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Nanoparticules d'or bioconjuguées compatibles avec l'environnement en tant qu'agents de contraste efficaces pour l'imagerie du cancer induit par l'inflammation

Résumé

Pour de nombreux cancers, la détection précoce est la clé pour améliorer la survie et réduire la morbidité, qui est associée aux résections radicales dues à un diagnostic tardif. Ici, nous décrivons l'efficacité des nanoparticules d'or conjuguées à des anticorps primaires (AuNPs) pour cibler spécifiquement les processus inflammatoires chroniques, en particulier les macrophages M2, dans des coupes tissulaires de rectocolite hémorragique (CU) et de stéatohépatite chez le rat qui peuvent conduire au cancer colorectal et au carcinome du foie, respectivement. Dans cette étude, nous démontrons que les AuNPs synthétisés par une méthode simple, peu coûteuse et respectueuse de l'environnement peuvent être facilement conjugués avec les anticorps anti-COX-2, anti-MIF et Alexa Fluor® 488 (ALEXA) pour effectuer une coloration par immunofluorescence chez les personnes enflammées. tissus. De plus, nous avons montré que les nanoparticules d'or conjuguées à des anticorps primaires (AuNPs) peuvent être utilisées pour cibler les macrophages M2 par cytométrie en flux. Nous avons conçu trois protocoles de coloration par immunofluorescence de coupe de tissu avec des AuNP pendant 30 min et une incubation d'une nuit, ainsi qu'un protocole de cytométrie en flux de marquage des macrophages M2 avec des AuNP pendant 30 min. Les résultats d'immunofluorescence et de cytométrie en flux suggèrent que la conjugaison a été réalisée par adsorption directe d'anticorps sur la surface des AuNPs. Comparé au protocole ALEXA standard en immunofluorescence (IF) et en cytométrie de flux (FC), notre protocole d'incubation de 30 minutes utilisant des AuNPs au lieu d'ALEXA est passé d'environ 23 h à 5 h pour IF et de 4 h à 1 h pour FC, s'avérant moins laborieuse, ce qui rend la méthode éligible pour le diagnostic du cancer induit par l'inflammation.

Introduction

Dans la recherche médicale et biologique, l'intérêt pour les nanoparticules d'or (AuNPs) pour les études de microscopie optique et les procédures de diagnostic, en particulier la microscopie laser confocale, augmente. L'utilisation de conjugués anticorps/AuNP permet la détection en temps réel de l'absorption d'or dans les cellules vivantes (par exemple, les cellules cancéreuses) au niveau de particules individuelles, permettant l'estimation des quantités intracellulaires de NP [1,2,3].

Les propriétés physico-chimiques des AuNPs leur permettent d'être utilisées dans de nombreuses études médicales, telles que la génomique, la biosensibilité, les immunoessais, la chimie clinique, la détection et la photothermolyse de micro-organismes et de cellules cancéreuses [1]. Faulk et Taylor [4] ont décrit la première méthode de conjugaison d'anticorps avec de l'or colloïdal pour la visualisation directe au microscope électronique des antigènes de surface des salmonelles. Depuis lors, de nombreuses études ont été développées visant à l'application de nanoparticules conjuguées à des biomacromolécules, telles que des anticorps, des lectines et des enzymes, dans différents domaines, par exemple la biochimie, la microbiologie, l'immunologie et la morphologie [1, 4]. Dans les études sur le cancer, des agents de contraste hautement spécifiques et sensibles à base d'AuNP sont utilisés pour les modalités d'imagerie par rayons X et optique, car les AuNP sont capables d'améliorer l'intensité de fluorescence des molécules conjuguées [5, 6].

En 2014, nous avons démontré que les AuNPs peuvent être appliquées à la méthode de coloration par immunofluorescence indirecte (IF) dans les cultures cellulaires [6]. Dans la présente étude, nous décrivons trois nouvelles méthodes de coloration par immunofluorescence (IF) à l'aide d'AuNPs. Ici, nous utilisons des coupes de tissus et comparons l'intensité de fluorescence de chacune de ces méthodes au protocole de coloration standard avec l'anticorps Alexa Fluor® 488 (ALEXA) (A1) dans le but d'optimiser une technique de fluorescence pour une application clinique [7,8,9 ].

L'imagerie par fluorescence (IF) pour le ciblage des cellules cancéreuses utilise une variété de technologies d'imagerie optique afin d'améliorer la détection des néoplasies précoces sur la base de signatures moléculaires spécifiques du cancer [10]. Depuis 2013, il y a eu une augmentation rapide du nombre d'essais cliniques utilisant l'IF. Le dépistage est généralement envisagé pour les patients à haut risque, qui repose sur une combinaison de facteurs liés au mode de vie, à la génétique ou à des antécédents personnels de maladie, tandis que la surveillance est réservée aux patients présentant un diagnostic de dysplasie/inflammation chronique ou à ceux suspectés de malignité. L'IF peut aider à identifier les lésions malignes avec une spécificité et une sensibilité améliorées par rapport aux techniques actuellement disponibles. De plus, le dépistage basé sur l'IF peut fournir un moyen moins invasif et plus rentable de détecter les lésions cancéreuses ou précancéreuses. Plus précisément, la capacité de l'IF à détecter les lésions plus tôt que les méthodes de dépistage conventionnelles entraînera non seulement une amélioration des résultats du traitement, mais également une réduction des coûts de traitement, car elle évitera le recours à des soins multimodaux, qui sont nécessaires pour les personnes diagnostiquées lors d'un diagnostic ultérieur [11] . Dans cette étude, nous démontrons que les conjugués anticorps/AuNPs peuvent être appliqués avec succès pour l'imagerie de l'inflammation chronique au moyen de la microscopie à fluorescence.

Méthodes/Expérimental

Objectif de l'étude

Le but de cette étude est de démontrer comment les propriétés de fluorescence des nanoparticules d'or peuvent être utilisées dans les techniques de IF et de cytométrie en flux. De plus, nous avons comparé les protocoles testés avec les AuNPs au protocole standard utilisant ALEXA et prouvé qu'il est possible d'utiliser les AuNPs dans un protocole, qui est plus rapide, mais aussi fiable que le protocole standard.

Produits chimiques et réactifs

Le trichlorure d'or (30 % en poids dans HCl), la polyvinylpyrrolidone (PVP, MW = 10.000), l'hydroxyde de sodium, la membrane de cellulose du tube de dialyse et le glycérol étaient des produits de Sigma-Aldrich Chemical Co (Saint Louis, USA). L'acide sulfurique et le peroxyde d'hydrogène ont été achetés auprès de Vetec (Rio de Janeiro, Brésil). Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et de l'albumine de sérum bovin (BSA, 5 %) ont été achetées auprès de Life Technologies Corporation© (Californie, États-Unis). Anti-COX-2 (cyclooxygénase-2) et les anticorps primaires anti-MIF (facteur d'inhibition de la migration des macrophages) ont été acquis auprès de Santa Cruz Biotechnology (São Paulo, Brésil), tandis que l'anticorps secondaire Goat Anti-Rat IgG H&L Alexa Fluor® 488 a été acheté auprès d'ABCAM® (Cambridge, Royaume-Uni). Le milieu de montage Fluoroshield avec DAPI (20 ml) d'ABCAM® (Cambridge, Royaume-Uni) a été utilisé pour la contre-coloration de l'ADN.

Production et caractérisation des AuNPs et spectroscopie de fluorescence

Des AuNPs sphériques (7,1 nm) ont été produites et caractérisées selon une étude de Gasparotto et al. [12]. En bref, toute la verrerie était conservée dans KMnO4 + Solution de NaOH pendant une nuit, rincée à l'eau déminéralisée, conservée dans H2 O2 + H2 SO4 solution (1:1 v /v ) pendant 10 min, à nouveau rincé à l'eau déminéralisée et séché avant utilisation. Le PVP (0,20 g) et le chlorure d'or (6,80 mg) ont été dissous dans 10 ml d'eau. Dans un bécher séparé, du glycérol (0,18 µg) et du NaOH (0,080 µg) ont été dissous dans 10 µml d'eau. La solution de glycérol-NaOH a ensuite été ajoutée à l'AuCl3 -Solution de PVP pour donner les concentrations finales suivantes : 1.0 mmol/L −1 Au 3+ , 0,10 M de NaOH, 0,10 M de glycérol et 10 g/L −1 PVP. Le mélange final avait une couleur rouge foncé en raison de la formation d'AuNPs. Les spectres d'absorption colloïdale ultraviolet-visible des AuNPs ont été acquis avec un spectrophotomètre UV-visible Evolution 60S (Thermo Scientific, MA, USA). La spectroscopie de fluorescence a été réalisée avec un spectrofluorophotomètre PC RF-5301 (Shimadzu, Kyoto, Japon).

Conception expérimentale

Les trois protocoles ont été testés sur des groupes témoins de deux modèles d'inflammation chronique, la rectocolite hémorragique induite par l'acide acétique (CU) [7] et la stéatohépatite induite par l'alcool [8, 9] chez le rat.

La CU induite par l'acide acétique a été réalisée sur des rats Wistar femelles (220 ± 20 g de BW), obtenus auprès du Biotechnology Center/Universidade Federal da Paraiba. Les animaux ont été divisés en deux groupes (n = 5 par groupe) :contrôle acide acétique et rats non colitiques. Les animaux ont été à jeun pendant la nuit et anesthésiés avec de la kétamine (70 mg/kg, 10%) et de la xylazine (10 mg/kg, 2%). La CU a été induite selon des méthodes initialement décrites par MacPherson et Pfeiffer [13] et modifiées par Millar et al. [14]. Un cathéter a été soigneusement inséré dans le côlon. Ensuite, de l'acide acétique à 10 % (0,5  ml) dans une solution saline à 0,9 % a été instillé dans la lumière du côlon. Le groupe non colitique a reçu 0,5  ml de solution saline à 0,9 % par voie intracoloniale. Les rats ont été maintenus en décubitus dorsal pendant 30 secondes pour éviter les fuites de l'instillation intracolique.

Les animaux ont été mis à jeun pendant la nuit et euthanasiés avec une surdose de thiopental, 48h après l'induction. Ensuite, le côlon a été retiré de manière aseptique, rincé avec du PBS et placé sur une plaque glacée. Le côlon a été nettoyé de la graisse et du mésentère. Ensuite, chaque échantillon a été pesé et sa longueur mesurée sous une charge constante (2µg). Ensuite, le côlon a été ouvert longitudinalement et noté pour les dommages macroscopiquement visibles sur une échelle de 0 à 10 selon les critères décrits par Bell et al. [15].

La stéatohépatite alcoolique a été induite chez des rats Wistar mâles (290 ± 10 g de BW) obtenus du Département de biophysique et de pharmacologie – Université fédérale de Rio Grande do Norte (UFRN). Les animaux ont été divisés en deux groupes (n = 5 par groupe) :rats alcoolisés et non alcoolisés. Solution d'éthanol (7  g/kg de poids corporel de 30 % v /v ) a été utilisé comme dose chronique pour le groupe alcoolique. Les animaux du groupe sans alcool ont reçu par voie orale un volume équivalent de solution saline (0,9 % de NaCl) par gavage. Les procédures de gavage ont été effectuées une fois par jour dans les deux groupes pendant 28 jours.

Au jour 29, l'euthanasie a été réalisée par injection intrapéritonéale de 7,5 ml/kg de kétamine (50 mg/ml) et de 2,5 ml/kg de Xylazine (20 mg/ml). Avant l'euthanasie, tous les groupes d'animaux ont été à jeun pendant 12 h. Une fois inconscients, les animaux ont subi une ponction cardiaque suivie d'une ablation du foie. Des fragments de foie ont été immergés dans du formaldéhyde tamponné à 10 % pour une analyse histopathologique.

Les animaux atteints de CU induite par l'acide acétique et de stéatohépatite induite par l'alcool ont été hébergés dans des conditions standard (cycle lumière/obscurité de 12 h, 22 ± 0,1 °C et 50-55% d'humidité) avec ad libitum accès à la nourriture et à l'eau. Les animaux ont été traités selon les principes éthiques de l'expérimentation animale.

Histologie

Cinq blocs de paraffine des témoins positifs (témoin acide acétique et témoin alcoolique) de chaque modèle d'inflammation ont été utilisés pour la coloration IF indirecte. Les anticorps primaires anti-COX-2 et anti-MIF se sont avérés être de bons marqueurs d'inflammation dans la CU induite par l'acide acétique et la stéatohépatite induite par l'alcool, respectivement, en fournissant une coloration fiable en termes d'intensité de fluorescence qui peut être utilisée pour comparer différents protocoles.

Les tissus ont été fixés dans du formaldéhyde tamponné à 10 %, déshydratés à l'alcool éthylique (70 %, 80 %, 90 %, 95 % et P.A.), clarifiés au Xylol et imprégnés de paraffine selon le protocole standard [8]. Avant la préparation des coupes pour la coloration IF indirecte, les lames ont été conservées dans une étuve à 60°C pendant 24h.

Conceptions d'immunofluorescence et de protocoles

Trois coupes de tissus (4 μm) de chaque animal ont été déparaffinées dans du xylène et lavées dans une série de concentrations décroissantes d'éthanol, de 99 % d'éthanol à 50 % d'éthanol. Enfin, les coupes de tissus ont été lavées deux fois dans dH2 O et un lavage avec du PBS. La récupération de l'antigène a été réalisée en plaçant les coupes dans un citrate de sodium à 10 mM avec 0,05 % de Tween 20 à 95 °C pendant 30 min puis à température ambiante (RT) pendant 20 min. Le bruit/signal de fond a été réduit en incubant les sections dans 0,1 % de noir Soudan dans 70 % d'alcool à température ambiante pendant 20 min, suivi de trois lavages dans 0,02 % de PBS-Tween 20. Les échantillons ont été perméabilisés dans 0,2 % de Triton-X-100 dans PBS (trois lavages, 5 min chacun), lavés dans du PBS, puis bloqués avec du PBS, 5% BSA, dH2 O et Triton-X-100. Les lames ont été incubées avec une solution de bloc dans une chambre humide pendant 2 h. Comme le montrent le tableau 1 et la figure 1, l'incubation des anticorps primaires anti-COX-2 et anti-MIF a été réalisée selon trois protocoles différents (NP1, NP2 et NP3). Ces protocoles ont été comparés à deux protocoles basés sur ALEXA qui diffèrent par le temps d'incubation de l'anticorps primaire :le protocole standard ALEXA (incubation pendant la nuit) adopté par notre groupe de recherche comme protocole standard pour la plupart des procédures (A1) et le protocole modifié ALEXA (A2; 30 min d'incubation). NP1 est une méthode de coloration par immunofluorescence dépendante des nanoparticules avec 30 min pour l'incubation primaire. Les anticorps primaires ont été dilués dans 1% de BSA à des ratios de 1:500 (anti-COX-2) et 1:400 (anti-MIF), et chaque échantillon a été incubé dans une chambre humide à température ambiante (20°C) pendant 30 min . Ensuite, 100-150 μl d'AuNPs ont été ajoutés aux échantillons, qui ont été laissés incubés à température ambiante (20°C) pendant 30 min supplémentaires. Dans le deuxième protocole dépendant des nanoparticules (NP2), les anticorps primaires ont été dilués dans 1% de BSA et appliqués directement sur les lames, qui ont été laissées au réfrigérateur pendant la nuit. Par conséquent, A2 et NP1 sont tous deux des protocoles d'incubation de 30 minutes, mais A2 est réalisé avec un anticorps fluorescent secondaire (ALEXA), tandis que NP1 a des AuNP comme fluorophores. Ceci s'applique également aux protocoles d'incubation d'une nuit A1 et NP2. Après les temps d'incubation respectifs, les lames de chaque protocole ont été lavées trois fois avec du PBS pour éliminer l'excès d'anticorps primaire. Ensuite, 100-150 μl de nanoparticules ont été ajoutés à chaque lame dans NP2, tandis qu'ALEXA (1:400) a été ajouté dans A1. Après 1 h d'incubation avec AuNPs (NP2) et ALEXA (A1), toutes les lames ont été lavées trois fois avec du PBS.

Images de coloration à l'hématoxyline et à l'éosine de groupes témoins de CU induite par l'acide acétique et de stéatohépatite induite par l'alcool. un Contrôle négatif du modèle UC (× 100 ; barre d'échelle = 100 μm). b CU induite par l'acide acétique. La flèche rouge indique une infiltration leucocytaire de la zone muqueuse (× 100 ; barre d'échelle = 100 μm). c Contrôle négatif de la stéatohépatite (× 200 ; barre d'échelle = 50 μm). d Stéatohépatite induite par l'alcool. La flèche noire indique une infiltration leucocytaire (× 200 ; barre d'échelle = 50 μm)

Le troisième protocole (NP3) a été conçu pour explorer les propriétés d'amplification des AuNPs dans les systèmes fluorescents. Dans NP3, AuNPs ont été appliqués lors de la dilution d'ALEXA dans 1% BSA. Trois dilutions d'anticorps secondaires (1:200, 1:400 et 1:800) dans BSA avec AuNPs ont été testées afin de comparer les intensités de fluorescence de chaque dilution à A1. Les dilutions ont été préparées de telle sorte que le volume d'AuNPs soit proportionnel au volume de BSA, par exemple, pour une dilution 1:200, 2 μl d'ALEXA ont été dilués dans 199 μl d'AuNPs + 199 μl de BSA. Le temps d'incubation des anticorps primaires dans A1 et NP3 était d'environ 18 h (une nuit), alors que le temps d'incubation pour la suspension ALEXA + AuNPs était de 1 h.

Enfin, les échantillons ont été montés à l'aide de Fluoroshield Mounting Medium avec DAPI. Les lames ont été conservées dans une boîte à l'abri de la lumière et maintenues à 4°C jusqu'à l'analyse microscopique. Des images fluorescentes ont été obtenues avec un microscope droit Zeiss Observer z.1 pour l'imagerie en fluorescence et en champ clair (objectifs × 20 et × 10, Carl Zeiss, Jena, Allemagne) avec AxioCam MRc. Le paramètre de moyenne arithmétique du logiciel Zeiss ZEN lite blue edition (Carl Zeiss) a été utilisé pour évaluer quantitativement l'intensité de la fluorescence pixel par pixel pour chaque image du canal ALEXA. Au moins trois échantillons de chaque animal (cinq animaux par groupe) ont été analysés et cinq photos ont été prises de chaque fragment avec l'objectif × 10.

Induction de TAM à polarisation M2 in vitro

Pour l'évaluation des nanoparticules d'or conjuguées à des anticorps primaires (AuNP) dans les macrophages M2, cellules RAW 264.7 (5 × 10 5 cellules/puits dans une plaque de 12 puits) ont été cultivées en milieu complet avec 10 % de sérum bovin foetal additionné de 20 ng/ml d'IL-4 pendant 24 h. Après traitement à l'IL-4, les cellules ont été lavées trois fois avec du DMEM sans sérum, suivi d'une culture dans le même milieu pendant 48h. Les cellules ont été analysées à l'aide d'un microscope optique Telaval 31 (ZEISS, Oberkochen, Allemagne).

Cytométrie en flux

Après incubation avec l'IL-4 pendant 48 h, les cellules RAW 264.7 et les macrophages M2 (1,5 × 10 4 cellules/puits dans une plaque de 12 puits) ont été collectés avec un grattoir et bloqués avec 0,5 g de BSA dans 100 ml de PBS (PBA) pendant 45 min, suivi d'une incubation avec du PerCP conjugué anti-souris CD163 (1:1000) et FITC -CD86 anti-souris conjugué (1:1000) à 4 °C pendant 60 min. En outre, les macrophages M2 ont été marqués avec des anticorps primaires COX-2 et MIF et ainsi conjugués aux AuNPs. Les TAM polarisés M2 ont été collectés et fixés avec du paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS pendant 10 min, suivi d'une incubation avec les primaires anti-COX-2 et anti-MIF (1:100) pendant 60 min à 4 °C et ; par la suite, les cellules ont été marquées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin Alexa® Fluor 488 conjugué (Thermo Fisher Scientific) dans une solution d'incubation (1:100) à température ambiante pendant 60 min comme décrit dans le protocole standard Alexa [16]. Suivant le protocole (N1) où les AuNP remplacent l'anticorps secondaire conjugué Alexa® Fluor 488 anti-lapin de chèvre, les macrophages M2 ont été récoltés, lavés avec du PBS et incubés avec les primaires anti-COX-2 et anti-MIF (1:100 ) dans une solution d'incubation à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, les cellules ont été incubées avec AuNPs (1:5) à 4°C pendant 30 min (excitation AuNPs à 520  nm). Après l'étape de lavage finale, les cellules marquées ont été analysées dans un logiciel BD FACSCanto II (BD Biosciences, Pays-Bas) et FlowJo (version 10.1; Tree Star Inc., Royaume-Uni). Toutes les analyses de cytométrie en flux ont été effectuées avec des échantillons en triple et répétées trois fois. La comparaison entre les protocoles ALEXA et AuNPs standard est présentée dans le tableau 2.

Analyse statistique

Analyse de variance (ANOVA) et post hoc de Bonferroni tests ont été effectués pour l'analyse d'immunofluorescence. Pour l'analyse par cytométrie en flux, les différences significatives entre les groupes ont été calculées en utilisant l'ANOVA et le test de Dunn, comme indiqué. Un p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif pour toutes les analyses effectuées.

Résultats

Analyse microscopique

La coupe de la figure 1a montre une coupe de tissu colorée à l'hématoxyline et à l'éosine (témoin négatif). Le processus inflammatoire chronique induit par l'acide acétique est représenté sur la figure 1b, qui révèle une perte d'architecture tissulaire avec pour conséquence une destruction de l'épithélium, une réduction des cellules caliciformes, la présence d'hémorragies et de leucocytes à proximité des sites lésés. Dans la figure, une accumulation de gouttelettes graisseuses et un infiltrat inflammatoire (neutrophiles et lymphocytes) ont été observés dans le foie de rats soumis à une exposition chronique à l'alcool.

En termes d'intensité de fluorescence, les AuNPs ressemblaient à ALEXA, qui est un fluorophore conventionnel pour la coloration IF. Dans les échantillons de foie et de côlon, les différences d'intensité de fluorescence de NP1 et NP2 étaient minimes ou inexistantes par rapport à A1. Sur la figure 2, de multiples comparaisons entre les protocoles FI testés à l'aide d'anticorps primaires anti-COX-2 et anti-MIF sont présentées. Les figures 2a et d démontrent que les intensités de fluorescence de A2, NP1 et NP2 ne sont pas significativement différentes par rapport au protocole A1 ( # p> 0,05), suggérant que des protocoles d'incubation de 30 min (utilisant ALEXA ou AuNPs) peuvent être applicables dans un contexte de diagnostic.

Comparaison de l'intensité de fluorescence entre les groupes. un Intensité de fluorescence des AuNPs dans A2, NP1 et NP2 par rapport à l'UC induite par l'acide acétique uniquement A1 (anticorps anti-COX-2). b Toutes les dilutions de NP3 (1:200, 1:400 et 1:800) par rapport à l'intensité de fluorescence de l'UC induite par l'acide acétique A1 (1:400) uniquement (anticorps anti-COX-2). c Comparaison de l'intensité de fluorescence chez les animaux induits par l'acide acétique et les témoins négatifs après une courte période (A2 et NP1) et une nuit d'incubation (A1 et NP2). d Intensité de fluorescence des AuNPs dans A2, NP1 et NP2 par rapport à la stéatohépatite induite par l'alcool A1 uniquement (anticorps anti-MIF). e Toutes les dilutions de NP3 (1:200, 1:400 et 1:800) par rapport à l'intensité de fluorescence de A1 (1:400) uniquement induite par l'alcool de la stéatohépatite (anticorps anti-MIF). f Comparaison de l'intensité de fluorescence chez les animaux atteints de stéatohépatite induite par l'alcool et les témoins négatifs après 30 min d'incubation (A2 et NP1) et une nuit d'incubation (A1 et NP2). Statistiques :ANOVA et test post hoc de Bonferroni, # p ≥ 0,05, ***i>p < 0,01,***p < 0.001, et ****p < 0,0001

De plus, le protocole NP3 (Fig. 2b, e) a démontré qu'il est possible de combiner les AuNPs à ALEXA afin que l'intensité de fluorescence détectée soit augmentée (***p < 0.001), permettant même le double de la dilution d'ALEXA sans que la fluorescence diminue par rapport à la dilution 1:400 initialement testée sur A1 ( # p> 0,05).

Enfin, nous avons comparé les groupes malades aux groupes sains (Fig. 2f) pour démontrer que tous les protocoles testés, que ce soit avec ALEXA ou avec AuNPs, sont efficaces pour détecter l'apparition de processus inflammatoires caractérisés par les antigènes COX-2 et MIF. Les figures 3 et 4 corroborent les données présentées graphiquement sur la figure 2. ALEXA et AuNPs sont représentés en vert, dont la distribution correspond aux sites d'infiltration accrue de leucocytes et de lésions tissulaires.

Images anti-COX-2 IF d'échantillons de côlon de la solution saline (contrôle négatif) et des groupes UC induits par l'acide acétique colorés avec des composés fluorescents verts (ALEXA, AuNPs ou les deux) et DAPI (bleu) pour les noyaux. un Contrôle négatif coloré au protocole standard ALEXA (A1) avec anti-COX-2 et ALEXA (vert). b Contrôle négatif coloré avec le protocole ALEXA modifié (A2) avec anti-COX-2 et ALEXA. c Contrôle négatif coloré avec le protocole nanoparticulaire 1 (NP1) avec anti-COX-2 et AuNPs (vert) au lieu d'ALEXA. d Contrôle négatif coloré avec le protocole nanoparticulaire 2 (NP2) avec anti-COX-2 et AuNPs au lieu d'ALEXA. e Contrôle positif coloré au A1. f Contrôle positif coloré au A2. g Contrôle positif coloré au NP1. h Contrôle positif coloré au NP2. je Contrôle positif coloré avec protocole nanoparticule (NP3) avec anti-COX-2 + AuNPs avec 1:200 ALEXA. j Contrôle positif coloré au NP3 (avec dilution 1:400 d'ALEXA). k Contrôle positif UC coloré au NP3 (avec dilution 1:800 d'ALEXA). Grossissements, × 200. Barre d'échelle = 50 μm

Images anti-MIF IF d'échantillons de foie des groupes salin (contrôle négatif) et stéatohépatite induite par l'alcool colorées avec des composés fluorescents verts (ALEXA, AuNPs ou les deux) et DAPI (bleu) pour les noyaux. un Contrôle négatif coloré au protocole standard ALEXA (A1) avec anti-MIF et ALEXA (vert). b Contrôle négatif coloré avec protocole modifié ALEXA (A2) avec anti-MIF et ALEXA. c Contrôle négatif coloré avec le protocole nanoparticulaire 1 (NP1) avec anti-MIF et AuNPs (vert) à la place d'ALEXA. d Contrôle négatif coloré avec le protocole nanoparticulaire 2 (NP2) avec anti-MIF et AuNPs à la place d'ALEXA. e Contrôle positif coloré au A1. f Contrôle positif coloré au A2. g Contrôle positif coloré au NP1. h Contrôle positif coloré au NP2. je Contrôle positif coloré avec nanoparticle protocol 3 (NP3) avec anti-MIF + AuNPs avec 1:200 ALEXA. j Contrôle positif coloré au NP3 avec une dilution 1:400 d'ALEXA. k Contrôle positif coloré au NP3 avec une dilution 1:800 d'ALEXA. Grossissements, × 200. Barre d'échelle = 50 μm

En termes d'application clinique, le protocole NP1 s'est avéré le plus prometteur, puisque, comparé au protocole A1 standard, il permet une économie de 18 h.

Cytométrie en flux :Macrophages M2 marqués par des nanoparticules d'or conjuguées à un anticorps primaire (AuNP)

Pour caractériser davantage les macrophages M2, l'expression des fabricants liés à M1 (CD86) et M2 (CD163) dans les cellules RAW 264.7 stimulées par l'IL-4 a été analysée en cytométrie de flux. Les résultats de la cytométrie en flux ont montré que les marqueurs liés à M2 tels que le récepteur CD163 étaient significativement plus élevés que la cellule native (Fig. 5a, c, p < 0,001) tandis que l'expression du récepteur CD86 n'a montré aucune différence entre les macrophages M2 et les cellules naïves (Fig. 5b, c, p> 0,05). Les résultats suggèrent que l'IL-4 (20  ng/ml) a induit avec succès l'altération des macrophages classiques en macrophages M2. Après cette étape, les macrophages M2 ont été incubés avec des anticorps primaires COX-2 et MIF, puis marqués avec des AuNPs pour comparer l'efficacité des nanoparticules d'or conjuguées aux anticorps primaires (AuNPs) au protocole standard (ALEXA). Les résultats ont montré que les nanoparticules d'or conjuguées aux anticorps COX-2 et MIF (Fig. 5d, f, p < 0.001) ou ALEXA (Fig. 5e, f, p < 0.001) a montré une intensité de fluorescence plus élevée dans les macrophages M2 par rapport aux échantillons non colorés.

Les nanoparticules d'or conjuguées aux anticorps COX-2 et MIF (AuNPs) ont une affinité élevée à la surface des macrophages M2. unc Les cellules RAW 264.7 ont été stimulées avec de l'IL-4 (20 ng/ml) pendant 24h, suivies d'une analyse par cytométrie en flux pour quantifier la quantité de CD163, un marqueur macrophage M2, et de CD86, un marqueur M1. d , f Soit des nanoparticules d'or conjuguées à des anticorps COX-2 et MIF, soit e , f ALEXA 488 a montré une intensité de fluorescence plus élevée dans les macrophages M2 par rapport aux échantillons non colorés. Les données sont exprimées en moyenne  ± SD, # p> 0,05, ****p < 0.001, p < 0,0001. Les données de flux représentatives présentées proviennent d'expériences réalisées indépendamment au moins trois fois

Spectroscopie de fluorescence

Afin de mesurer les spectres d'émission de fluorescence pour les AuNPs purifiés en l'absence et en présence d'anti-COX-2 (Fig. 6a), d'anti-MIF (Fig. 6b) et d'ALEXA (Fig. 6c), la longueur d'onde d'excitation a été fixée à 320 nm et l'émission a été enregistrée dans la plage de 650 à 900  nm. Une augmentation de la longueur d'onde d'excitation n'a pas modifié la plage d'émission des particules, excluant ainsi la possibilité d'un processus de diffusion. Les émissions de fluorescence ont été légèrement augmentées avec l'absorption d'anti-COX-2 (augmentation de 11,93 unités d'absorbance (au) pour la concentration d'anticorps la plus élevée), anti-MIF (augmentation de 12,15 au pour la concentration d'anticorps la plus élevée) et ALEXA (augmentation de 3,18 au pour la concentration d'anticorps la plus élevée) en combinaison avec des AuNP.

Spectres d'émission de fluorescence d'AuNPs excités à 320 nm en présence d'anti-COX-2 (a ), anti-MIF (b ), et ALEXA (c ). L'image MET des nanoparticules sphériques utilisées dans cette étude, montrant sa taille et sa distribution (d ). Les fentes d'excitation et d'émission étaient de 10 nm. La concentration d'AuNPs a été maintenue constante à 29,6  ng/ml −1 . Les concentrations d'anticorps sont de 100 ng/ml −1 (courbe bleue), 150 ng/ml −1 (courbe rouge), et 200 ng/ml −1 (courbe verte)

Discussion

Il a été démontré que les AuNPs ont des propriétés de fluorescence, en raison de leur structure chimique et de leur taille, et peuvent agir comme des molécules amplificatrices de signaux fluorescents. Plus précisément, la fluorescence AuNP elle-même provient d'interactions aurophiles à la surface des atomes d'or [17, 18]. Les données de la figure 6 sont similaires aux conclusions d'études sur les nanoparticules d'argent, qui doivent l'augmentation de l'émission de fluorescence à la compétition entre les espèces adsorbantes et l'oxygène moléculaire dissous dans la solution. Par conséquent, l'émission de fluorescence accrue des nanoparticules d'or pourrait être attribuée au fait que la BSA est adsorbée à leur surface [19].

Le signal de fluorescence est fonction du phénomène de résonance plasmonique de surface (SPR). Par conséquent, l'augmentation de la quantité d'électrons libres conduit à un signal SPR plus intense, puisque SPR est l'oscillation collective des électrons libres. La BSA adsorbée empêche les électrons libres de surface de se lier aux molécules d'oxygène, ce qui entraîne une augmentation du signal de fluorescence [20, 21]. Anti-COX-2, anti-MIF et ALEXA peuvent avoir été adsorbés sur les AuNPs, empêchant ainsi O2 d'atteindre la surface des nanoparticules. Ceci est soutenu par la figure 6, où l'augmentation du signal de fluorescence s'est produite à de très faibles concentrations des différents anticorps. Il convient de noter, cependant, qu'ALEXA avait besoin d'une concentration plus élevée pour provoquer O2 isolement de la surface des AuNPs.

Le processus d'inflammation chronique est caractérisé par l'infiltration de cellules immunitaires, principalement des macrophages, sur les sites de lésion causés par l'acide acétique ou l'éthanol dans le modèle respectif. L'inflammation est également caractérisée par la libération dépendante des leucocytes de plusieurs cytokines et médiateurs en réponse à un agent pathogène ou à un état de stress. Parmi ces cytokines, la COX-2 et le MIF sont connus pour être des marqueurs de plusieurs processus inflammatoires, car ce sont des cytokines pro-inflammatoires. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

Conclusions

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.

Abréviations

A1:

ALEXA standard protocol

A2:

ALEXA modified protocol

ALD:

Alcoholic liver disease

ALEXA:

Alexa Fluor® 488®

AuNP:

Nanoparticules d'or

BSA :

Sérum albumine bovine

COX-2:

Cyclooxygenase-2

FC:

Cytométrie en flux

FI:

Fluorescence imaging

IF:

Immunofluorescence

MDA:

Malondialdehyde

MIF:

Macrophage migration inhibitory factor

NP1:

Nanoparticles protocol 1

NP2

Nanoparticles protocol 2

NP3:

Nanoparticles protocol 3

SPR :

Résonance plasmonique de surface

UC:

Ulcerative colitis


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