bouillis 5 min, SDS-PAGE. Transfert membrane PVDF (Bio-Rad) Trans-Blot semi-sec (Bio-Rad). Blocs incubés 1 h température ambiante TBS tampon blocage 2% lait ou 2% BSA (anticorps phospho-spécifiques). Anticorps primaires dilués TBST (0,1% Tween20, 2% BSA) nuit 4 °C. Lavage, anticorps secondaires (Santa Cruz) TBST, détection SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo).

Analyse Statistique

Données : moyenne ± écart-type. Analyses : test t Student. *P<0,05, **P<0,01 significatifs.

Résultats et Discussion

Préparation et Caractérisation FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP synthétisé pour thérapie tumorale (Figure 1). Gouttelettes transformation phase chargées dans FRT par désassemblage/réassemblage réversible pH-induit. PFP avec LIFU-ADV délivré dans cellules = agent imagerie US. Figures 2a-c : images MET FRT, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, morphologie sphérique. Tailles moyennes : FRT 6,9 ± 0,3 nm, FRT-PFP 43,8 ± 1,6 nm, FA-FRT-PFP 47,3 ± 2,8 nm (Fig 2d) : chargement PFP et conjugaison FA augmentent taille FRT. Potentiels zêta moyens : FRT −43,2 ± 3,1 mV, FRT-PFP −46,9 ± 2,2 mV, FA-FRT-PFP −41,5 ± 2,7 mV (Fig 2e). Conjugaison FA-FRT caractérisée FT-IR (Fichier supplémentaire 1: Figure S1). Pics absorption ~1110 cm⁻¹ (liaison éther C-O-C PEG), ~1601 et ~1710 cm⁻¹ (C=O PEG/FRT, -COOH/-CONH₂ FA/FRT), ~2820, ~2920, ~2950 cm⁻¹ (étirement C-H asymétrique/symétrique -CH₂ FA/PEG), ~1440 cm⁻¹ (cycle phényl FA). Confirmation conjugaison FA-FRT. Sur 28 jours stockage, taille et PDI FA-FRT-PFP dans eau, PBS, sérum physiologique, FBS sans changement significatif (Fig 3a,b) : excellente stabilité. Figure 3c : changement taille FA-FRT-PFP températures 25-45 °C. Taille quasi inchangée 25-40 °C : haute stabilité <40 °C. À 45 °C, taille 42,1→6 nm : PFP gazéification sévère → rupture nanoparticules. Température gazéification FA-FRT-PFP augmentée 29 °C (PFP pression normale) → 45 °C : coquille FRT protectrice.

Amélioration US Réponsive pH et LIFU

Expériences fantôme US FA-FRT-PFP différents pH/intensités LIFU. Figure 4a : sans LIFU (pré), signal US faible tous groupes. pH 7,5 après 3 min LIFU : signal faible 1,5 et 2,0 W/cm². pH=5,0 même temps LIFU : signal US plus fort. FA-FRT-PFP montre effets ADV temps/intensité-dépendants. Cause : pH=5,0 → désassemblage FA-FRT-PFP → libération PFP → transformation phase facilitée. Intéressant : LIFU 4 min, pH=5,0, 2,0 W/cm² → signal US plus faible vs temps inférieur : LIFU trop fort → rupture bulles. Résultats : FA-FRT-PFP libère PFP, transformation phase et explosion à 2,0 W/cm² LIFU pH=5,0. Intensités US Figure 4b,c. Figures 4d-g : morphologie solutions FA-FRT-PFP après 3 min LIFU (2,0 W/cm²) pH=7,5 et 5,0. pH=5,0 + 2,0 W/cm² LIFU → grosses bulles, validant résultats.

Prise Cellulaire

Figure 5 : capacité prise cellulaire FA-FRT-PFP. Cellules FITC libre : fluorescence négligeable. Marquage FA-FRT-PFP : fort signal fluorescence = forte capacité prise cellulaire. Cellules FRT-PFP et FA-FRT-PFP prétraitées FA : fluorescence FITC plus faible. FA améliore ciblage actif nanoparticules. De plus, FA-FRT-PFP comportement prise comparable FCM (Fig 5c,d). Taux prise FA-FRT-PFP 46,5 ± 2,8% > significativement FITC libre (témoin), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA. Fichier supplémentaire 1: Figure S2 : prise nanoparticules cellules ovariennes normales. Pas différences significatives FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP. Cause probable : cellules ovariennes normales (HUM-CELL-0088) faible expression récepteur FA vs SK-OV-3.

Imagerie Ultrasons In Vitro

Confirmation FA-FRT-PFP améliore imagerie US par ADV in vitro : nanoparticules incubées cellules 5 h, irradiées avec/sans LIFU (2,0 W/cm²). Figure 6a : sans LIFU, tous groupes signal US non renforcé. Avec LIFU, cellules FA-FRT-PFP : intensités US élevées vs groupes témoins FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA. Analyse quantitative valeurs niveaux gris ImageJ. Résultats cohérents données imagerie US (Fig 6b) : intensité US cellules FA-FRT-PFP renforcée après irradiation LIFU 2,0 W/cm² 3 min. FA-FRT-PFP entre cellules, environnement acide lysosomes (pH~5,0) → désassemblage, libération PFP cytoplasme. LIFU → PFP transformation phase gouttelettes→gaz → intensité US augmentée.

Efficacité Anticancéreuse In Vitro et Analyse Mort Cellulaire

Figure 7a : cytotoxicité FA-FRT-PFP concentrations jusqu'à 0,5 mg/mL. Sans LIFU, pas suppression viabilité évidente SK-OV-3. CCK-8 analyse efficacité anticancéreuse FA-FRT-PFP + LIFU. Figure 7b : sans LIFU, FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP : pas cytotoxicité remarquable vs témoins. Avec 4 min LIFU, FA-FRT-PFP cytotoxicité significative > FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, pic inhibition ~90% à 40 µg/mL. Cause : FA-FRT-PFP prise plus aisée cytoplasme puis lysosomes vs FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA. Environnement acide lysosomes → libération PFP cytoplasme. 4 min LIFU → PFP gazéification, cavitation, rupture → forces choc physiques → effets tueurs tumeurs renforcés. Fichier supplémentaire 1: Figure S3 : cytotoxicité nanoparticules cellules ovariennes normales. Pas différences significatives groupes avec LIFU. Cause : HUM-CELL-0088 faible expression récepteur FA = pas effet ciblage FA.

Figure 8a,b : sans LIFU, mort cellulaire minime tous groupes. 4 min LIFU : cellules FA-FRT-PFP nécrose significative (~91,6%) vs autres groupes par ondes choc physiques générées cavitation/éclatement bulles induites LIFU-PFP. Fichier supplémentaire 1: Figure S4 : niveau expression protéine TNF. Sans LIFU : TNF à peine exprimé. Avec LIFU : groupe FA-FRT-PFP haut niveau TNF vs FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA = TNF protéine vitale mort induite FA-FRT-PFP+LIFU. Basé excellents effets thérapie cancéreuse in vitro, FA-FRT-PFP prometteur future thérapie cancéreuse in vivo.

Conclusion

En résumé, nous avons développé avec succès des nanoparticules à transformation de phase basées FRT, chargées PFP, modifiées molécule cible FA (FA-FRT-PFP). En tant que thérapeutique US ciblée nouvelle, FA-FRT-PFP présente multiples avantages : (1) taille nanoparticulaire ; (2) FRT porteur : désassemblage/réassemblage charge/libère gouttelettes PFP conditions acides/neutres ; (3) sous 3 min LIFU assistance conditions acides, FA-FRT-PFP libère PFP, transformation phase ADV → augmente significativement contraste US ; (4) sous 4 min irradiation LIFU environnement acide, PFP libéré induit facilement « effet explosion » intracellulaire → caractéristiques antitumorales physiques. Résultats démontrent FA-FRT-PFP + assistance LIFU = nouvelle stratégie imagerie moléculaire US et thérapie tumorale.