Effets pro-apoptotiques améliorés des complexes dispersés dans l'eau de chimiothérapies à base de 4-thiazolidinone avec un nanosupport polymère contenant du PEG

Introduction

La chimiothérapie est la principale modalité de traitement pour de nombreuses tumeurs, et les médicaments chimiothérapeutiques sont choisis comme dernière option, en particulier dans les cas où le cancer s'est déjà propagé [1]. Cependant, les effets secondaires négatifs graves réduisent l'efficacité clinique de nombreux médicaments anticancéreux actuels. Par conséquent, il existe un besoin continu et crucial de développer des médicaments anticancéreux alternatifs ou synergiques avec des effets secondaires réduits ou minimes [2].

La faible solubilité dans l'eau des médicaments anticancéreux est un problème grave et répandu qui entrave leur développement et leur application clinique, et de nombreux agents chimiothérapeutiques hautement actifs et prometteurs ont été exclus en raison de leur faible solubilité dans l'eau [3]. Les tensioactifs et co-solvants sont utilisés à des concentrations élevées afin de solubiliser les agents anticancéreux insolubles dans l'eau; cependant, ces substances peuvent également produire des effets secondaires indésirables, limitant ainsi l'utilisation de nombreux médicaments anticancéreux [4].

Un grand défi pour le développement de médicaments pharmaceutiques est d'éliminer ou au moins de réduire les effets secondaires négatifs des médicaments hautement actifs, en particulier les agents antitumoraux démontrant une toxicité générale dans le corps qui restreint considérablement leur utilisation [5,6,7,8,9 ]. Un moyen efficace de surmonter ce problème consiste à utiliser un nanosupport multifonctionnel du médicament qui permettra aux agents antitumoraux toxiques de se lier au site de leur délivrance aux cellules ciblées dans des organes ou des tissus spécifiques [8, 10, 11]. La petite taille, la structure spécifique contrôlée, la grande surface et la forme des nanoparticules leur confèrent plusieurs avantages par rapport à d'autres matériaux [5, 8, 9]. Lors de l'utilisation de nanoparticules, il est possible d'optimiser l'efficacité, de minimiser les effets secondaires négatifs et d'améliorer la thérapie anticancéreuse [12, 13]. Ainsi, les médicaments qui ont échoué plus tôt en raison d'une toxicité générale élevée peuvent désormais obtenir une deuxième opportunité d'utilisation clinique, en raison de leur inclusion dans un système d'administration qui a amélioré la biodisponibilité et la libération contrôlée. De tels complexes vecteurs médicamenteux pénètrent plus facilement à travers les barrières naturelles telles que les barrières hémato-encéphalique ou les membranes des cellules individuelles. La grande surface des nanoparticules leur permet de former des complexes avec des biomolécules vectorielles spécifiques qui aident à l'administration du médicament à l'organe cible, conduisent à une réduction significative voire à l'élimination complète des effets secondaires négatifs, permettent une augmentation de la dose efficace minimale au cours d'une seule administration du médicament, améliorent l'efficacité de l'action du médicament et donnent un nouveau stimulus pour le développement d'une pharmacothérapie personnalisée. De plus, les nanoparticules peuvent encapsuler des molécules qui améliorent la solubilité, la stabilité et l'absorption de certains médicaments [11, 13, 14, 15]. Les systèmes d'administration de médicaments peuvent fournir une circulation prolongée d'un médicament dans le sang, la capacité du médicament à s'accumuler pendant le processus physiopathologique et la capacité de transférer efficacement la molécule de la substance active dans les cellules et les organites des cellules. Les nanoparticules doivent être stables, conserver leur structure chimique pendant un certain temps et, en même temps, être capables de biodégradation [16, 17].

Pour évaluer de nouveaux médicaments anticancéreux, il est important de mesurer leur activité cytotoxique et leur puissance à l'aide de diverses lignées cellulaires cancéreuses humaines cibles et de modèles tumoraux expérimentaux in vivo. La chimiothérapie échoue souvent en raison d'une déficience dans le processus d'apoptose qui joue un rôle central dans la mort cellulaire induite par les médicaments consécutive ou résultant d'un changement dans la tumorigenèse [18,19,20,21].

Étant donné que de nombreuses cellules malignes peuvent échapper à la mort par apoptose, une approche rationnelle doit être utilisée dans la conception et le développement de nouveaux médicaments anticancéreux. Les principaux objectifs de la création de nouveaux médicaments anticancéreux sont (1) de trouver des moyens de surmonter les mutations de cellules cancéreuses individuelles qui ont un impact sur les mécanismes indépendants d'action des médicaments ; et (2) concevoir des schémas de chimiothérapie capables de cibler simultanément des voies indépendantes. Une meilleure compréhension de la relation entre la génétique du cancer et la sensibilité au traitement est un enjeu clé pour le développement de nouveaux médicaments anticancéreux efficaces [22].

Dans des études précédentes, nous avons démontré que les dérivés synthétiques de la 4-thiazolidinone (Les-3288, Les-3833 et Les-3882) utilisent probablement des mécanismes d'action différents de ceux d'autres agents anticancéreux pour tuer le gliome C6 de rat et les cellules de glioblastome humain U251 in vitro, contrairement aux à la doxorubicine (Dox). Les-3288 n'a pas affecté de manière significative le niveau d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules traitées [23, 24]. Il convient de souligner que ces puissants agents antitumoraux ont montré une toxicité générale moindre dans le corps des animaux de laboratoire, comme le démontrent les paramètres biochimiques mesurés de leur action toxique dans les cellules tumorales et les animaux, par rapport à ceux de Dox [7, 8]. Ainsi, la liaison d'un médicament antitumoral avec un nanosupport polymère (PNC) et l'application du médicament sous la forme d'un système de distribution d'eau stable peuvent réduire les effets toxiques dans les organes des animaux, par rapport à l'action de ces substances sous une forme libre. 7, 8].

Le but de ce travail était d'étudier l'induction de l'apoptose dans des cellules de gliome de rat de la lignée C6 in vitro et in vivo par des formulations aqueuses de complexes de dérivés de 4-thiazolidinone avec un PNC contenant du PEG, et de comparer l'induction de l'apoptose à l'aide de ces dérivés. sous forme libre.

Matériaux et méthodes

Drogues anticancéreuses

Les dérivés hétérocycliques de 4-thiazolidinones (composés Les-3288 et Les-3833, Fig.1) ont été synthétisés au Département de chimie pharmaceutique, organique et bioorganique de l'Université nationale de médecine Danylo Halytsky Lviv, Ukraine, comme décrit précédemment [25].

Structure des composés étudiés—Les-3288 et Les-3833

Avant utilisation en culture cellulaire, ces composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, Arterium, Lviv, Ukraine). La solution a été en outre maintenue pendant 5 min dans un bain d'eau bouillante, et diluée dans de l'eau distillée afin d'atteindre les concentrations de travail. La concentration finale du DMSO dans le milieu de culture était inférieure à 0,1 %. Dox a été acheté dans une pharmacie locale auprès d'un représentant de Pfizer (Italie) en Ukraine.

Nanoporteur polymère

Le PNC pour l'administration de médicaments a été synthétisé au Département de chimie organique de l'Université nationale polytechnique de Lviv, en Ukraine, en utilisant une méthodologie décrite précédemment [26, 27]. Synthèse de poly(VEP-co -GMA)-greffon-PEG a été réalisé via les étapes suivantes comme suit. Poly(VEP-co -GMA) a été synthétisé par copolymérisation radicalaire de 5-tert butylperoxy-5-méthyl-l-hexène-3-yne (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (peroxyde monomère synthétisé par la méthode décrite [28]) et le méthacrylate de glycidyle (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich , USA) dans de l'acétate d'éthyle (7,9 ml) (Merck, Darmstadt, Allemagne) en utilisant de l'azoisobutyronitrile (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Allemagne) comme initiateur radicalaire. La polymérisation a été réalisée à 343K jusqu'à ce que la conversion maximale de 65% soit atteinte. Poly(VEP-co -GMA) a été utilisé comme squelette pour la fixation des chaînes PEG latérales via des réactions d'addition d'éther méthylique de poly(éthylène glycol) (mPEG) avec des groupes époxydes latéraux. De l'éthérate de trifluorure de bore (0,027 ml, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été ajouté à la solution de copolymère (1,0 g) dans du dioxane (20 ml; Merck, Darmstadt, Allemagne) à 313 K et agité pendant 3h. Le mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, USA) a été dissous dans du dioxane (15 ml) et la solution a été mélangée avec la solution de polymère du squelette et agitée pendant 6 h à 313 K. Le mPEG n'ayant pas réagi a été éliminé à l'aide de sacs de dialyse. avec une taille de pore de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, USA). Poly(VEP-co résultant en forme de peigne) Le -GMA)-greffon-PEG a été séché à température ambiante sous vide jusqu'à poids constant. Les structures et certaines caractéristiques du PNC sont présentées sur la figure 2 et ont été décrites précédemment [29].

Structure schématique du PNC - poly(VEP-co- GMA)-greffon -PEG avec la chaîne principale sur la base d'un copolymère de peroxyde insaturé de 2-tert -butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in (VEP, désigné par "k"), avec des chaînes latérales de méthacrylate de glycidyle (GMA, désigné par "l") et de polyéthylène glycol (PEG, désigné par "m" )

Pour préparer les solutions de PNC à base d'eau, 0,09 g de PNC ont été dissous dans 0,9 ml de DMSO. Cette solution de PNC a été ajoutée à 8,0 ml d'une solution de NaCl à 0,9%. Ensuite, la solution a été agitée pendant 0,5 h et soniquée pendant 10 s. Les dispersions aqueuses des complexes ont été obtenues en laissant tomber la solution DMSO de 4-thiazolidinones et de PNC dans l'eau dans l'ordre suivant :0,045 g de PNC ont été dissous dans 0,15 mL de DMSO (Sigma-Aldrich, USA), et 0,0015 g de Les -3288 (ou Les-3833) a été dissous dans 0,10 mL de DMSO. Les solutions de PNC et de 4-thiazolidinones ont été mélangées et ajoutées à 4,25 ml de solution aqueuse de NaCl à 1% et soniquées pendant 10 s.

Ce PNC tensioactif contient les chaînes PEG hydrophiles greffées sur le squelette hydrophobe (Fig. 2a). Dans les solutions aqueuses, le PNC amphiphile forme des structures semblables à des micelles qui peuvent solubiliser les composés insolubles dans l'eau (par exemple, les médicaments) ou ces composés peuvent être adsorbés sur la surface des nanoparticules, augmentant ainsi leur biocompatibilité. La technique développée pour obtenir des dispersions aqueuses hautement stables de la chimiothérapie à base de 4-thiazolidinone consiste en la nucléation de particules de médicament à l'échelle nanométrique qui se produit lorsque les solutions diluées dans le DMSO sont transférées dans la solution saline précipitante contenant un tensioactif polymère PNC qui fournit un revêtement polymère pour le surface des nanoparticules. En conséquence, en raison de l'agrégation et de la sédimentation, le complexe a été stabilisé et la dispersion a été empêchée. De plus, les complexes nanométriques de dérivés de 4-thiazolidinone sont protégés d'éventuelles interactions avec le microenvironnement biologique environnant. Cette protection leur permet de rester plus longtemps dans le corps sans perdre en stabilité et de s'accumuler dans le tissu ou l'organe cible sans provoquer d'effets secondaires négatifs. Ainsi, une telle modification améliore la stabilité de l'agrégation et de la sédimentation des dispersions aqueuses des nanoparticules de composés anticancéreux.

Les tailles des micelles polymères de PNC et des complexes de PNC avec les 4-thiazolidinones hétérocycliques ont été mesurées par diffusion dynamique de la lumière (DLS) en utilisant un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Allemagne) et DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) et par des spectres de corrélation de photons utilisant la technologie de rétrodiffusion non invasive (NIBS) à 25°C. Les échantillons pour les mesures DLS ont été préparés comme décrit ci-dessus et, si nécessaire, ont été dilués avec de l'eau bidistillée, pH 6,5-7,0. Trois à cinq mesures ont été effectuées pour chaque échantillon (chaque mesure consistait en 5 cycles et l'intervalle entre les mesures était de 5 min). La figure 3 montre la distribution en taille des structures micellaires de la PNC et des nanoparticules des complexes de la PNC avec les 4-thiazolidinones hétérocycliques (Les-3833 et Les-3288) analysées par DLS. La taille et la morphologie des micelles de PNC ainsi que des nanoparticules de 4-thiazolidinone enrobées de PNC ont été étudiées à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEM-200А (JEOL, Japon) à une tension d'accélération de 200 kV [30, 31]. Les échantillons ont été préparés comme décrit ci-dessus, et si nécessaire, ont été dilués avec de l'eau bidistillée. Les échantillons ont été préparés en pulvérisant la solution testée sur un substrat au moyen du dispersant à ultrasons UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ukraine), qui facilite un revêtement uniforme sur le substrat. Un mince film de carbone amorphe déposé sur une grille de cuivre a été utilisé comme substrat. Les tailles et la morphologie des micelles PNC et les complexes avec les 4-thiazolidinones hétérocycliques (Les-3288 et Les-3833) étudiés par les méthodes de DLS et TEM sont présentés dans la Fig. 3.

Images de microscopie électronique à transmission (MET) du PNC (à gauche) et du complexe de PNC + Les-3833 (à droite)

Les études DLS et de microscopie électronique à transmission (MET) ont démontré que les tailles des micelles de PNC étaient de 50 ± 25 nm et les nanoparticules formées par des complexes de PNC avec les 4-thiazolidinones hétérocycliques Les-3833 et Les-3288 étaient de 140 ± 25 nm et 155 ± 30 nm, respectivement. Les dispersions de complexes de PNC avec des dérivés de 4-thiazolidinone sont très stables et protégées de l'agrégation et de la sédimentation par la coquille de PNC adsorbée sur la surface des nanoparticules de thiazolidinone. Comme le montre la figure 4, les changements de taille des nanoparticules dispersées dans le système aqueux sont négligeables à de multiples dilutions avec de l'eau, ainsi qu'après 6 mois de vieillissement des systèmes aqueux des complexes de PNC avec les 4-thiazolidinones.

Etude DLS des diamètres hydrodynamiques des PNC et complexes (a ) et la dépendance des tailles moyennes des complexes PNC-médicament sur la dilution de la dispersion (b ) :dispersions aqueuses de PNC (1), complexes de Les-3833+PNC (2) et Les-3288+PNC (3), ainsi que tailles hydrodynamiques de Les-3833+PNC (1–3) et Les- 3288+PNC (4–6) dispersions après stockage pendant 2 jours (1,4), 4 mois (2,5) et 6 mois (3,6) (c )

Culture cellulaire

Des cellules de gliome de rat de la lignée C6 ont été obtenues auprès de Cell Culture Collection à l'Institut de biologie moléculaire et de génétique, Académie nationale des sciences d'Ukraine (Kiev, Ukraine). Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Sigma, USA) additionné de 10% de sérum bovin foetal (Sigma, USA). Les cellules ont été cultivées dans un CO₂ -incubateur à 37°C, 5% CO₂ , et 95% d'humidité. Le réensemencement des cellules a été effectué dans un rapport de 1:5 une fois tous les 2-3 jours.

Évaluation de l'action cytotoxique des substances étudiées

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits à une concentration de 100 000 cellules/mL dans un puits. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, Caroline du Nord, États-Unis). Les substances à l'étude ont été ajoutées à des concentrations de 0,1, 0,5 et 1,0 M après une période d'adaptation de 24 h qui a commencé après l'ensemencement cellulaire. Le comptage cellulaire a été effectué à intervalles réguliers dans la chambre de comptage hémocytométrique en utilisant le colorant bleu Trypan (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, USA) à une concentration finale de 0,01%, 2 min après son ajout à la suspension cellulaire . Les cellules mortes ont absorbé ce colorant en raison des dommages causés à leur membrane plasmique.

Cytométrie en flux

Pour étudier le cycle cellulaire et l'apoptose, les cellules C6 ont été traitées avec Les-3288, Les-3833 et leurs complexes avec des PNC, ainsi qu'avec des PNC sous forme libre, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), sédimentées par centrifugation. à 1000 rpm pendant 5 min à 4°C et remis en suspension dans du PBS froid (2 millions de cellules pour 1 mL de PBS). Ensuite, les cellules ont été fixées en ajoutant des aliquotes de 4 ml d'éthanol absolu refroidi à - 20°C avec un mélange doux. Les échantillons fixés ont été conservés à - 20°C jusqu'à utilisation (pas plus d'une semaine). Pour l'analyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), les échantillons cellulaires ont été centrifugés à 1000 tr/min pendant 5 min à 4°C, le surnageant a été jeté et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de PBS. Cent microlitres de RNase sans DNase (Sigma, USA) ont été ajoutés à cette suspension et les échantillons ont été incubés à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, chaque échantillon a été additionné de 100 µl d'iodure de propidium (PI) (Sigma, USA, 1 mg/mL), et incubé à température ambiante pendant 10 min. Enfin, les échantillons ont été transférés dans des tubes Falcon en plastique et la suspension cellulaire a été contrôlée avec un cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) et le logiciel Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) pour mesurer les paramètres du cycle cellulaire et de l'apoptose.

La mesure des cellules positives à l'Annexine V (apoptotique) a été effectuée en utilisant une analyse FACS. Des cellules de gliome C6 de rat ont été traitées avec des concentrations de 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL et 1 mg/mL de PNC, Les-3288, Les-3833 et leurs conjugués polymères, comme indiqué sous les figures. À la fin de l'expérience, les cellules ont été détachées du fond de la boîte avec une solution de Trypsine-EDTA, lavées deux fois avec du PBS et colorées avec de l'Annexine V-FITC en utilisant le kit de détection d'apoptose (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) , selon les instructions du fabricant. Les cellules lavées ont été incubées pendant 15 min dans le tampon de liaison à l'annexine V (BD Pharmingen), contenant 1/50 de volume de solution d'annexine V conjuguée au FITC. Ensuite, les échantillons ont été dilués deux fois avec un volume approprié de tampon de liaison à l'Annexine V et immédiatement mesurés sur le canal FL1/FL2 (FITC-PI) d'un cytomètre en flux (Becton Dickinson, USA). Les cellules positives à l'annexine V simples ont été classées comme apoptotiques.

Analyse de l'ADN de la comète

Le dosage de l'ADN des comètes a été réalisé dans des conditions alcalines. Dix mille cellules ont été mélangées dans 75 µl d'agarose à bas point de fusion (0,5 %) par échantillon. Après mélange, l'échantillon a été pipeté sur une lame préalablement recouverte d'agarose à point de fusion normal à 1,5%. Les échantillons ont été incubés à 4°C pendant 18 h dans une solution de lyse (2,5 M de NaCl, 100 mM d'EDTA, 10 mM de Tris-base, 10 % de DMSO, 1 % de Triton X-100). Pour permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des dommages alcali-labiles, les lames ont été incubées dans une solution alcaline à température ambiante pendant 20 min (conduite dans l'obscurité). Pour l'électrophorèse (~74 V/cm pendant 30 min), les lames ont été transférées dans une chambre horizontale et 1x tampon d'électrophorèse (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH>   13) a été ajouté. Les lames ont été fixées dans du méthanol à 100 % glacé et séchées. Les lames ont été colorées avec 80 L de bromure d'éthidium 1 × (EtBr) pendant 5 min, puis plongées dans de l'eau distillée réfrigérée pour éliminer l'excès de tache. Les comètes à ADN ont été visualisées à l'aide d'un microscope (Carl Zeiss, Allemagne), et les images ont été analysées à l'aide du logiciel « CASP » (logiciel Casplab-1.2.3b2, CASPlab, Wroclaw, Pologne). Cent comètes par échantillon ont été comptées. Les dommages à l'ADN ont été classés en cinq niveaux de génotoxicité en fonction de la taille de la queue de la comète :0 (0 à 5 % de dommages), 1 (5 à 25 % de dommages), 2 (25 à 45 % de dommages), 3 (45 à 70 % de dommages ) et 4 (plus de 70% de dégâts) [32]. L'indice de dommage (DI) a été calculé, comme décrit précédemment [33].

Test d'intercalation d'ADN utilisant un colorant vert de méthyle

Les composés Les-3288 et Les-3833 ont été étudiés pour leur capacité à s'intercaler dans la molécule d'ADN en utilisant le test au vert de méthyle [34]. L'ADN de sperme de saumon (10 mg/mL) a été incubé pendant 1 h à 37 °C avec 15 L de solution de vert de méthyle (1 mg/mL dans H₂ O). Les composés ont été ajoutés à 1 g/mL et incubés à 37°C dans l'obscurité pendant 2 h. Le volume final total des échantillons était de 1 ml. L'absorption du vert de méthyle a été mesurée à 630 nm, après incubation de l'échantillon pendant 2 h à 37 °C, en utilisant un microphotomètre multicanaux BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, USA). EtBr a été utilisé comme contrôle positif.

Analyse des données et statistiques

Toutes les expériences ont été répétées trois fois avec trois parallèles dans chaque variante. L'analyse de la variance (ANOVA) a été utilisée pour la comparaison des groupes. Les données de la distribution des cellules de gliome de rat C6 dans différentes phases du cycle cellulaire ont été analysées par ANOVA à un facteur, suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Un p une valeur de < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Effet cytotoxique (test d'exclusion au bleu Trypan) des dérivés de la 4-thiazolidinone utilisés sous forme libre et en complexe avec le nanosupport polymérique

Les résultats du test d'exclusion au bleu Trypan ont démontré que les formes aqueuses des complexes Les-3288 et Les-3833 avec le PNC présentaient une toxicité accrue vis-à-vis des cellules de gliome C6 (traitement de 24 h et 48 h) par rapport à la cytotoxicité observée en utilisant le forme libre de ces composés (Figs. 5 et 6). L'effet de cytotoxicité le plus élevé a été observé aux doses de 0,1 et 0,5 M des composés Les-3288 et Les-3833 dans leurs complexes avec la PNC, tandis qu'à la dose la plus élevée (1,0 M) de ces composés, une augmentation de la complexation avec la PNC a été détectée. uniquement dans le cas de Les-3288 pendant 24 h (Figs. 5 et 6).

Nombre de cellules vivantes de gliome C6 de rat mesuré par test d'exclusion au bleu Trypan après traitement pendant 24h et 48h avec différentes concentrations (0,1, 0,5 et 1,0 M) de Les-3288 seul comparé à l'action de son complexe avec le nanosupport polymérique ( PNC) *P <0,05 ; **P <0,01 ; ***P <0,001 ( différence par rapport au témoin, 100 %)

Nombre de cellules vivantes de gliome C6 de rat mesuré par test d'exclusion au bleu Trypan après traitement pendant 24 h et 48 h avec différentes concentrations (0,1, 0,5 et 1,0 M) de Les-3833 seul comparé à l'action de son complexe avec le nanosupport polymérique ( PNC) *P <0,05 ; **P <0,01 ; ***P <0,001 (différence par rapport au témoin, 100 %)

La complexation des composés Les-3833 et Les-3288 avec un nanosupport polymère améliore leur activité pro-apoptotique in vitro envers les cellules de gliome C6 de rat

Deux approches alternatives ont été utilisées pour évaluer l'effet modulateur de la PNC sur le potentiel cytotoxique des dérivés de 4-thiazolidinone sélectionnés. Tout d'abord, une analyse du cycle cellulaire a été menée pour étudier l'impact des complexes médicament-PNC sur le cycle cellulaire. De plus, la double coloration à l'annexine V/PI a été utilisée pour distinguer le type exact de mort cellulaire induite par ces nanocomposites.

Les composés Les-3288 et Les-3833 à faibles doses (0,1 g/mL et 0,5 g/mL) n'ont produit aucun effet visible sur la progression du cycle cellulaire ou l'induction de l'apoptose, comme le montrent la figure 7 et le tableau 1. Cependant, la complexation de les deux composés avec le PNC ont considérablement augmenté le nombre de cellules dans le pré-G₁ phase (4 fois pour Les-3288 et 6 fois pour Les-3833), ce qui indique une augmentation majeure de leur potentiel pro-apoptotique. Il convient de souligner que la PNC sous forme libre n'a eu aucun impact sur le cycle cellulaire ou l'induction de l'apoptose; ainsi, l'apparition observée d'une grande population de cellules pré-G1 sous traitement avec les complexes thiazolidinone-nanocarrier ne peut pas être expliquée par un simple effet synergique de la PNC et des médicaments expérimentaux.

Impact sur la progression du cycle cellulaire des dérivés de 4-thiazolidinone Les-3288 et Les-3833 sous forme libre et en complexe avec le nanocarrier polymère (PNC) dans des cellules de gliome de rat C6. Coloration à l'iodure de propidium (PI), cytométrie en flux. R2, pré-G1 ; R3, G1 ; R4, S ; phase R5, G2. FL2-H, valeurs d'émission de pointe du deuxième canal (filtre 585/40) du cytomètre en flux

Afin de confirmer que le pic sous-G1 observé est constitué des cellules apoptotiques, les résultats du test de coloration à l'Annexine V/PI ont été analysés. Nous n'avons pas observé d'externalisation significative de la phosphatidylsérine (principal marqueur de l'apoptose précoce, détecté par l'Annexine V conjuguée au FITC) pendant le traitement du gliome C6 avec des doses faibles (0,1 et 0,5 g/mL) et élevées de Les-3288 (1,0 g/mL) , suggérant que ce composé est un faible inducteur de l'apoptose. Au lieu de cela, nous avons trouvé une augmentation de la population de cellules nécrotiques (de 1,2 % dans le contrôle à 11,25 % pour Les-3288, 1,0 g/mL), ce qui peut indiquer que Les-3288 provoque au moins partiellement la mort des cellules nécrotiques. Cependant, la complexation du Les-3288 avec le PNC a complètement changé le mode d'action de ce médicament. Il y a eu une augmentation massive du nombre de cellules apoptotiques précoces (Annexine V(+)/PI(−)) et tardives (Annexine V (+)/PI(+)), tandis que la quantité globale de cellules purement nécrotiques est restée à le niveau des cellules témoins (non traitées) (Fig. 8a). Ainsi, la liaison de Les-3288 avec le PNC améliore non seulement fortement son activité pro-apoptotique envers les cellules de gliome, mais diminue également son mécanisme potentiel de mort cellulaire pro-nécrotique. Ces résultats peuvent être d'une importance clé pour la pratique clinique, car les médicaments pro-nécrotiques ne sont pas recommandés pour une utilisation en raison d'une induction massive d'inflammation qui est gênante pour les patients.

Comparaison de l'activité pro-apoptotique de Les-3288 (a ) et Les-3833 (b ) composés et leurs complexes avec le nanocarrier polymère (PNC) vers les cellules de gliome C6 de rat. Double coloration à l'annexine V/PI, cytométrie en flux. PI, iodure de propidium

Étonnamment, nous n'avons pas observé le même effet pour le complexe Les-3833+PNC. En fait, l'activité pro-apoptotique du complexe Les-3833+PNC était plus faible par rapport à Les-3288 sous forme libre à toutes les concentrations testées (Fig. 8b). Une différence aussi drastique entre les deux composés pourrait s'expliquer par la spécificité de leur structure chimique, et nous supposons que dans le cas du Les-3833, la structure du polymère devrait être optimisée pour obtenir de meilleurs résultats.

Dosage cométaire des dommages à l'ADN dans les cellules de gliome C6 du rat causés par les dérivés de la 4-thiazolidinone sous forme libre et complexés avec le PNC

Le test de comète alcaline permet la détection de cassures d'ADN simple brin dans des sites d'ADN labiles aux alcalins. Les résultats obtenus ont été estimés en utilisant la valeur moyenne du moment Olive Tail (OTM). Nos données ont montré que le traitement de С 6 cellules de gliome de rat avec Les-3288, Les-3833 et PNC (concentration 0,5 g/mL) pendant 3 h (Figs. 9 et 10) n'a pas causé de dommages significatifs à l'ADN (OTM =0,7299 ± 0,1276, OTM =1,466 ± 0,3086, OTM =0,5846 ± 0,1078, respectivement), par rapport aux cellules non traitées du contrôle (OTM =0,4541 ± 0,07273). Cependant, le traitement cellulaire avec le complexe Les-3833 + PNC (OTM =2,3880 ± 0,2212) a causé des dommages à l'ADN plus importants que le traitement cellulaire avec la forme libre de Les-3833. Une telle augmentation des dommages n'a pas été observée pour l'action du complexe Les-3288+PNC (Figs. 9 et 10).

Les dommages à l'ADN ont été évalués à l'aide du moment de la queue d'olive dans des cellules de gliome C6 de rat traitées pendant 3 h avec des composés antinéoplasiques expérimentaux utilisés à une concentration de 0,5 g/mL. *P 0,05 ; **P 0,01 ; ***P 0,001. PNC, nanosupport polymère; Dox, doxorubicine (contrôle positif)

Présence d'ADN dans la queue de comète de cellules de gliome de rat С6 après traitement pendant 3 h avec (a ) témoin (cellules non traitées), Les-3288 (b ), Les-3288+PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ) et la doxorubicine (g ), utilisé à une concentration de 0,5 μg/mL

An increase of cell incubation time to 6 h (Figs. 11 and 12) caused greater DNA damage in all experimental groups:Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, and Dox (positive control). However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.

DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.

During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).

DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833

Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.

Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control

Discussion

There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.

In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.

The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].

Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.

In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.

A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.

Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.

The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].

Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.

The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.

Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].

We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].

It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].

The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.

Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.

Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.

We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).

Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.

Conclusions

The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.

Abréviations

DMSO:

Dimethylsulfoxide

Dox:

Doxorubicine

EtBr:

Ethidium bromide

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PEG :

Polyéthylène glycol

IP :

Iodure de propidium

PNC:

Polymeric nanocarrier

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TEM :

Microscopie électronique à transmission

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in