Composite points quantiques de carbone-porphyrine platine : agent théranostique à double fonction pour photothérapie dynamique anticancéreuse améliorée

Résumé

Les photosensibilisateurs (PS) sont notoirement hydrophobes, limitant leur utilité clinique en thérapie photodynamique (PDT). Pour surmonter cela, nous avons conçu un nouvel agent nano-théranostique, CQDs@PtPor, par liaison électrostatique d'un complexe porphyrine tétraplatinée (PtPor) à des points quantiques de carbone (CQDs) chargés négativement. Une caractérisation complète (DRX, MET, XPS, FTIR) a confirmé l'assemblage réussi des CQDs et PtPor en une seule nanostructure. L'analyse spectroscopique a révélé un transfert d'énergie par résonance efficace des CQDs vers le PtPor, résultant en une production marquée d'oxygène singulet (¹O₂). Des études in vitro sur cellules HeLa ont démontré que CQDs@PtPor atteignait une phototoxicité supérieure comparé au PtPor libre tout en présentant une cytotoxicité noire négligeable, soulignant son potentiel comme plateforme thérapeutique anticancéreuse sûre et efficace.

Contexte

La PDT est apparue comme une stratégie non-invasive pour traiter les troubles cutanés, la dégénérescence maculaire et divers cancers ^[1]. La thérapie repose sur des PS activés par la lumière qui génèrent des espèces réactives de l'oxygène (ROS) sous irradiation, tuant sélectivement les cellules tumorales tout en épargnant les tissus sains ^[2-6]. Bien que des PS activables tels que les dérivés de porphyrine et de phtalocyanine puissent servir à double rôle en imagerie et thérapie, leur traduction clinique est entravée par une faible solubilité aqueuse, une photosensibilité cutanée prolongée, une pénétration tissulaire limitée et une absorption sous-optimale au-delà de 700 nm ^[7-11]. Divers nanovecteurs — liposomes, nanoparticules polymériques, nanoparticules d'or, nanotubes de carbone, graphène et points quantiques de carbone (CQDs) — ont été explorés pour améliorer la livraison et la performance des PS ^[12-22].

Les CQDs, une classe polyvalente de nanomatériaux de carbone, présentent des propriétés optiques exceptionnelles, une haute solubilité dans l'eau, une faible toxicité, une excellente biocompatibilité et une fonctionnalisation de surface aisée ^[23-27]. Leurs groupes de surface abondants permettent l'attachement covalent ou non-covalent de médicaments, protéines ou ligands de ciblage, les rendant attractifs comme vecteurs pour les applications théranostiques ^[31-33]. Des études antérieures ont démontré que les CQDs conjugués avec des PS (ex. Ce6, ZnPc, TMPyP) peuvent améliorer l'imagerie par fluorescence et l'efficacité photodynamique par des mécanismes de transfert d'énergie ^[34-36].

Récemment, un complexe porphyrine tétraplatinée a exhibé une faible cytotoxicité noire mais des valeurs IC₅₀ aussi basses que 19 nM sous irradiation à 420 nm, indiquant une activité anticancéreuse puissante ^[37]. Cependant, son hydrophobicité et sa biocompatibilité limitée empêchent l'usage clinique. Nous avons donc conçu CQDs@PtPour exploiter la solubilité et la chimie de surface des CQDs tout en conservant la puissance thérapeutique du PtPor. L'assemblage électrostatique entre le PtPor chargé positivement et les CQDs chargés négativement améliore non seulement la dispersibilité aqueuse mais favorise aussi le transfert d'énergie, amplifiant ainsi la génération de ¹O₂ et la phototoxicité.

Méthodes

Matériaux
Diammine dichlorure de trans-platine (trans-platine) (Aladdin®), 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF) (Sigma-Aldrich), et tous les solvants ont été achetés chez Tianjin Fu Chen Chemical Reagents ou Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Tous les réactifs ont été utilisés tels que reçus.

Synthèse de [Trans-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-Tétra(4-pyridyl)-Porphyrine Nitrate

Trans-platine (0,193 mmol, 58 mg) et AgNO₃ (0,193 mmol, 33 mg) ont été dissous dans 5 mL DMF et agités pendant 24 h. Le précipité blanc d'AgCl résultant a été éliminé par centrifugation, donnant une solution claire. Celle-ci a été ajoutée à une suspension de 5,10,15,20-Tétra(4-pyridyl)porphyrine (0,487 mmol, 30 mg) dans 3 mL DMF, suivie d'agitation à 50 °C pendant 48 h. Après refroidissement, 10 mL d'éther diéthylique a été ajouté pour précipiter le produit rouge, qui a été lavé au méthanol, dichlorométhane et éther. Le séchage sous vide a donné 81 mg de produit (rendement 86 %). La structure a été confirmée par RMN ¹H et ESI-MS.

Préparation des CQDs

Acide citrique (0,45 g) et éthylènediamine (500 µL) ont été dissous dans 10 mL d'eau DI et soumis à un traitement hydrothermal à 200 °C pendant 5 h dans un autoclave tapissé de PTFE. La solution brun-noir résultante a été purifiée par centrifugation et dialyse contre l'eau DI pour obtenir les CQDs.

Préparation du composite CQDs@PtPor

PtPor (20 mg dans 3 mL DMSO) a été dispersé dans 12 mL d'eau et ajouté lentement à une suspension de CQDs (5 mg dans 15 mL H₂O) sous sonication. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 24 h, puis purifié par centrifugation et dialysé pendant 2 jours. La solution aqueuse finale a été lyophilisée à 4 °C pour obtenir le composite.

Mesure du rendement quantique

Le rendement quantique (Φ) des CQDs a été calculé par rapport au sulfate de quinine (Φ_st ≈ 54 %) en utilisant la méthode comparative standard. L'absorbance a été maintenue en dessous de 0,1 à 360 nm pour éviter les effets de réabsorption.

Génération d'oxygène singulet

Les échantillons (5 mg mL⁻¹) ont été mélangés avec 10 mM DPBF dans une cuve de 3 mL et irradiés avec une lampe xénon 50 W (filtre passe-long 500 nm, 6 mW cm⁻²) jusqu'à 30 min. La diminution de l'absorbance du DPBF à 415 nm a été surveillée toutes les 3 min pour quantifier la production de ¹O₂. La fluorescence DCFH (λ_em = 525 nm) a aussi été utilisée comme sonde qualitative.

Essais de cytotoxicité

Les cellules HeLa ont été cultivées dans DMEM avec 5 % FCS, 100 U mL⁻¹ pénicilline et 100 µg mL⁻¹ streptomycine à 37 °C, 6 % CO₂. Pour la cytotoxicité noire, les cellules ont été incubées avec des concentrations variables de CQDs, PtPor ou CQDs@PtPor pendant 24 h, puis évaluées par essai MTT. Pour la phototoxicité, les cellules ont été irradiées après 24 h d'incubation, et la viabilité a été à nouveau déterminée par MTT.

Imagerie cellulaire

Cellules HeLa (5 × 10⁴ cellules mL⁻¹) ont été incubées avec 0,25 mg mL⁻¹ CQDs@PtPor pendant 1 h, lavées, et imagées par microscopie confocale (Zeiss LSM7 DUO) utilisant un laser 405 nm.

Résultats

Préparation et caractérisation de CQDs@PtPor

La microscopie électronique à transmission (MET) a révélé des particules uniformes et monodisperses : les CQDs avaient une moyenne de 2,5 nm, tandis que CQDs@PtPor avait une moyenne de 7,6 nm, reflétant l'adsorption du PtPor (Fig. 1). Les diagrammes DRX affichaient un pic large à ~23°, indiquant une structure de carbone amorphe. Les spectres FTIR confirmaient la présence de groupes hydroxyle, amino et amide (Fig. 2b). La diffusion dynamique de la lumière (DLS) a mesuré un diamètre hydrodynamique moyen de 9,2 nm pour CQDs@PtPor, corroborant les données MET. Le potentiel zêta a basculé de −15,6 mV (CQDs libres) à +4,5 mV après conjugaison du PtPor, confirmant la liaison électrostatique (Fig. 3d).

Propriétés photophysiques

Les spectres UV-Vis montraient l'absorption caractéristique des CQDs (~360 nm) et les bandes Soret/Q de la porphyrine (~425, 520, 580 nm). Les CQDs présentaient une photoluminescence (PL) dépendante de l'excitation avec émission décalant de 460 à 552 nm sur excitation 280-500 nm, et un rendement quantique de 36 %. Dans le composite, l'intensité PL à 500 nm diminuait tandis que l'émission à 660 nm augmentait, témoignant d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) efficace. Les mesures de durée de vie de fluorescence confirmaient une durée de vie du donneur raccourcie dans CQDs@PtPor, soutenant davantage le transfert d'énergie (Fig. 4).

Production d'oxygène singulet améliorée

Les expériences de dégradation du DPBF ont révélé que CQDs@PtPor produisait significativement plus de ¹O₂ que le PtPor libre, tandis que les CQDs seuls montraient une activité négligeable (Fig. 5a). La fluorescence DCFH a corroboré ces résultats, avec CQDs@PtPor donnant le signal le plus fort (Fig. 5b).

Phototoxicité dans les cellules HeLa

Les essais de cytotoxicité noire ont montré >90 % de viabilité à 50 µg mL⁻¹ pour tous les échantillons (Fig. 6a). Les essais de phototoxicité, cependant, ont démontré une réduction dose-dépendante de la viabilité : CQDs@PtPor à 50 µg mL⁻¹ a atteint seulement 8 % de survie, surpassant PtPor (18 %) et CQDs (90 %) (Fig. 6b). Cette efficacité supérieure est attribuée à la génération accrue de ¹O₂ médiée par les CQDs.

Absorption cellulaire et stabilité

L'imagerie confocale a révélé que CQDs@PtPor se localisait principalement dans le cytoplasme des cellules HeLa, avec la fluorescence bleue des CQDs chevauchant l'émission rouge du PtPor, indiquant une formation de complexe stable post-absorption (Fig. 7).

Discussion

Le FRET prononcé des CQDs vers le PtPor, attesté par l'émission du donneur réduite et la durée de vie raccourcie, se traduit directement en une production plus élevée de ¹O₂ et une phototoxicité améliorée. La petite taille (~10 nm) de CQDs@PtPor facilite l'accumulation tumorale via l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR), tandis que la dispersibilité aqueuse améliorée et la biocompatibilité réduisent la toxicité systémique. La nature modulaire de l'assemblage électrostatique permet une substitution aisée de différents PS ou ligands de ciblage, positionnant CQDs@PtPor comme une plateforme polyvalente pour la PDT personnalisée.

Conclusions

Nous avons fabriqué avec succès un nanoagent CQDs@PtPor combinant les propriétés optiques supérieures des CQDs avec l'activité anticancéreuse puissante d'une porphyrine tétraplatinée. Le composite présente une haute stabilité aqueuse, une faible toxicité noire, un transfert d'énergie efficace et une efficacité photodynamique marquée in vitro. Ces attributs font de CQDs@PtPor un candidat prometteur pour la future traduction clinique en thérapie anticancéreuse.