Cytotoxicité dépendante de la forme et absorption cellulaire des nanoparticules d'or synthétisées à l'aide d'extrait de thé vert

Introduction

Les plantes contiennent des métabolites naturels primaires et secondaires, notamment des flavonoïdes, des saponines, des alcaloïdes, des stéroïdes, des coumarines, des tanins, des phénols, des terpénoïdes, des glucides, des protéines et des acides aminés. Récemment, des extraits de plantes ont été utilisés pour la synthèse de nanomatériaux, en particulier de nanoparticules métalliques telles que les nanoparticules d'or, d'argent, d'oxyde de titane, de cuivre, de palladium, d'oxyde de zinc et de platine [1]. Divers composés phytochimiques participent activement à la conversion des sels métalliques en nanoparticules métalliques en tant qu'agents réducteurs. De plus, les extraits de plantes jouent un rôle d'agents stabilisants pour maintenir la stabilité colloïdale des nanoparticules métalliques en solution. Les agents réducteurs chimiques sont généralement nocifs et toxiques pour les organismes vivants. En revanche, l'utilisation d'extraits de plantes dans la synthèse de nanoparticules métalliques est verte, écologique et durable. Diverses parties de la plante, telles que les tiges, les fruits, les graines, les feuilles et les fleurs, sont utilisées pour synthétiser des nanoparticules métalliques [1, 2]. Des revues approfondies ont étudié la synthèse verte de nanoparticules d'or (AuNP) en utilisant des extraits de plantes comme agents réducteurs [2,3,4]. En utilisant cette stratégie verte, l'étape de synthèse est réalisée en une seule étape et dans un seul pot. De plus, le processus est simple, facile, rentable et respectueux de l'environnement. La taille, la forme et la topographie des AuNP dépendent des concentrations de sels et d'extraits d'or, du temps de réaction, de la température de réaction et du pH de la solution. Des techniques spectroscopiques et microscopiques sont utilisées pour caractériser les AuNP, notamment la spectrophotométrie UV-visible, la diffraction des rayons X, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), la microscopie électronique à transmission (TEM), la microscopie à force atomique (AFM), la microscopie électronique à balayage ( SEM) et mesures hydrodynamiques de la taille et du potentiel zêta. Ces AuNP vertes sont utilisées comme catalyseurs, antioxydants et agents antimicrobiens et anticancéreux [5,6,7,8].

Dans le laboratoire des auteurs, des extraits de plantes (Artemisia capillaris , Leonurus japonicus , Polygala tenuifolia , Caesalpinia sappan , Bupleurum falcatum , et Garcinia mangostana ) ont été utilisés comme agents réducteurs pour synthétiser en vert à la fois les AuNPs et les nanoparticules d'argent (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. La partie aérienne de A. capillaires a été extrait et utilisé pour la synthèse d'AgNPs et d'AuNPs [9, 15, 16]. Les AgNPs préparés ont exercé une excellente activité antibactérienne contre Escherichia coli , Enterobacter cloacae , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella aerogenes , et Klebsiella oxytoca comparée à celle de l'extrait seul [15]. Ce résultat a indiqué que l'effet synergique de la combinaison des AgNPs et de l'extrait a contribué à une activité antibactérienne améliorée. Fait intéressant, les AgNPs synthétisés en utilisant A. capillaires en présence de bromure de cétyltriméthylammonium a présenté une activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline [16]. De plus, les AuNP synthétisés à l'aide de A. capillaires ont montré une activité catalytique vers la réaction de réduction du 4-nitrophénol [9]. L. japonicus extrait a été utilisé pour la synthèse d'AgNPs présentant des améliorations remarquables de l'activité antibactérienne [10]. Nous avons observé que l'activité antibactérienne contre les bactéries Gram-négatives était supérieure à celle contre les bactéries Gram-positives. L'extrait de racine de P. tenuifolia a également été utilisé pour la synthèse des AuNPs et des AgNPs [11, 17]. Une activité anticoagulante et une activité antibactérienne accrues ont été observées dans les AuNPs et les AgNPs, respectivement, synthétisés à l'aide de P. tenuifolia extrait. Plus intéressant encore, les AgNPs synthétisés en utilisant C. sappan l'extrait a montré une activité antibactérienne efficace contre S. aureus [18]. L'extrait de G. mangoustan produit des AgNPs asymétriques en forme d'haltère avec des effets apoptotiques [14].

Des rapports antérieurs ont examiné la synthèse verte des AuNPs et des AgNPs à l'aide d'extraits de feuilles de thé [19,20,21,22,23]. Kamal et ses collègues ont rapporté la synthèse réussie de 25 nm-AgNPs [19]. Dans un autre rapport, des AgNPs sphériques mesurant de 20 à 90  nm ont été synthétisés à l'aide d'extrait de feuille de thé [20]. Les AgNPs synthétisés ont montré une légère activité antibactérienne contre E. coli . Des AgNPs sphériques mesurant 3,42 ~ 4,06  nm ont également été préparés par Loo et ses collègues à l'aide d'extrait de feuille de thé [21]. Vaseharan et ses collègues ont synthétisé des AgNP antibactériens à l'aide d'extraits de feuilles de thé [22]. Les AgNPs synthétisés étaient efficaces contre le pathogène Vibrio harveyi infection. Begum et ses collègues ont utilisé un extrait de feuille de thé noir pour synthétiser à la fois les AuNP et les AgNP [23]. À ce jour, la plupart des AgNPs sphériques ont été synthétisés à l'aide d'extrait de feuilles de thé.

Dans le présent rapport, le chitosane a été utilisé comme agent de coiffage pour les AuNP. Le chitosan a été exploré en tant que véhicule d'administration de médicaments/gènes en raison de sa biocompatibilité élevée, de sa faible allergénicité, de sa biodégradabilité et de sa faible toxicité [24,25,26]. Le chitosan provient de la chitine, qui est abondante dans les exosquelettes des insectes et des crustacés tels que les crabes, les homards et les crevettes. La chitine est un polysaccharide composé de N -acétyl-D-glucosamine liée par des liaisons glycosidiques (1-4). Le chitosane peut être obtenu à partir de la chitine par un N hétérogène -processus de désacétylation. Le chitosan lui-même possède une activité antibactérienne, antifongique, antitumorale et antioxydante [25]. En tant qu'agent de coiffage, le chitosane contacte directement les AuNPs via un mécanisme électrostérique [26]. Les nanoparticules de chitosane affectent le mécanisme de captation cellulaire par les cellules A549 sans modifier la cytotoxicité [24]. De plus, le degré de désacétylation du chitosane est plus influent que le poids moléculaire sur l'absorption cellulaire et la cytotoxicité [24].

La plupart des études se sont concentrées sur la synthèse d'AgNPs sphériques à l'aide d'extraits de feuilles de thé. Ici, l'extrait de feuille de thé vert a été utilisé pour synthétiser des nanosphères et des nanostars d'or. Les nanosphères ont été utilisées comme graines pour la synthèse à médiation par les graines de nanostars. A titre de comparaison, les nanotiges ont été synthétisées par une méthode conventionnelle commune [27]. Trois formes différentes d'AuNPs (nanosphères, nanoétoiles et nanotiges) ont été coiffées de chitosane pour augmenter leur biocompatibilité et leur stabilité colloïdale. Ces AuNPs ont été caractérisés par spectrophotométrie UV-visible, microscopie électronique à transmission à haute résolution (HR-TEM) et FT-IR. Les mesures hydrodynamiques de la taille effectuées par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les mesures du potentiel zêta ont été effectuées avant et après le coiffage au chitosane. La stabilité colloïdale a été évaluée dans les solutions salines, le tampon et le milieu de culture cellulaire. Pour mesurer la cytotoxicité, le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été appliqué à quatre cellules cancéreuses :AGS (cellules d'adénocarcinome gastrique humain), HeLa (adénocarcinome épithélial humain du col de l'utérus cellules), HepG2 (cellules de carcinome hépatocytaire humain) et HT29 (cellules d'adénocarcinome colorectal humain). L'absorption cellulaire des AuNP dans les cellules HepG2 a été mesurée quantitativement par spectroscopie d'émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) et par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS).

Matériaux et méthodes

Matériaux et instrumentation

Acide chloroaurique trihydraté (HAuCl₄ ·3H₂ O), le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), le chitosane (issu de carapaces de crevettes, 75 % désacétylé) et le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis). Tous les autres réactifs sont de qualité analytique. Un spectrophotomètre Shimadzu UV-1800 ou UV-2600 a été utilisé pour acquérir des spectres UV-visible dans une cuvette en quartz (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japon). Des mesures de taille hydrodynamiques effectuées par DLS et des mesures de potentiel zêta ont été effectuées à l'aide d'un NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA). Un Varian 640 IR a été utilisé pour acquérir les spectres FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); l'échantillon mesuré a été préparé par la méthode du disque KBr. Les images HR-TEM ont été capturées à l'aide d'un JEM-3010 fonctionnant à 300 kV (JEOL, Tokyo, Japon) ; l'échantillon a été chargé sur une grille de cuivre recouverte de carbone (carbone de type B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA) et laissé sécher au four à 37°C pendant 24h. Pour la sonication, un modèle WUC-A22H a été utilisé (Daihan Scientific Co. LTD., Séoul, République de Corée). Une centrifugeuse 5424R (Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne) et une FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, République de Corée) ont été utilisées pour la centrifugation et la lyophilisation, respectivement. Pour l'absorption cellulaire des AuNP, un Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) et un J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, USA) ont été utilisés.

Préparation d'extrait de thé vert

L'Institut du thé vert de Hadong (Hadong, Gyeongnam, République de Corée) a gracieusement offert des feuilles de thé vert séchées. Un mélangeur a été utilisé pour préparer des poudres de feuilles séchées. L'extraction a été réalisée en mélangeant de l'eau déminéralisée (2 L) et des feuilles en poudre (200 g). On a laissé l'extraction se dérouler pendant 1 h par sonication à température ambiante avec trois répétitions. Des papiers filtres Whatman ont été utilisés pour filtrer les fractions d'eau afin d'éliminer les matières insolubles. Ensuite, le filtrat a été centrifugé (3 000g force, 18 °C, 25 min), et le surnageant a été récupéré. Le surnageant recueilli a été filtré à la seringue et le filtrat a été lyophilisé. Le matériau lyophilisé a été dissous dans de l'eau désionisée pour créer une solution mère avec une concentration finale de 2 % (p/v ) pour la synthèse verte décrite dans la section suivante.

Synthèse de nanosphères d'or à l'aide d'extrait

Le processus de synthèse des nanosphères est illustré sur la figure 1a. La solution mère décrite dans la section précédente a été utilisée pour la synthèse. Dans un flacon en verre, l'extrait (concentration finale de 0,03 %) et l'acide chloroaurique trihydraté (concentration finale de 0,5 µmM) ont été mélangés, et de l'hydroxyde de sodium (concentration finale de 1 µmM) a été ajouté. De l'eau déminéralisée a été ajoutée pour obtenir un volume final de 2 µmL. L'incubation au four a été réalisée dans un four sec à 80°C pendant 2h. La résonance plasmonique de surface (SPR) des nanosphères a été surveillée en acquérant des spectres UV-visible sur la plage de 300 à 800  nm. Les nanosphères ont également été utilisées comme graines pour la synthèse des nanoétoiles décrites dans la section suivante.

Synthèse de nanosphères d'or. un Un diagramme schématique du processus de synthèse et b Spectres UV-visible de nanosphères avant et après coiffage de chitosane. Une photographie numérique montre des nanosphères immédiatement après la synthèse

Synthèse de nanoétoiles d'or

Le processus de synthèse de nanostar est illustré sur la figure 2a. Les nanosphères (50 μL) synthétisées comme décrit dans la section précédente ont été agitées (750 rpm) avec un barreau magnétique sur une plaque chauffante à température ambiante. De l'acide chloroaurique trihydraté (0,25 mM, 5 mL) a été ajouté à cette solution. Après 15 s, deux solutions ont été ajoutées simultanément :du nitrate d'argent (1 mM, 50 μL) et de l'acide ascorbique (fraîchement préparé, 100 mM, 25 μL). Ensuite, le mélange a été agité à 750 rpm pendant 5 min. Les spectres UV-visible ont été acquis sur la plage de 300 à 1 100  nm.

Synthèse de nanoétoiles d'or. un Un diagramme schématique du processus de synthèse et b Spectres UV-visible de nanostars avant et après coiffage de chitosane. Une photographie numérique montre des nanoétoiles immédiatement après la synthèse

Synthèse de nanotiges d'or

Le processus de synthèse des nanotiges est illustré sur la figure 3a. Pour la synthèse de nanotiges d'or, la synthèse à médiation par les semences a été réalisée selon un rapport précédent avec des modifications mineures [27]. La solution de croissance a été préparée comme suit. Dans un flacon en verre de 20 mL, de l'acide chloroaurique trihydraté (10 mM, 500 μL) et du bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) ont été mélangés. La solution était brun jaunâtre. Ensuite, de l'acide ascorbique (fraîchement préparé, 100 mM, 55  μL) a été ajouté, et cette solution a été agitée jusqu'à ce qu'elle passe du brun jaunâtre à l'incolore. Du nitrate d'argent (10 mM, 100  μL) a été ajouté et agité pendant 10 s. Cette solution finale a été qualifiée de solution de croissance. La solution d'ensemencement a été synthétisée comme suit. Dans un flacon en verre de 20 mL, l'acide chloroaurique trihydraté (10 mM, 250 μL) et le CTAB (100 mM, 9,75 mL) ont été mélangés. Ensuite, du borohydrure de sodium fraîchement préparé (10 mM, 600  μL) a été ajouté et vortexé pendant 2 min. La solution a été étiquetée solution d'ensemencement. La solution d'ensemencement (12 μL) a été mélangée avec une solution de croissance synthétisée précédemment. Les spectres UV-visible ont été acquis sur la plage de 400 à 900  nm.

Synthèse de nanotiges d'or. un Un diagramme schématique du processus de synthèse et b Spectres UV-visible de nanotiges avant et après coiffage de chitosane. Une photographie numérique montre des nanotiges immédiatement après la synthèse

Coiffage au chitosan de nanosphères, nanoétoiles et nanotiges

Le coiffage au chitosane a été utilisé pour augmenter la stabilité colloïdale et la biocompatibilité des AuNPs. Le chitosane a été dissous dans 1 % d'acide acétique et la concentration finale a été ajustée à 0,01 %. Ensuite, une sonication a été effectuée pour dissoudre complètement le chitosane; cette solution a été utilisée comme solution mère pour le coiffage de chitosane dans la procédure suivante. Les nanosphères et les nanostars qui ont été précédemment synthétisées ont été coiffées avec la solution mère de chitosane (0,01 %). La solution mère de chitosane (30 %, v/v ) a été mélangé avec la solution AuNP (70 %, v/v ). Le mélange a été agité à 900 rpm pendant 2 h pour terminer le coiffage au chitosane. Pour les nanotiges, un excès de CTAB a été utilisé, et ainsi, une centrifugation (14 000 rpm, 15 min, 25°C) a été effectuée pour éliminer le CTAB. Les nanotiges ont été récupérées du culot et le coiffage au chitosane a été réalisé comme mentionné ci-dessus. Ensuite, les spectres UV-visible ont été acquis.

Évaluation de la stabilité des colloïdes

La stabilité colloïdale des AuNPs est importante pour les applications in vitro et in vivo. Les trois types d'AuNPs avec coiffage de chitosane et de nanosphères sans coiffage de chitosane ont été évalués pour la stabilité colloïdale dans les solutions suivantes :eau déminéralisée, 5 % d'albumine de sérum bovin (BSA), 5 % de NaCl, PBS (pH 7,4), milieu Eagle modifié de Dulbecco ( DMEM) et milieu complet. Le milieu complet était du DMEM contenant 10 % de sérum bovin foetal (FBS). Un millilitre de chaque type de solution AuNP a été mélangé avec la solution de test comme mentionné ci-dessus (0,5  mL). Le mélange a été incubé à 25 °C pendant 30 min, et les spectres UV-visible ont été acquis.

Culture cellulaire et cytotoxicité

Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été achetées auprès de la Korean Cell Line Bank (Séoul, République de Corée) :AGS, HeLa, HepG2 et HT29. Le test MTT a été réalisé pour évaluer la cytotoxicité in vitro des AuNPs. Du DMEM contenant du pyruvate de sodium a été utilisé. Le milieu de culture cellulaire contenait 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM L-glutamine, 1 % de pénicilline (100   unités/mL) et de la streptomycine (100   unités/mL). Les cellules ont été cultivées dans des boîtes de culture de 100 um et maintenues à environ 70 % de confluence. Avant la culture cellulaire, les AuNP de trois formes différentes ont été soumises à une évaporation sous vide pour obtenir une concentration finale en Au de 5 mM. Sur des plaques 96 puits, les cellules ont été ensemencées à une densité de 5,0 × 10 ³ cellules/puits, et l'incubation a été menée pendant 24 h dans une étuve à 37 °C sous un CO₂ (5 %) atmosphère. Ensuite, cinq concentrations différentes d'AuNPs (500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM et 31,25 μM) ont été traitées et incubées au four pendant 24 h supplémentaires à 37 °C sous CO₂ (5 %) atmosphère. Ensuite, le réactif MTT (5 μL, 5% dans de l'eau déminéralisée) a été ajouté et incubé dans un four à 37 °C sous un CO₂ (5 %) atmosphère pendant 3  h supplémentaires. L'absorbance a été mesurée à 570 nm en utilisant un lecteur multi-détection à fluorescence (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Des cellules non traitées ont été utilisées comme contrôle.

Captation cellulaire

L'absorption cellulaire de chaque type d'AuNP a été mesurée quantitativement à l'aide de cellules HepG2. Sur des plaques 24 puits, les cellules ont été ensemencées à une densité de 5,0 × 10 ⁴ cellules/puits, et l'incubation a été menée pendant 24 h dans une étuve à 37 °C sous un CO₂ (5 %) atmosphère. Ensuite, 5 μM (concentration finale) de chaque type de solution AuNP ont été traités et incubés dans le four pendant 24 h supplémentaires à 37 °C sous un CO₂ (5 %) atmosphère. Après incubation, la solution contenant les AuNPs en excès a été retirée et les cellules ont été traitées avec de la trypsine. La concentration d'Au dans les cellules trypsinisées a été mesurée quantitativement par ICP-OES et LA-ICP-MS, qui ont fourni la concentration d'absorption d'Au dans les cellules. Le contrôle était constitué de 5  μM de la solution colloïdale originale de chaque type d'AuNP, qui a également été analysée par ICP-OES et LA-ICP-MS pour obtenir la concentration en Au.

Résultats et discussion

Spectres UV-visibles

Les spectres UV-visible sont couramment acquis pour confirmer la synthèse des AuNPs. Le SPR caractéristique des AuNPs peut être observé dans la gamme de longueurs d'onde visible-proche infrarouge. De plus, le coiffage des AuNPs induit généralement soit un décalage bathochrome (ou rouge) soit un décalage hypsochrome (ou bleu). De plus, un décalage hypochrome est généralement induit en même temps que des décalages vers le rouge et le bleu. Comme le montre la figure 1b, les spectres UV-visible ont été surveillés sur une plage de 300 à 800  nm. Les nanosphères ont montré un SPR caractéristique de 532  nm avec une couleur bordeaux foncé. Après le coiffage des nanosphères par le chitosane, le SPR maximum a été décalé vers le rouge à 537  nm avec un décalage hypochrome (Fig. 1b). Une large gamme de longueurs d'onde SPR (600 ~ 800  nm) avec une solution bleu foncé a été observée pour les nanoétoiles (Fig. 2b). Le coiffage chitosan des nanostars a montré un décalage hypochrome, où l'absorbance était inférieure à celle des AuNPs sans coiffage chitosan (Fig. 2b). Les nanotiges ont montré deux longueurs d'onde SPR distinctes de 514 nm et 815 nm, avec la formation d'une solution rose clair (Fig. 3b). Le coiffage des nanotiges en chitosane a induit un décalage vers le bleu à 797  nm ainsi qu'un décalage hypochrome (Fig. 3b). Compte tenu de tous ces résultats, le coiffage des AuNPs avec du chitosane a modifié la longueur d'onde SPR et induit des décalages. Un examen attentif des spectres UV-visible a démontré que les trois types d'AuNP ont été coiffés avec succès avec du chitosane.

Taille hydrodynamique et potentiels zêta

Ensuite, la taille hydrodynamique et les potentiels zêta ont été mesurés; les résultats sont présentés dans le tableau 1. Sans coiffage de chitosane, les tailles hydrodynamiques des nanosphères et des nanostars étaient respectivement de 28,4 et 97,8  nm. La taille hydrodynamique des nanotiges n'a pas été mesurée car la taille hydrodynamique était bien ajustée aux formes sphériques des nanoparticules. Avec le coiffage de chitosane, la taille hydrodynamique a été augmentée à 190,7 nm pour les nanosphères et à 123,9  nm pour les nanostars. Le coiffage au chitosane a été confirmé par une augmentation de la taille hydrodynamique. Le changement des potentiels zêta reflétait également le plafonnement du chitosane à la surface des AuNPs. Le chitosan est un polysaccharide chargé positivement; ainsi, le coiffage du chitosane a entraîné des potentiels zêta positifs pour les trois types d'AuNP. Pour les nanosphères, le potentiel zêta a été modifié de - 12,73 à 42,28 mV. Le potentiel zêta des nanostars a été modifié de - 42,46 à 47,44 nm. Dans le cas des nanotiges, CTAB (un tensioactif cationique) a été utilisé pour la synthèse. Ainsi, le potentiel zêta d'origine était de 27,96  mV sans plafonnement. Le coiffage des nanotiges au chitosane a augmenté le potentiel zêta à 33,23  nm. Par conséquent, le changement des potentiels zêta de valeurs négatives à positives pour les nanosphères et les nanoétoiles indiquait clairement un coiffage réussi avec du chitosane. De plus, le potentiel zêta des nanotiges a augmenté, suggérant que la surface était recouverte de chitosane.

Images HR-TEM

La microscopie est cruciale pour la recherche sur les nanoparticules, fournissant des informations essentielles sur la taille et la forme des nanoparticules. Les outils de microscopie fournissent une gamme d'informations détaillées, telles que l'état de dispersion, la morphologie et la topographie en deux et trois dimensions, et la douceur/dureté relative des matériaux. Les nanosphères mesuraient 8,7 ± 1,7 nm, sur la base de la moyenne de 75 nanoparticules discrètes sélectionnées au hasard dans les images HR-TEM (Fig. 4). La taille la plus abondante était de 8~9 nm (29,3 %), suivie de 9~10 nm (12,0 %). Avec le coiffage au chitosane, la forme des nanosphères a été conservée sans aucun changement de forme (Fig. 4c, d). La nature cristalline des particules a été clairement indiquée par les structures en réseau illustrées à la figure 4d. La distance entre les réseaux voisins a été mesurée à 0,24  nm (Fig. 4d). De plus, la couche de chitosane a également été visualisée, comme indiqué par les flèches rouges sur la figure 4d. Les nanoétoiles ont été visualisées par HR-TEM, comme le montre la figure 5. Les nanoétoiles mesuraient 99,0 ± 47,0 nm, représentant la moyenne de 19 nanoparticules discrètes. La structure du réseau est indiquée sur une image agrandie (Fig. 5c). Comme indiqué, la distance entre les réseaux voisins a été mesurée à 0,24  nm (Fig. 5c). Les flèches rouges de la Fig. 5c indiquent la couche de chitosane. Les nanotiges ont été visualisées comme le montre la figure 6. La longueur et la largeur moyennes des particules étaient respectivement de 60,4 nm et 16,4 nm, selon les mesures effectuées pour 28 particules. Le rapport hauteur/largeur, défini comme la longueur des particules divisée par la largeur des particules, était de 3,7. La structure du réseau est illustrée à la Fig. 6c, confirmant la structure cristalline des nanotiges. La distance entre les réseaux voisins a été mesurée à 0,23  nm (Fig. 6c). Les flèches rouges indiquent la couche de chitosane (Fig. 6c).

Images HR-TEM de nanosphères d'or. Les barres d'échelle représentent a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm et d 5 nm. Images a et b ont été obtenus sans coiffage de chitosane, et c et d ont été obtenus avec coiffage de chitosane. La distance entre les réseaux voisins a été mesurée à 0,24 nm. Les flèches rouges indiquent la couche de chitosane après capsulage

Images HR-TEM de nanoétoiles en or. Les barres d'échelle représentent a 200 nm, b 50 nm et c 5 nm. d Une représentation schématique de nanostars avec une taille moyenne de 99,0 ± 47,0 nm. Image a a été obtenu sans coiffage de chitosane, et b et c ont été obtenus avec coiffage de chitosane. La distance entre les réseaux voisins a été mesurée à 0,24 nm. Les flèches rouges indiquent la couche de chitosane après capsulage

Images HR-TEM de nanotiges d'or. Les barres d'échelle représentent a 100 nm, b 200 nm et c 5 nm. d Une représentation schématique de nanotiges d'une longueur et d'une largeur moyennes de 60,4 nm et 16,4 nm, respectivement. Image a a été obtenu sans coiffage de chitosane, et b et c ont été obtenus avec coiffage de chitosane. La distance entre les réseaux voisins a été mesurée à 0,23 nm. Les flèches rouges indiquent la couche de chitosane après capsulage

Spectres FT-IR

Le thé vert contient divers métabolites primaires et secondaires. Plus précisément, les principaux constituants du thé vert sont les polyphénols, notamment l'épigallocatéchine-3-gallate, le (-)-épicatéchine-3-gallate, la (-)-épigallocatéchine et la (-)-épicatéchine [28]. Les spectres FT-IR ont été acquis pour obtenir des informations sur les groupes fonctionnels qui ont contribué à la synthèse des AuNPs. Nous avons comparé le spectre FT-IR des nanosphères avec le spectre de l'extrait (Fig. 7). Le groupe fonctionnel principal qui était le plus probablement impliqué dans la réaction de réduction des sels d'Au était -OH. Dans l'extrait, des groupes fonctionnels -OH sont apparus à 3255 cm ⁻¹ (Fig. 7a). Lors de la synthèse, ce pic a été déplacé vers un nombre d'onde plus élevé à 3300~3341 cm ⁻¹ . Ce résultat a démontré que les groupes fonctionnels -OH provenaient de polyphénols oxydés en C =O tout en réduisant les sels d'Au en AuNP. Remarquablement, l'apparition de groupes fonctionnels C=O à 1716 cm ⁻¹ dans les nanosphères a clairement soutenu l'oxydation des groupes fonctionnels -OH pendant la synthèse (Fig. 7b).

Spectres FT-IR de a extrait de thé vert utilisé pour la synthèse et b nanosphères d'or

Évaluation de la stabilité colloïdale sous diverses solutions

La stabilité colloïdale des nanoparticules est une préoccupation importante pour les applications diagnostiques et thérapeutiques. Six solutions différentes ont été testées pour la stabilité colloïdale :(i) eau déminéralisée, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7.4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM, et (vi ) milieu plein (DMEM avec 10 % de FBS). Après avoir mélangé chaque type d'AuNPs avec la solution de test, les spectres UV-visible ont été acquis ; les résultats sont présentés dans le tableau 2 et la figure 8. Un décalage hypochrome avec un léger décalage rouge ou bleu a été observé pour les trois types d'AuNP dans les spectres UV-visible (Fig. 8a, c et e). La forme des spectres a été conservée et aucune agrégation de la solution colloïdale n'a été observée (Fig. 8b, d et f). Ce résultat a démontré que la stabilité colloïdale était assez bien conservée dans les solutions d'essai mentionnées ci-dessus.

Évaluation de la stabilité colloïdale. un et b nanosphères coiffées de chitosane, c et d nanostars avec coiffage de chitosane, e et f nanotiges avec coiffage de chitosane, g et h nanosphères sans coiffage de chitosane. DW représente l'eau désionisée

Dans le tableau 2, le décalage hypochrome est exprimé en pourcentage d'absorbance conservée, l'absorbance de la solution d'origine étant fixée à 100 %. Dans les trois AuNPs, la stabilité colloïdale était mieux conservée dans le milieu complet, qui a été utilisé pour les expériences de cytotoxicité suivantes :nanosphères (65,3 %), nanostars (93,4 %) et nanotiges (80,2 %). La solution de protéine, BSA (5 %), a également fourni une stabilité colloïdale raisonnable :nanosphères (61,8 %), nanostars (70,2 %) et nanotiges (72,0 %). Ces résultats ont indiqué que les protéines qui recouvrent les nanoparticules ont d'autres effets bénéfiques sur la stabilité colloïdale des AuNPs ainsi que le coiffage du chitosane. La stabilité colloïdale des nanosphères sans coiffage de chitosane a également été évaluée (Fig. 8g, h). Toutes les solutions ont induit un décalage hypochrome. Parmi les solutions testées, seule la solution NaCl (5 %) a montré un grand décalage vers le rouge ainsi qu'un décalage hypochrome.

Cytotoxicité

Un test MTT a été réalisé pour mesurer la cytotoxicité contre quatre types de cellules cancéreuses (Fig. 9) :AGS, HeLa, HepG2 et HT29. La cytotoxicité des trois types d'AuNP dépendait de la concentration d'Au. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). un AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.

Conclusion

The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.

Abréviations

AFM :

Microscopie à force atomique

AgNPs:

Nanoparticules d'argent

AGS:

Human gastric adenocarcinoma cells

AuNPs:

Nanoparticules d'or

CTAB :

Bromure de cétyltriméthylammonium

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

FBS :

Sérum fœtal bovin

FT-IR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HeLa:

Human epithelial cervix adenocarcinoma cells

HepG2:

Human hepatocyte carcinoma cells

HR-TEM :

Microscopie électronique à transmission haute résolution

HT29:

Human colorectal adenocarcinoma cells

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

LA-ICP-MS:

Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry

SEM :

Microscopie électronique à balayage

SPR :

Résonance plasmonique de surface