Nanocomplexes fonctionnels d'oxyde de graphène modifié par du folate/siARN de PEI pour la thérapie génique ciblée du cancer de l'ovaire

Introduction

Le cancer de l'ovaire est la principale cause de décès gynécologique dans le monde et est généralement associé à de mauvais résultats cliniques en raison des difficultés de diagnostic et de traitement précoces [1,2,3]. Malheureusement, les agents chimiothérapeutiques conventionnels présentent des limitations inhérentes telles qu'une distribution non spécifique, une faible biodisponibilité, une clairance sanguine rapide et une faible solubilité dans les environnements physiologiques [4]. Au cours des dernières décennies, la thérapie génique a été étudiée comme une approche potentielle pour le traitement de divers troubles génétiques, y compris les cancers [5,6,7,8]. Cependant, l'absence d'un transporteur de gène sûr, hautement efficace et sélectif a entravé son avancement vers l'utilité clinique. Actuellement, il existe deux catégories de vecteurs de gènes :les vecteurs viraux et non viraux. Bien que les vecteurs viraux aient montré une efficacité de transfection élevée, plusieurs inconvénients limitent leur application clinique, par exemple, des réactions inflammatoires immunitaires sévères et le risque de recombinaison avec des virus de type sauvage [9, 10]. En revanche, les vecteurs non viraux ont une capacité de livraison étendue, une faible immunogénicité et une flexibilité structurelle, ce qui en fait d'excellentes alternatives aux vecteurs viraux [11,12,13]. Avec le développement rapide de la nanotechnologie, de nombreuses nanoparticules ont été explorées pour une utilisation potentielle comme vecteurs de délivrance de gènes [14, 15]. Ici, ce travail avait conçu un nouveau vecteur non viral PEG-GO-PEI-FA qui peut être délivré efficacement aux tissus tumoraux.

L'oxyde de graphène (GO) est le dérivé du graphite qui est produit par l'oxydation en plusieurs étapes, les ultrasons et la purification du graphite [16]. La surface GO contient des groupes époxy, hydroxyle et carboxyle [17]. Les fonctions oxygène à sa surface confèrent à GO une excellente biocompatibilité qui lui permet de former une suspension stable dans l'eau et les solvants organiques, facilitant les modifications chimiques et la fonctionnalisation [18, 19]. Ainsi, GO a été largement utilisé pour la thérapie photothermique du cancer, l'administration de médicaments et de gènes et les biocapteurs [20,21,22]. Le polyéthylène glycol (PEG) est un matériau sûr, non toxique et biodégradable; il a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis en tant que transporteur de médicaments hydrophile [23]. La fonctionnalisation GO avec PEG peut améliorer la stabilité dans des conditions physiologiques, prolonger le temps de cycle du nanomatériau GO dans le corps et améliorer la pharmacocinétique du nanomatériau GO pour un meilleur ciblage tumoral [24, 25]. La polyéthylèneimine (PEI) est devenue l'étalon-or des vecteurs non viraux en raison de son efficacité élevée de transfection dans diverses lignées cellulaires [26]. Cependant, le PEI présente une cytotoxicité sévère et une faible biocompatibilité, limitant ainsi ses applications cliniques. Dans cette étude, nous avons observé une diminution significative de la cytotoxicité lorsque PEI a été greffé à la surface de GO. Le récepteur du folate est surexprimé à la surface de diverses cellules cancéreuses, en particulier dans les cellules cancéreuses de l'ovaire avant et après la chimiothérapie [27]. Pour l'administration ciblée de gènes, des molécules d'acide folique ont été liées de manière covalente avec GO pour cibler les récepteurs de folate.

Dans l'ensemble, l'objectif principal de la présente étude était d'explorer un nouveau système d'administration de gènes à base de GO ciblant pour augmenter l'utilité de la thérapie génique à base d'ARNsi pour le cancer de l'ovaire. Le PEG-GO-PEI-FA chargé positivement obtenu pourrait être chargé avec un ARNsi pour la délivrance de gènes. Sa synthèse réussie, sa caractérisation, son internalisation cellulaire efficace et son effet anticancéreux in vitro ont été analysés à l'aide de diverses techniques. En outre, la sécurité de ce système a également été évaluée in vitro.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'oxyde de graphène a été obtenu auprès de Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, Chine). Acide folique (AF), N -hydroxysuccinimide (NHS) et l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ont été achetés auprès de Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Le PEI 25K ramifié, le PEG (PM =2000), l'agarose et le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl carbodiimide (EDC·HCL) ont été achetés auprès d'Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Chine). La solution tamponnée au phosphate (PBS), la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité réactif. Le milieu RPMI-1640 (Gibco), le sérum bovin fœtal (FBS) (Gibco), la trypsine (Gibco) et le tampon TAE 20x ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (Chine). Le kit de comptage cellulaire 8 (CCK-8) a été acheté auprès de Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Les réactifs de transfection LysoTrackerRed, 4 % de paraformaldéhyde, 4'-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et Lipofectamine 2000 ont été achetés auprès d'Invitrogen Co. Ltd. (Chine). La sonde de fluorescence Dil (numéro de cat :C1036) a été achetée auprès de Beyotime Co. Ltd. L'ARN interférent court anti-PLK1 (PLK1-homo-581) (siRNA) a été synthétisé par Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, Chine).

Préparation du PEG-GO-PEI-FA

La synthèse de PEG-GO-PEI-FA se fait selon la stratégie représentée sur la figure S2 (A). Tout d'abord, 10 mL de suspension aqueuse de GO (1000  μg/mL) ont été soniqués en continu dans un bain à 50 W pendant 2  h. Ensuite, 1 mL d'EDC·HCL (5000 μg/mL) et de NHC (5000 μg/mL) ont été ajoutés et soniqués par intermittence pendant 30 min à 100 W, suivis par l'ajout de PEG (10 mg) soniqué pendant 30 min et agité sur un aimant agitateur pendant 6 h à 0 °C. Pour éliminer les réactifs n'ayant pas réagi et obtenir une solution de GO-PEG, le mélange a été dialysé pendant 24 h dans de l'eau distillée avec une membrane de dialyse (MWCO, 3500 Da). Ensuite, la solution GO-PEG a été soniquée pendant 30 min, 1 mL d'EDC·HCL (5000 μg/mL) et NHC (5000 μg/mL) ont été ajoutés et soniqués à nouveau pendant 30 min, suivis de l'ajout de PEI 25K (5000 μg/mL ) 2 mL. Le mélange a été soniqué pendant 30 min et agité pendant 6 h à 0 °C. Par la suite, pour obtenir le PEG-GO-PEI, le mélange a été à nouveau dialysé pendant 24 h dans l'eau distillée avec une membrane de dialyse (MWCO, 3500 Da). La solution de PEG-GO-PEI a été soniquée pendant 60 min, 1 mL d'EDC·HCL (5000 μg/mL) et NHC (5000 μg/mL) a été ajouté et soniqué à nouveau pendant 30 min, suivi par l'ajout de 10 mg FA à la solution . La solution a été soniquée pendant 30 min et agitée pendant 12 h à 0°C et dialysée pendant 48 h pour obtenir le PEG-GO-PEI-FA selon la procédure mentionnée ci-dessus. La solution de nanocomplexes a été séchée par lyophilisateur sous vide (Biosafer-10D).

Caractérisation

Le potentiel zêta de surface et la taille moyenne des particules des nanocomplexes en solution aqueuse ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, Royaume-Uni). Les morphologies des nanocomplexes ont été observées au microscope à force atomique dans l'atmosphère (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Allemagne). Les spectres de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ont été acquis par le spectrographe FTIR Thermo Nicolet 6700, en utilisant la pastille KBr dans une plage de 400 à 4000  cm ⁻¹ . Les spectres d'absorption UV-Vis des nanocomplexes ont été mesurés par spectrophotomètre UV-Vis (UV, EV300, USA). Le Raman des nanocomplexes a été mesuré au microscope Raman dispersif (Senterra R200-L, Allemagne) avec une longueur d'onde d'excitation à 532 nm.

Dosage de biosécurité in vitro

Le SKOV3 (cellules cancéreuses de l'ovaire humain) a été acheté auprès de Keygen (Chine). Les cellules ont été maintenues dans du milieu RPMI-1640, additionné de 10% de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, et cultivées à 37 °C sous atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ . Dans cette étude, la cytotoxicité des matériaux a été analysée dans des cellules SKOV3 par dosage CCK-8. Brièvement, les cellules ont été ensemencées en plaque 96 puits à la densité de 6 × 10 ³ cellules/puits dans 100 μL de milieu 1640 contenant 10% de FBS puis incubé à 37 °C pendant 12 h en atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ . Ensuite, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA ont été ajoutés à des concentrations finales allant de 10 à 1000  μg/mL et incubés avec les cellules pendant 12  h supplémentaires. Un autre, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA ont été incubés avec des temps différents de 4 à 24 h aux concentrations de 100  μg/mL. Par la suite, 10 μL de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant encore 3 h à 37 °C. Après cela, l'absorbance à 450  nm a été mesurée sur un lecteur de microplaques. Chaque expérience de groupe a été répétée trois fois. La viabilité cellulaire relative (%) par rapport aux cellules témoins cultivées dans les milieux a été calculée comme suit :(absorbance de l'échantillon - absorbance du blanc)/(absorbance du contrôle - absorbance du blanc) × 100 %.

Dosage de retardement sur gel d'agarose

La solution tampon TAE 20X a été diluée avec de l'eau traitée au DEPC pour préparer une solution d'agarose à 1 %. Ensuite, la solution a été chauffée pendant 5 min par un four à micro-ondes pour dissoudre complètement l'agarose. Lorsque la température de la solution d'agarose est tombée à 55 °C, une solution de bromure d'éthidium (EB, 0,5  μg/mL) dans un rapport volumique de 10 000:1 a été ajoutée et mélangée uniformément, par la suite, la solution d'agarose en refroidissant pour former un gel d'agarose. . Le mélange PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA et siRNA à différents rapports pondéraux ont été ajoutés au trou. Le gel a été passé à 110 V et 40 mA pendant environ 60 min, puis observé et analysé par un imageur ultraviolet.

Études d'absorption cellulaire de PEG-GO-PEI-FA

Pour étudier l'absorption cellulaire, les nanocomplexes ont été marqués avec FITC selon la méthode décrite précédemment avec une petite modification [28]. Brièvement, la solution de nanocomplexes (environ 1 µmg/mL, 2,0 µmL) a été mélangée avec 0,2 µmL de FITC (26 µmM) dissous dans du DMSO puis agitée pendant une nuit à température ambiante. Les mélanges résultants ont été dialysés à travers une membrane de 5 000 MWCO pour éliminer le FITC non marqué puis lyophilisés. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits (contenant les lamelles) à la densité de 2 × 10 ⁵ cellules/puits dans 2 mL de milieu 1640 contenant 10 % de FBS puis incubé à 37 °C pendant 12 h dans un incubateur de culture cellulaire. Ensuite, le milieu dans chaque puits a été remplacé par du milieu 1640 sans sérum. Par la suite, les cellules ont été traitées avec différents nanocomplexes/FITC. Les cellules traitées sans les nanocomplexes constituent le groupe témoin et les cellules traitées avec PEI 25 K constituent le groupe témoin parallèle. Après incubation pendant 4 h à 37 °C en atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ , le liquide de la plaque de culture a été retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du DPBS froid (pH =7,4), puis 20 μL de DAPI et 5 μL de Dil (colorant cytomembranaire) ont été ajoutés dans chaque puits et incubés 20 min à 37 °C sous l'obscurité. Par la suite, le DAPI et le Dil du milieu de culture ont été retirés et lavés deux fois avec du DPBS froid (pH =7,4) et les lamelles de cellules ont été retirées et fixées sur une lame de verre avec Permount TM Mounting Medium. Ensuite, le signal de fluorescence des lames de cellules a été observé au microscope confocal à balayage laser (CLSM) et a analysé l'absorption cellulaire des nanocomplexes.

Échappement endosomal et pénétration dans le noyau

Pour visualiser la distribution cellulaire, l'échappement endosomal et la pénétration des nanocomplexes, les cellules SKOV3 ont été ensemencées dans une plaque de 12 puits (contenant les lamelles) à la densité de 1 × 10 ⁵ cellules/puits dans 2 mL de milieu 1640 contenant 10% de FBS puis incubé pendant 12 h (37 °C, 5% CO₂ ). Ensuite, le milieu dans chaque puits a été remplacé par 1 mL/puits de milieu 1640 sans sérum. Par la suite, les différents nanocomplexes (100µg/mL) marqués au FITC ont été ajoutés en plaque 12 puits pour 1µmL/puits. Après 6 h, le liquide a été retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du DPBS froid (pH =7,4) et la plaque à 12 puits a été additionnée de LysoTracker Red (5 g/mL) pour 50  μL/puits. Après incubation pendant 15 min à 37 °C en atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ , le liquide de la plaque 12 puits a été retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du DPBS froid (pH =7,4), puis 20 μL de DAPI ont été ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 20 min à 4 °C à l'obscurité. Ensuite, le liquide DAPI a été retiré et lavé deux fois avec du DPBS froid (PH =7,4). Après, avec 4% de paraformaldéhyde fixé 15 min à température ambiante, et les lamelles ont été retirées et fixées sur une lame de verre avec Permount TM Mounting Medium. Le signal de fluorescence des lames a été observé par microscopie confocale à balayage laser et analysé l'échappement lysosomal et la pénétration dans le noyau des nanocomplexes [29].

Analyse de cyto-inhibition

Nous avons analysé l'effet d'inhibition cellulaire de PEG-GO-PEI/siRNA et PEG-GO-PEI-FA/siRNA en utilisant le test CCK-8. Rapidement, les cellules ont été ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 6 × 10 ³ cellules/puits dans 100 μL de milieu 1640 contenant 10% de FBS puis incubé à 37 °C pendant 12 h en atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ . Ensuite, PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA ont été ajoutés à des concentrations finales allant de 10 à 500 g/mL et incubés avec les cellules pendant 12 et 24 h supplémentaires. Ensuite, PEG-GO-PEI/siRNA et PEG-GO-PEI-FA/siRNA ont été incubés avec les cellules de 4 à 48 h à une concentration de 100 μg/mL. L'ARNsi a été transfecté avec de la Lipofectamine 2000 et non traité en tant que groupe témoin. Par la suite, 10 μL de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant encore 3 h à 37 °C. L'absorbance a été mesurée à 450 µnm. Chaque expérience de groupe a été répétée trois fois. Le taux d'inhibition (%) a été calculé comme 1 − (absorbance de l'échantillon − absorbance du blanc)/(absorbance du contrôle − absorbance du blanc) × 100 %.

Statistiques

Chaque test expérimental a été répété trois fois et les données ont été analysées à l'aide du logiciel SPSS 17.0. Test ANOVA à sens unique pour l'analyse multi-groupes et le t de Student non apparié test pour l'analyse à deux groupes ont été utilisés pour la comparaison. Les données ont été exprimées en moyenne et déviation standard (SD), et la signification statistique a été fixée à p <0,05.

Résultats et discussion

Synthèse de PEG-GO-PEI-FA

L'expression de FR a d'abord été analysée dans différentes lignées cellulaires cancéreuses basées sur la base de données de la Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute. org/ccle) [30] et différents tissus de l'ovaire basés sur la Gene Expression Profiling Interactive Analyse (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) base de données [31]. Les résultats étaient cohérents avec les recherches antérieures (figure S1). Par conséquent, nous avons choisi FA comme ligand de ciblage pour la livraison de gènes.

L'oxyde de graphène porte certainement de nombreux groupes contenant de l'oxygène, notamment des carboxyles au bord, des hydroxyles et des groupes époxy sur le plan basal produits par le processus d'oxydation [32]. Pour obtenir GO (NGO) à l'échelle nanométrique, GO a été craqué en continu par sonication dans un bain à 50 W pendant 2  h, puis suivi d'une liaison covalente de PEG/PEI/FA à GO en utilisant la chimie EDC/NHS, comme illustré sur la figure S2 (A). La figure S2(B) a montré la voie de traitement du PEG-GO-PEI-FA/ARNsi. L'analyse de la conjugaison chimique a été réalisée par la technologie des spectres différentiels FTIR pour obtenir les pics d'absorption spectrale [33]. Comme le montre la figure 1a, l'existence de OH (3425 cm ⁻¹ ), C=O (1719 cm ⁻¹ ), et C=H (1350 cm ⁻¹ ) des groupes fonctionnels ont été trouvés dans GO et ont indiqué l'existence d'hydroxyle et de carboxyle à la surface de GO. CH (2885 cm ⁻¹ ) l'étirement de la bande de vibration peut être trouvé lorsque le PEG réagit avec GO via des liaisons covalentes stables ; cela indiquait que le PEG avait été greffé au GO, et que l'efficacité de conjugaison du PEG était d'environ 6 %. Après que PEI et FA aient réagi avec GO, le NH (1590 cm ⁻¹ ), C–N (1420 cm ⁻¹ ) un étirement de la bande de vibration a été observé, indiquant que PEI et FA avaient été greffés à GO par estérification. Ces résultats ont démontré que la conjugaison PEG-GO-PEI-FA avait été synthétisée avec succès.

L'analyse synthétique réussie de PEG-GO-PEI-FA en utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et le spectrophotomètre UV-Vis. un Les spectres FTIR de GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA. b Les spectres d'absorption UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA

La figure 1b a montré les spectres d'absorption UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA. Le GO avait un pic d'absorption de 223  nm. Le FA avait un pic d'absorption de 275  nm. Le GO-PEG a montré une courbe lisse, indiquant que le PEG s'était conjugué avec GO et a rendu la montagne de GO plus lisse. Le PEG-GO-PEI avait un pic d'absorption à 219 nm, illustrant que le PEI s'était greffé à la surface du GO-PEG. Le PEG-GO-PEI-FA avait un pic d'absorption à 219 nm et 275 nm, révélant que le FA s'était greffé sur le PEG-GO-PEI. Tous ces résultats ont en outre démontré la réussite de la synthèse de PEG-GO-PEI-FA.

Caractérisation de PEG-GO-PEI-FA

Les données fournies dans le tableau 1 ont montré la taille des particules et le potentiel zêta des nanocomplexes. La taille des particules des nanocomplexes a progressivement augmenté jusqu'à 218,4  nm tandis que le PEG, le PEI et le FA se sont progressivement greffés à la surface du GO. Le potentiel zêta est passé de -16,5 à + 17,5 mv lorsque PEI est connecté à GO, ce qui a facilité la capacité d'adsorber l'ADN ou l'ARN chargé négativement via une interaction électrostatique et une absorption cellulaire. Les potentiels zêta de PEG-GO-PEI-FA et PEG-GO-PEI-FA/ARNsi étaient de + 14,7 mv et + 14,5 mv, respectivement. Les potentiels zêta ont révélé que PEG-GO-PEI-FA ou PEG-GO-PEI-FA/siRNA étaient plus petits que PEG-GO-PEI en raison de la charge négative de FA et de siRNA. Ceux-ci ont indiqué que le PEG-GO-PEI-FA/ARNsi pourrait être adsorbé à la surface des cellules par l'interaction de charge et être utilisé par l'endocytose médiée par le récepteur sur la cytomembrane [34].

La morphologie de surface et la taille des particules du nanosupport ont également été mesurées par AFM et DLS. Comme le montre la figure 2a, le GO a montré une surface lisse et une structure en feuille avec une taille de particule de 192,1  nm. Après le greffage de PEG, PEI et FA à la surface de GO, la taille des particules de PEG-GO-PEI-FA a augmenté à 216,1  nm, et de nombreuses protubérances ont été observées à la surface de PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b ), suggérant qu'un grand nombre de décorations étaient immobilisées sur les feuilles GO. Dans le même temps, la hauteur du PEG-GO-PEI-FA était supérieure à celle du GO, ce qui est principalement dû à la fixation du PEG, du PEI et du FA sur les deux plans de la feuille GO.

La caractérisation du système de livraison à l'échelle nanométrique. La microscopie à force atomique (AFM) et la diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont été utilisées pour caractériser la morphologie et les distributions de taille :a GO et b PEG-GO-PEI-FA. Spectres Raman pour l'analyse de la surface d'oxyde de graphène générée de GO, GO-PEG et PEG-GO-PEI c

La spectroscopie Raman est l'une des plus couramment utilisées pour mesurer la caractérisation et les propriétés structurelles des matériaux nanocarbonés [35]. Comme le montre la figure 2c, le spectre Raman de GO a montré la bande de vibration à 1600 cm ⁻¹ (bande G) et 1354 cm ⁻¹ (bande D), et le rapport de surface ID/IG était de 1,0385, indiquant que la partie SP ² l'hybridation de GO a été rompue et a formé des groupes hydroxyle et carboxyle. GO-PEG et PEG-GO-PEI ont montré la bande de vibration à 1595 cm ⁻¹ (bande G) et 1352 cm ⁻¹ (bande D), et le rapport de surface ID/IG était de 0,7737 et 0,5238. Le rapport de surface ID/IG a progressivement diminué suite à la réaction PEG et PEI avec le GO ; cela indiquait que le PEG et le PEI s'étaient greffés à la surface du GO.

Analyse de biosécurité in vitro des différentes ONG fonctionnelles

La question de la biosécurité des vecteurs de gènes non viraux est restée un défi important pour les applications cliniques. Les charges positives élevées ont non seulement entraîné une excellente capacité à condenser et à protéger les gènes, mais ont également conduit à une cytotoxicité sévère [36, 37]. Pour tester la cytotoxicité des nanocomplexes d'ARNsi libres, le test CCK-8 a été réalisé avec des cellules SKOV3 qui avaient été incubées pendant 4, 8, 12 et 24 h avec des nanocomplexes libres à différentes concentrations (de 10 à 1000  μg/mL). Comme le montre la figure S3, les nanocomplexes présentaient toujours une viabilité cellulaire élevée dans le cancer de l'ovaire à 1000  μg/mL et 24 h. La cytotoxicité de tous les nanocomplexes a affiché une manière dépendante du temps et de la concentration (viabilité des cellules SKOV3 :supérieure ou égale à 84,38% pour tous les nanocomplexes à 1000 μg/mL, et supérieure ou égale à 94,21% pour tous les nanocomplexes à 24 h avec des cellules SKOV3). Ces résultats suggèrent que les nanocomplexes ont montré une cytotoxicité négligeable et pourraient servir de vecteur de gène biocompatible.

L'analyse de nanocomplexes combinés avec des siRNA

L'absorption cellulaire des molécules d'ARN libres est généralement délicate en raison des charges négatives substantielles qu'elles portent [38]. Le chargement des biomolécules chargées négativement par des polymères cationiques est largement adopté pour résoudre le problème [39]. Dans cet article, le chargement de siRNA sur le vecteur PEG-GO-PEI-FA a été réalisé en mélangeant siRNA et PEG-GO-PEI-FA en solution aqueuse. Comme le montre le tableau 1, le potentiel zêta de PEG-GO-PEI-FA était de + 14,7 mV, indiquant que l'ARNsi peut être adsorbé à la surface de PEG-GO-PEI-FA par interaction électrostatique. Dans cette étude, la capacité de condensation des gènes des nanocomplexes a été évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose [40]. La figure 3a a montré que le PEG-GO-PEI avait une capacité de condensation évidente vers le siRNA à un rapport pondéral de 10, tandis que le retard complet de PEG-GO-PEI-FA de la migration du siRNA était observé lorsque le rapport pondéral atteignait 20 (figure 3b). Ainsi, PEG-GO-PEI-FA pourrait protéger les siARN de la dégradation mais, en même temps, aurait besoin d'un peu plus de nanocomplexe pour démontrer une bonne capacité de liaison. Ceci peut être associé aux potentiels zêta de PEG-GO-PEI-FA qui n'étaient pas si élevés. Ces résultats ont indiqué que PEG-GO-PEI et PEG-GO-PEI-FA avaient une capacité de livraison suffisante, en particulier PEG-GO-PEI-FA, qui a en outre montré son potentiel en tant que vecteur valide pour la livraison efficace et sûre de gènes.

La capacité de chargement de l'ARNsi à différents rapports pondéraux. Un essai de retardement sur gel d'agarose a été effectué pour évaluer l'interaction entre l'ARNsi et le nanosupport. un PEG-GO-PEI et b PEG-GO-PEI-FA aux différents ratios pondéraux (matériaux/siRNA)

Analyse de l'absorption cellulaire

Il est donc crucial que les porteurs puissent cibler spécifiquement les tumeurs pour la livraison de gènes. Afin de confirmer si le transporteur PEG-GO-PEI-FA pouvait facilement pénétrer dans les cellules, nous avons utilisé le FITC comme sonde fluorescente pour l'imagerie intracellulaire. Dans le même temps, les noyaux ont été colorés au DAPI et la cytomembrane a été colorée au Dil. Comme le montre la figure 4, le groupe témoin et le groupe PEG-GO-PEI n'ont pas montré de signaux de fluorescence verte autour des noyaux et de la cytomembrane. Cela impliquait que PEG-GO-PEI n'entrait pas dans les cellules. Le PEI 25K et le PEG-GO-PEI-FA/siRNA sont apparus sous forme de signal de fluorescence verte autour du noyau, ce qui a clairement démontré que le PEG-GO-PEI-FA pouvait pénétrer dans les membranes cellulaires et pénétrer dans les cellules. Les nanocomplexes PEG-GO-PEI-FA ont montré l'absorption cellulaire la plus active, ce qui peut être attribué au FA qui peut spécifiquement lier le FR surexprimé à la surface des cellules SKOV3. Ces résultats suggèrent que FA a joué un rôle essentiel dans la médiation de l'absorption cellulaire efficace des nanocomplexes PEG-GO-PEI-FA et PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Plus important encore, la capacité de l'AF à se lier à son récepteur n'a pas été affectée par la liaison amide covalente, et l'endocytose médiée par le récepteur n'a pas été entravée.

Absorption cellulaire de différents nanocomplexes. Images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) de l'absorption cellulaire de différents nanocomplexes marqués au FITC dans des cellules SKOV3 de cancer de l'ovaire humain après incubation pendant 4 h. Bleu, noyaux (marqués DAPI); rouge, cytomembrane (marquée au Dil); verts, nanocomplexes (labellisés FITC). Les barres d'échelle représentent 100 m, mais la barre d'échelle est de 10 m dans une seule cellule

Analyse de l'échappement lysosomal

Pour le système de délivrance des siARN, ils doivent s'échapper de l'endosome ou former le lysosome. Cependant, sinon, le siRNA se dégradera ou s'écoulera hors de la cellule [41,42,43]. Nous évaluons la capacité d'échappement endosomique par localisation intracellulaire des nanocomplexes à l'aide de CLSM. Comme de nombreux rapports ont démontré que le PEI 25K peut favoriser l'échappement endosomal ou lysosomal par « effet éponge à protons » [44], le PEI 25K a donc été utilisé comme contrôle. Dans cette étude, les nanocomplexes ont été marqués au FITC. Tout d'abord, nous avons estimé que les nanocomplexes entrent dans le lysosomal par le signal jaune que le signal fluorescent vert du FITC superpose au signal fluorescent rouge du Lyto Tracker Red. Le PEI 25K est apparu comme le signal jaune après incubation pendant 4 h avec les cellules et d'autres matériaux sont apparus comme le signal jaune après incubation pendant 2 h avec les cellules, ce qui implique que les matériaux étaient entrés dans les cellules (Fig. 5). Que les nanocomplexes s'échappent ou non du lysosomal par le signal cyan brillant, le signal fluorescent vert du FITC se combine avec le signal fluorescent bleu du DAPI. Comme le montre la figure 5a, le signal vert a été observé dans l'accumulation dans les noyaux, et il y avait un signal cyan brillant après incubation PEI/siRNA pendant 8h avec les cellules, indiquant que PEI/siRNA s'était échappé du lysosome. Cependant, PEG-GO-PEI-FA et PEG-GO-PEI-FA/siRNA avaient un faible signal vert pour pénétrer dans les noyaux dès 2 h, et un signal plus vert s'est accumulé dans les noyaux avec l'augmentation du temps d'incubation. Et il y avait un signal cyan brillant lorsque le PEG-GO-PEI-FA et le PEG-GO-PEI-FA/ARNsi ont été incubés pendant 4h avec les cellules (Fig. 5b, c). Ceux-ci ont indiqué que les matériaux s'étaient échappés du lysosome si tôt. En un mot, ces résultats ont montré que PEG-GO-PEI-FA et PEG-GO-PEI-FA/siRNA restaient une excellente capacité d'échappement endosomique ou lysosomal et peuvent efficacement faciliter l'échappement lysosomal et la transfection de gènes in vitro.

Internalisation cellulaire et fuite lysosomale de PEG-GO-PEI-FA observées par CLSM. Cellules de cancer de l'ovaire SKOV3 incubées avec a Î.-P.-É., b PEG-GO-PEI-FA, et c PEG-GO-PEI-FA pendant 0,5, 1, 2, 4 et 8 h. Ceux en bleu étaient des noyaux colorés au DAPI, les verts étaient des nanocomplexes marqués au FITC et ceux en rouge représentaient les endosomes et la fluorescence des lysosomes après coloration au rouge LysoTracker. Les barres d'échelle représentent 100 m, mais la barre d'échelle est de 10 m dans une seule cellule

Évaluation de l'inhibition cellulaire du PEG-GO-PEI-FA/siRNA

Dans le cas présent, l'effet thérapeutique de PEG-GO-PEI-FA/ARNsi a été examiné par dosage CCK-8 sur des cellules SKOV3 in vitro. Comme le montre la figure 6a, nous n'avons pas trouvé d'influence significative sur le taux de survie des cellules tumorales à différentes concentrations (10 à 100  μg/mL) et à différents moments (12 et 24 h) dans le PEG-GO-PEI- groupe FA. Même si la concentration était supérieure à 100  μg/mL, le taux de survie des cellules tumorales était toujours supérieur à 80 %. Nous avons donc choisi 100 μg/mL pour la prochaine étude d'inhibition cellulaire. Une cytotoxicité plus faible a été observée dans le groupe PEG-GO-PEI/siRNA et Lipo2000/siRNA (taux d'inhibition inférieur à 20 %). Par rapport à PEG-GO-PEI/siRNA et Lipo2000/siRNA, PEG-GO-PEI-FA/siRNA a eu un effet inhibiteur significatif sur la croissance des cellules tumorales SKOV3. PEG-GO-PEI-FA/ARNsi a inhibé les cellules SKOV3 d'une manière dépendante du temps (Fig. 6b). Ces résultats ont indiqué que PEG-GO-PEI-FA/ARNsi avait le meilleur effet d'inhibition pour l'augmentation des cellules tumorales et nous pouvions utiliser PEG-GO-PEI-FA comme nanosupport idéal pour la livraison de gènes.

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. un SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; *p <0.05 (Student’s t test)

Conclusions

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

Abréviations

AFM :

Microscope à force atomique

CCK-8:

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM:

Confocal laser scanning microscope

DAPI :

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB :

Ethidium bromide

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA :

Folic acid

FBS:

Fetal bovine serum

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FITR:

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

FR:

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

GO :

Oxyde de graphène

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS:

N -hydroxysuccinimide

NP :

Nanoparticules

PBS :

Phosphate-buffered solution

PDI :

Indice de polydispersité

PEG :

Polyéthylène glycol

Île-du-Prince-Édouard :

Polyéthylèneimine

siRNA:

Small interfering RNA