Préparation de liposomes d'acide glycyrrhétinique à l'aide de la méthode de lyophilisation en solution monophasique :préformulation, optimisation et évaluation in vitro

Contexte

L'acide glycyrrhétinique (AG), un type de saponine triterpénique, est principalement extrait des racines de la glycyrrhize de la médecine traditionnelle chinoise [1]. Des études ont montré que l'AG a des effets antimicrobiens, antiviraux et anticancéreux évidents et qu'elle est couramment utilisée pour les traitements cliniques de l'hépatite chronique et du cancer du foie [2,3,4]. Selon le système de classification biopharmaceutique, l'AG est un médicament de type II. En raison de la faible polarité, de l'hydrophobie élevée et de la faible solubilité des molécules de GA, sa biodisponibilité orale est relativement faible [5]. De plus, l'AG peut provoquer une rétention sodée et une perte de potassium [6], qui sont associées à l'hypertension, tandis que les effets indésirables de l'AG semblent être dose-dépendants. Par conséquent, l'utilisation de stratégies de formulation appropriées pour augmenter l'absorption et maintenir une concentration efficace de GA améliorera considérablement sa biodisponibilité et sa sécurité.

La supériorité des liposomes en tant que transporteurs de médicaments a été largement reconnue [7,8,9]. Leurs avantages fonctionnels sont principalement démontrés par les aspects suivants :(1) les liposomes ont une bonne biocompatibilité et sécurité; (2) les liposomes améliorent l'administration ciblée de médicaments aux ganglions lymphatiques et réduisent les effets inhibiteurs ou les dommages que les médicaments anticancéreux ont sur les cellules et les tissus normaux ; (3) des liposomes porteurs de médicaments de taille appropriée ont des effets de perméabilité et de rétention améliorés sur les sites de tumeurs solides, d'infection et d'inflammation où la perméabilité des vaisseaux sanguins capillaires est augmentée, démontrant la capacité de ciblage passif ; (4) les liposomes peuvent transporter à la fois des médicaments hydrophobes et solubles dans l'eau; et (5) la surface du liposome peut être modifiée et liée à des groupes fonctionnels. En raison de ces caractéristiques avantageuses, de nombreux médicaments liposomiques ont été approuvés.

Les produits obtenus par les méthodes classiques de préparation de liposomes sont des suspensions aqueuses de liposomes. Cependant, les suspensions aqueuses de liposomes sont relativement instables et peuvent fuir, fusionner et subir une hydrolyse des phospholipides pendant le stockage, entraînant une capacité de stockage à long terme limitée [10]. Actuellement, le moyen efficace de résoudre ces problèmes est de préparer des proliposomes [11]. Le proliposome est une poudre avec une bonne fluidité qui est fabriquée à partir de composants et d'excipients de liposomes déshydratés. Les liposomes peuvent être reconstruits en dispersant le proliposome dans l'eau avant application. Le séchage par pulvérisation et la lyophilisation sont les deux méthodes les plus courantes pour la préparation des proliposomes [12], mais elles ont plusieurs limites d'application. Par exemple, le séchage par pulvérisation ne convient pas aux médicaments thermosensibles et peut souvent entraîner des problèmes tels que l'adhérence des parois en raison de la faible efficacité thermique de l'équipement. Les réarrangements structurels des bicouches liposomales peuvent se produire pendant le processus de séchage par atomisation [13]. La méthode de lyophilisation couramment utilisée est un système de suspension d'eau, mais l'eau prend beaucoup de temps pour être lyophilisée, donc cette méthode est très coûteuse et prend beaucoup de temps.

Une nouvelle méthode de préparation des proliposomes (méthode de solution monophasique de lyophilisation) a été développée ces dernières années [14, 15]. Cette méthode consiste à dissoudre les lipides, le médicament et les lyoprotecteurs solubles dans l'eau dans un système de co-solvant alcool tert-butylique (TBA)/eau, puis à obtenir des proliposomes par lyophilisation, après addition d'eau, formant une suspension de liposomes homogène. Cette méthode présente plusieurs avantages :(1) l'ajout de TBA peut améliorer considérablement le taux de sublimation de la glace, entraînant une lyophilisation rapide et complète qui est économiquement favorable. Dans le même temps, la sublimation rapide est bénéfique pour empêcher l'effondrement des grumeaux [16]. (2) La technique de solution de lyophilisation monophasique est un processus en une étape, qui est une méthode très efficace pour la préparation de liposomes à grande échelle. (3) Bien qu'il ne soit pas répertorié dans les lignes directrices de l'ICH pour les solvants résiduels, le TBA est susceptible de tomber dans la catégorie des solvants à faible toxicité de classe 3 en raison de sa similitude de LD₅₀ données de toxicité pour d'autres solvants de classe 3 [17]. (4) Une poudre stérile peut être obtenue par cette méthode. (5) Il convient aux médicaments ayant une faible solubilité dans l'eau ou une mauvaise stabilité dans l'eau [18].

Il y a eu quelques rapports sur l'utilisation du système de lyophilisation TBA/eau pour la préparation de liposomes. Cependant, les recherches sur ce système sont insuffisantes et de nombreuses questions demeurent. Par exemple, la variation du taux de sublimation des systèmes TBA/eau avec différentes concentrations, les changements dans la propriété à l'état solide du médicament spécifique après lyophilisation par les systèmes TBA/eau avec différentes concentrations, et le processus d'hydratation et d'assemblage de la poudre lyophilisée sont toujours pas clair. D'autre part, la solubilité d'un médicament hydrophobe particulier dans un co-solvant TBA/eau avec différentes proportions et températures est très spécifique. Les informations ci-dessus sont essentielles pour la formulation et la conception technologique des liposomes porteurs de médicaments. Par conséquent, dans cette étude, nous avons utilisé le GA comme médicament modèle pour effectuer une enquête de préformulation comme décrit ci-dessus. De plus, en utilisant le diamètre moyen et l'efficacité de piégeage comme principales mesures d'évaluation, nous avons optimisé les variables de formulation et de traitement des liposomes GA préparés par la méthode de solution monophasique de lyophilisation à l'aide de la conception Box-Benhnken. Les effets des types de protection contre la lyophilisation sur la qualité des liposomes ont été évalués, tout comme la libération in vitro des liposomes et leur absorption par les cellules d'hépatome.

Méthodes/Expérimental

Matériaux

L'acide glycyrrhétinique (pur à> 98 %) a été obtenu auprès de Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, Chine). La phosphatidylcholine de soja (Lipoid S100) a été achetée auprès de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Allemagne). Le cholestérol a été acheté auprès de J&K Scientific Ltd. (Pékin, Chine). Le composé de référence de GA a été acheté auprès des National Institutes for Food and Drug Control (Beijing, Chine). FITC-PEG-DSPE (poids moléculaire 2000) a été acheté auprès de Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Shanghai, Chine). L'alcool tert-butylique (> 98 %) et tous les autres réactifs, sauf indication contraire, ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pékin, Chine). L'eau déminéralisée a été préparée par un système de purification d'eau Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

Étude de solubilité du GA, du SPC et du cholestérol dans un système de co-solvant TBA/eau

Les solutions saturées de TBA-eau (30 ml) de GA avec différents pourcentages en volume de TBA ont été préparées en agitant un excès de médicament dans le véhicule correspondant à 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C et 45 °C. pendant 72 h. Après centrifugation (15 min à 3000 tr/min), le surnageant a été passé à travers des filtres microporeux de 0,45 µm. La solubilité à saturation de GA a été mesurée par HPLC après dilution adéquate. Trois répétitions ont été effectuées dans chaque co-solvant TBA/eau. L'analyse HPLC a été réalisée sur un système HPLC LabAlliance (modèle série III) (Lab Alliance, Tianjin, Chine) équipé d'une pompe quaternaire, d'un passeur d'échantillons et d'un compartiment colonne, couplé à un détecteur UV. La séparation a été effectuée sur une colonne C18 (4,6 mm  × 250 mm ; 5 μm ; Dikma Technologies, Pékin, Chine) ; méthanol et eau (90:10 V /V ) ont été utilisés comme phase mobile à un débit de 1,0 ml/min. Les analytes ont été détectés par un détecteur UV à 250 nm.

La solubilité de la phosphatidylcholine de soja (SPC) (ou cholestérol) dans le système co-solvant TBA/eau a été estimée à l'aide de la méthode turbidimétrique [19, 20]. En bref, 10 mg de SPC (ou cholestérol) ont été dissous dans du TBA à 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C et 45 °C pour obtenir une solution claire ; la température a été maintenue pendant toute la durée de l'expérience. Une quantité croissante d'eau purifiée à la même température a été ajoutée à une solution TBA de SPC (ou de cholestérol) à 25 °C jusqu'à ce que la turbidité apparaisse pour la première fois, et la valeur critique du volume d'eau a été enregistrée. La turbidité peut être identifiée en détectant la valeur d'absorption à 655 nm (> 0,04) par rapport à la solution à blanc (eau purifiée) sur un spectrophotomètre UV-Vis modèle T6 (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Pékin).

Préparation de liposomes à l'aide de la méthode de lyophilisation en solution monophasique

La GA, la SPC et le cholestérol ont été dissous dans du TBA à 45 °C, et un lyoprotecteur soluble dans l'eau tel que le mannitol, le lactose, le saccharose et le tréhalose a été dissous dans de l'eau à 45 °C. Ensuite, ces deux solutions ont été mélangées dans des proportions appropriées pour obtenir une troisième solution monophasique isotrope claire (volume total 60 ml). Une fois la solution monophasée stérilisée par filtration à travers des pores de 0,22 μm, elle a été versée dans les flacons de lyophilisation de 10 ml avec un volume de remplissage de 2,0 ml. Après une précongélation pendant 12 h à − 40 °C, la lyophilisation a été effectuée à une température de plateau de − 50 °C pendant 24 h avec une pression de chambre de 1–20 Pa dans un lyophilisateur (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., Chine).

Mesure de la taille des particules et de l'efficacité d'encapsulation des liposomes

La suspension de liposomes a été préparée en ajoutant 5 mg de poudre de proliposomes à 5 ml d'eau purifiée et en agitant ensuite au vortex pendant 1 min deux fois avec un intervalle de 15 min pour une hydratation complète. L'analyse granulométrique des liposomes a été caractérisée à l'aide d'un granulomètre laser (Nano ZS90 Malvern Instruments, Royaume-Uni).

L'efficacité d'encapsulation du GA dans les liposomes a été déterminée par la technique d'ultrafiltration-centrifugation. Brièvement, pipeter 1 ml de dispersion liposomale (500 μg de proliposomes dans 5 ml d'eau purifiée) dans une fiole jaugée de 10 ml, puis ajouter 5 ml d'eau purifiée, 2 ml d'acétone et diluer à 10 ml avec de l'eau purifiée. Transférer 0,5 ml de cette suspension dans la chambre supérieure du filtre centrifuge (Amicon Ultra-0,5, Millipore, Cdduounty Cork, Irlande) avec un poids moléculaire coupé de 50 kDa, qui a été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 30 min à 15 °C en utilisant une ultracentrifugeuse (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japon). Ensuite, 20 ul d'ultrafiltrat ont été injectés dans le système HPLC à une longueur d'onde d'absorption UV de 250 nm, et le contenu de GA a été appelé le contenu de médicament libre. L'efficacité d'encapsulation (EE) a été calculée selon les équations suivantes

où W _gratuit est la quantité de drogue gratuite et W _total est la quantité totale de médicament.

Détermination du taux de sublimation des mélanges TBA/Eau

Un millilitre de mélanges TBA/eau de différents pourcentages en volume de TBA (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % et 90 %) a été mis dans des flacons de lyophilisation de 10 ml , respectivement. Les mélanges TBA/eau ont été pré-congelés à -40 °C pendant 12 h, puis lyophilisés par un lyophilisateur (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., Chine) à - 50 °C. Le temps a été enregistré lorsque les mélanges TBA/eau disparaissent complètement des flacons de lyophilisation, et le taux de sublimation a été calculé en divisant le volume (μl) par le temps (min).

Détermination de la pression de vapeur saturée des mélanges TBA/eau

Les détails de l'appareil expérimental et la procédure opératoire ont été décrits ailleurs [21, 22]. Les pressions de vapeur du système TBA/eau (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % et 90 %) ont été mesurées par une méthode statique. L'appareil était composé d'un ébulliomètre de travail rempli de mélange TBA/eau, d'un ébulliomètre de référence rempli d'eau pure, d'une cuve tampon, de deux condenseurs, de deux mesures de température et d'un système de contrôle de la pression. La pression d'équilibre du système a été déterminée par la température d'ébullition de l'eau pure dans l'ébulliomètre de référence en termes de relation température-pression représentée par l'équation d'Antoine [23].

Détermination de la solubilité de l'AG

La solubilité dans l'eau du GA libre a été déterminée en ajoutant un excès de GA (10 mg) à 10 ml d'eau pure sous agitation magnétique (300 tr/min) dans un bain-marie thermostaté (DF-101S, Henan Yuhua instrument Co., Ltd., Chine) à 25 °C jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint (48 h). Les échantillons ont été filtrés à travers une membrane filtrante de 0,45 μm, convenablement dilués avec du méthanol, et analysés par HPLC [24]. Les expériences ont été réalisées en triple.

Observation de la morphologie de la surface des mélanges TBA/eau précongelés

Cinq millilitres de mélanges eau/tert-butanol ont été versés dans une boîte de Pétri de 90 mm, puis ont été congelés dans le piège froid (- 40 °C) ; les échantillons congelés ont été observés à l'aide d'un microscope optique XSP-4C (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Shanghai, Chine).

Microscopie électronique à transmission

L'apparition de liposomes a été observée par microscopie électronique à transmission (MET) Hitachi HT7700 (Hitachi, Japon) à une tension d'accélération de 100 kV. La suspension de liposomes a été obtenue en ajoutant 5 mg de poudre de proliposomes à 5 ml d'eau purifiée à température ambiante, mélangée au vortex pendant 10 s, puis laissée au repos pendant 30 s. Une goutte est prélevée à la micropipette puis déposée sur une grille de cuivre enrobée de carbone. L'excès de suspension a été éliminé par buvardage de la grille avec un papier filtre. Coloration négative à l'aide d'une solution d'acide phosphotungstique à 1 % (w /w , pH 7,1) a été réalisé directement sur le dépôt. L'excès a été éliminé avec un papier filtre et le dépôt a été laissé à sécher avant analyse.

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Les spectres de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) des échantillons ont été obtenus sur un spectrophotomètre Nicolet 6700 FTIR (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Chaque échantillon et le bromure de potassium ont été mélangés avec un mortier d'agate et comprimés en un disque mince. La plage de balayage était de 4 000 à 400 cm ⁻¹ et la résolution était de 4 cm ⁻¹ .

Calorimétrie différentielle à balayage

Des mesures de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ont été effectuées sur un calorimètre à balayage HSC-1 DSC (Hengjiu Instrument, Ltd., Pékin, Chine). Des échantillons de 15 mg ont été placés dans des bacs en aluminium et scellés dans la presse à bacs à échantillons. Les sondes ont été chauffées de 25 à 350 °C à une vitesse de 10 °C/min sous atmosphère d'azote.

Diffraction des rayons X

Les propriétés structurelles des échantillons ont été obtenues à l'aide du diffractomètre à rayons X D8 Focus (Bruker, Allemagne) avec un rayonnement Cu-Kα. Les mesures ont été effectuées à une tension de 40 kV et 40 mA. Les échantillons ont été scannés de 5° à 60°, et le taux de scan était de 5°/min.

Stabilité du proliposome GA

Les poudres de proliposomes GA ont été transférées dans une bouteille en verre, remplie d'azote, scellée et conservée à l'abri de la lumière à température ambiante. Le test de stabilité a été effectué pendant 6 mois en utilisant l'efficacité de piégeage et la taille des particules des liposomes reconstitués comme indices.

Libération de médicament in vitro

La libération de GA à partir de liposomes a été observée en utilisant la méthode de dialyse à 37 ± ± 0,5 °C. Après avoir reconstitué les liposomes dans du PBS (pH 7,4) ou une solution saline normale pour produire 0,5 mg/ml de GA, une aliquote de chaque dispersion liposomale (5 ml) a été placée dans une poche de dialyse (seuil de poids moléculaire de 8 000 à 14 000 Da) et a été hermétiquement scellé. Ensuite, le tube a été immergé dans 150 ml de milieu de libération, PBS (pH 7,4) ou une solution saline normale contenant 0,1 % (v /v ) Tween 80 pour maintenir la condition de puits [25, 26]. Tout en agitant le milieu de libération à l'aide de l'agitateur magnétique à 300 tr/min, des échantillons (1,5 ml) ont été prélevés à des intervalles de temps prédéterminés dans le milieu de libération pendant 12 h, qui a été rempli avec le même volume de milieu frais. La concentration de GA a été déterminée par HPLC après dilution appropriée avec du méthanol.

Captation cellulaire in vitro

Les liposomes de fluorescence ont été préparés par la méthode de lyophilisation en solution monophasique. En bref, un mélange de 30 mg de GA, 254 mg de SPC, 75,5 mg de cholestérol et 21,2 mg de FITC-PEG-DSPE a été dissous dans du TBA. En outre, 1016 mg de tréhalose ont été dissous dans de l'eau. Ensuite, ces deux solutions ont été mélangées pour obtenir une solution monophasique claire (volume total 30 ml). Une fois la solution monophasée stérilisée par filtration à travers des pores de 0,22 μm, elle a été versée dans les flacons de lyophilisation de 10 ml avec un volume de remplissage de 2,0 ml, puis lyophilisée pendant 24 h et additionnée d'eau pour reconstituer les liposomes jusqu'à utilisation.

Les cellules HepG2 (Wanleibio, Co., Ltd., Shenyang, Chine) ont été cultivées dans du DMEM avec 10 % de FBS (sérum bovin foetal). Les cellules ont été étalées jusqu'à 90 % de confluence dans des plaques à 6 puits, et les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 37,0 °C avec 5,0 % de CO₂ . Après 24h d'incubation, 200 μl de suspension FITC-GA-liposomes ont été ajoutés à 1 ml de suspension de cellules HepG2 (1 × 10 ⁴ cellules par puits). Après incubation pendant 0,5 h, 1 h, 2 h et 4 h, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS à pH 7,4 et la fluorescence extracellulaire a été désactivée avec 0,4 % (w /v ) Solution de bleu trypan. Les cellules ont été lysées avec 1% (w /v ) Triton X100. L'intensité de fluorescence du lysat cellulaire à une excitation de 495 nm et à une émission de 520 nm a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence RF5301 (Shimadzu, Tokyo, Japon). Les valeurs de fluorescence relative ont été converties en concentrations de phospholipides sur la base d'une courbe standard de concentration de phospholipides par rapport à l'intensité de fluorescence FITC mesurée dans le tampon de lyse cellulaire. La concentration en protéines a été déterminée en utilisant le kit de dosage de protéines BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). L'absorption a été exprimée en quantité de phospholipides par rapport à un milligramme de protéine cellulaire [27].

Résultats et discussion

Étude de préformulation

Étude de solubilité

Étant donné que les liposomes sont préparés à l'aide de la méthode de lyophilisation en solution monophasique, une étude de solubilité a été réalisée pour s'assurer que le médicament et le support pouvaient se dissoudre dans la solution TBA/eau avant la lyophilisation.

La figure 1 montre les changements dans la solubilité saturée de GA dans le système de co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent. Entre 25 °C et 45 °C, la solubilité saturée de GA augmentait continuellement avec l'augmentation du pourcentage en volume de TBA de 10 à 60 %, et la solubilité saturée de GA était>   0,5 mg/ml lorsque le pourcentage en volume de TBA était> 40 %. D'autre part, la solubilité saturée de GA augmentait avec l'augmentation de la température de la solution TBA/eau, lorsqu'elle était maintenue au même pourcentage en volume. La différence de solubilité sous différentes températures est devenue de plus en plus apparente lorsque le pourcentage en volume de TBA a atteint 30 %. La solubilité des phospholipides et du cholestérol du soja dans le système co-solvant TBA/eau est indiquée dans le graphique à colonnes empilées (Fig. 2). La figure 2a, b représente le volume de mélange TBA/eau nécessaire pour qu'une unité (1 mg) de phospholipides et de cholestérol atteigne une solubilité saturée à différentes températures, respectivement. La zone grise représente le volume d'eau et la zone noire représente le volume de TBA. Au fur et à mesure que la température augmentait progressivement de 25 à 45 °C, le volume total de co-solvant TBA/eau et le pourcentage en volume de TBA (étiquettes sur les colonnes) nécessaires pour dissoudre 1 mg de phospholipide diminuaient progressivement (Fig. 2a). Au fur et à mesure que la température augmentait au-delà de 35 °C, le volume de TBA nécessaire diminuait considérablement et était inférieur à 0,15 ml. De même, à mesure que la température augmentait progressivement de 25 à 45 °C, il y avait une réduction du volume de TBA nécessaire pour dissoudre 1 mg de cholestérol, tandis que le pourcentage en volume de TBA montrait une tendance à une diminution progressive. Les résultats ci-dessus ont démontré que la température et le pourcentage en volume de TBA affectent considérablement la solubilité des phospholipides, du cholestérol et de l'AG.

Solubilité saturée de GA dans le co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent (moyenne  ± SD, n = 3)

Solubilité du SPC (a ) et le cholestérol (b ) en co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent

Comparaison du taux de sublimation du système de co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent

Le taux de sublimation affecte directement l'efficacité de la production de poudre lyophilisée. Un taux de sublimation plus rapide est plus économique et peut empêcher l'effondrement des matériaux [16]. Dans cette étude, nous avons examiné les taux de sublimation de différentes concentrations de systèmes TBA/eau. Comme le montre la figure 3, le taux de sublimation du solvant mélangé a progressivement augmenté à mesure que le pourcentage en volume de TBA passait de 10 à 90 %. De plus, le taux de sublimation a atteint plus de 10 μl/min alors que le pourcentage de volume dépassait 60 %.

Taux de sublimation du co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent (moyenne ± SD, n = 3)

Afin d'identifier la raison de la différence de taux de sublimation de TBA avec un pourcentage de volume différent, nous avons d'abord examiné la morphologie de surface des échantillons congelés. La figure 4 contient les images microscopiques optiques de la solution TBA/eau avec un pourcentage en volume de 40 % à 80 % (le TBA avec un pourcentage en volume <  30 % n'a pas pu être examiné car il fondait rapidement au microscope optique). Par rapport au TBA avec un pourcentage en volume de 40 %, le TBA avec un volume>   50 % a des structures en forme d'aiguille claires et dispersées. Nous supposons qu'à mesure que le pourcentage en volume de TBA augmente, le diamètre des cristaux en forme d'aiguille devient plus petit, ce qui entraîne une augmentation de la surface spécifique et donc une augmentation du taux de sublimation.

Morphologie de surface du co-solvant TBA/eau de différents pourcentages volumiques de TBA au microscope optique (grossissement × 100). un 40%. b 50%. c 60%. d 70%. e 80%

De plus, nous avons également mesuré la pression de vapeur saturée du système co-solvant TBA/eau avec différents pourcentages en volume à 25 °C. La figure 5 est un graphique à barres des changements de pression de vapeur saturée du système de co-solvant TBA/eau avec différents pourcentages de volume de TBA. Comme le montre la figure, la pression de vapeur saturée du solvant mixte a tendance à augmenter progressivement à mesure que le pourcentage en volume de TBA augmente. Comme la température est positivement corrélée à la pression de vapeur saturante, selon l'équation d'Antoine (Eq. 2), on peut en déduire que la pression de vapeur saturante du système co-solvant à la température de lyophilisation (− 50 °C) augmentera avec le pourcentage en volume de TBA augmente, et cela peut être l'une des raisons de l'augmentation progressive du taux de sublimation.

où p est la pression de vapeur, T est la température, A et B sont des constantes spécifiques aux composants.

Pression de vapeur saturée du co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent (moyenne ± SD, n = 3)

Effet de la lyophilisation sur les propriétés physiques et chimiques de GA dans le système de co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent

Afin d'étudier l'effet de la lyophilisation sur les propriétés physico-chimiques du GA dans le système co-solvant TBA/eau, l'expérience suivante a été réalisée. Dix milligrammes de GA ont été dissous dans 8 ml de co-solvant TBA/eau de différents pourcentages en volume de TBA (40 %, 50 %, 60 %, 70 % et 80 %). Une fois la solution monophasée stérilisée par filtration à travers des pores de 0,22 μm, elle a été versée dans les flacons de lyophilisation de 10 ml avec un volume de remplissage de 2,0 ml. La lyophilisation a été réalisée à − 50 °C pendant 24 h par lyophilisateur.

Les spectres DSC de la poudre lyophilisée après dissolution de GA dans un système de co-solvant TBA/eau avec différents pourcentages en volume de TBA sont illustrés à la Fig. 6a. La courbe DSC du médicament brut montre un pic endothermique évident à 301 °C, qui est le point de fusion de GA. La lyophilisation dans un système de co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume de TBA différent a provoqué un déplacement vers l'avant du pic de fusion de GA. L'amplitude du décalage du pic de fusion augmentait à mesure que le pourcentage de volume de TBA diminuait.

ASN (a ), XRD (b ) et FTIR (c ) de GA après lyophilisation dans un co-solvant TBA/eau avec un pourcentage volumique différent; (a) AG, (b) 40 % à déterminer, (c ) 50% TBA, (d) 60% TBA, (e) 70% TBA, et (f) 80% TBA

Des recherches antérieures ont déjà montré que la concentration de TBA peut profondément affecter la formation d'un mélange complexe de phases cristallines, amorphes ou métastables [28]. Dans certains cas, l'utilisation de TBA peut entraîner une réduction de la cristallinité, et un autre cas est le contraire [29].

Les spectres de diffraction des rayons X (XRD) de la poudre lyophilisée après dissolution de GA dans un système de co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume de TBA différent sont présentés sur la figure 6b. Le spectre XRD du médicament brut montre plusieurs pics de diffraction cristalline distincts entre 5° et 20°. La lyophilisation dans un système co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume de TBA différent a provoqué la disparition des pics de diffraction à 5° à 20° dans les spectres XRD des échantillons. Cela indiquait que le cristal de drogue d'origine était devenu amorphe.

Les spectres FTIR de la poudre lyophilisée après dissolution de GA dans un système co-solvant TBA/eau avec différents pourcentages en volume de TBA sont présentés sur la figure 6c. La forme du spectre FTIR du médicament brut est cohérente avec celle de la poudre lyophilisée dans un système de co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume de TBA différent dans les 4000 à 400 cm ⁻¹ intervalle. Il n'y a pas eu d'émergence de pics caractéristiques pour de nouveaux groupes fonctionnels, démontrant que la structure chimique de GA est restée la même après lyophilisation dans TBA avec un pourcentage de volume différent.

Le passage d'une forme cristalline à une forme amorphe peut altérer la solubilité du médicament, affectant ainsi l'encapsulation des proliposomes pendant la reconstruction hydratée. Dans cette étude, nous avons mesuré la solubilité aqueuse de poudre de GA lyophilisée à 25 °C. Nous avons constaté que la solubilité saturée du GA lyophilisé dans l'eau diminuait progressivement de 64,10 à 19,27 μg/ml à mesure que le pourcentage en volume de TBA augmentait de 40 à 80 %. Cependant, il était encore significativement plus élevé que la solubilité dans l'eau du médicament brut (6,36 μg/ml), ce qui indique que le passage d'une structure cristalline à une structure amorphe pendant la lyophilisation affecte la solubilité du médicament brut (Fig. 7).

Solubilité aqueuse de la lyophilisation GA dans le co-solvant TBA/eau avec un pourcentage de volume différent (moyenne ± SD, n = 3)

Expérience à un seul facteur

De nombreux facteurs peuvent influencer la qualité des liposomes. Il est bien connu que les ratios phospholipide/médicament ont un effet sur la qualité de l'encapsulation du médicament [30]. Des quantités modérées de cholestérol peuvent augmenter l'arrangement ordonné de la membrane lipidique et la stabilité. However, high content of cholesterol in the liposome can decrease the flexibility of membrane and thereby hinder the penetration of drug into the lipid bilayer [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:

where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w /w ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w /w ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ and Y ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P < 0,05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ and X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P> 0,05). In this case, X ₃ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P> 0,05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ , and X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ and X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w /w ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean  ±  SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P  = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n = 3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. un The uptake amount versus incubation time. b –e Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min

Conclusions

In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.

Abréviations

BBD:

Box-Benhnken design

DSC :

Calorimétrie différentielle à balayage

EE:

Encapsulation efficiency

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

GA:

Glycyrrhetinic acid

MD :

Mean diameter

SPC:

Soybean phosphatidylcholine

À confirmer :

Tert-butyl alcohol

TEM :

Microscopie électronique à transmission

XRD :

Diffraction des rayons X