Nouvelle administration de mitoxantrone avec des nanoparticules de pullulane modifiées de manière hydrophobe pour inhiber les cellules cancéreuses de la vessie et l'effet de la taille des nano-médicaments sur l'efficacité de l'inhibition

Contexte

La chimiothérapie est un traitement courant des tumeurs. Cependant, en raison du manque de spécificité tissulaire, l'effet thérapeutique de la chimiothérapie est limité et a souvent des effets secondaires importants [1, 2]. Par conséquent, la recherche sur l'utilisation de préparations de nanoparticules (NP) pour augmenter la capacité cible des médicaments chimiothérapeutiques a augmenté [3,4,5].

Après avoir ciblé passivement les tissus tumoraux via l'effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR), les nanomédicaments tels que les médicaments antitumoraux à petites molécules chargées de NP exercent principalement leur efficacité de deux manières :(1) en étant libérés dans les tissus tumoraux et en entrant les cellules sous forme libre pour exercer une efficacité et (2) en étant absorbées par les cellules sous forme de microparticules et libérées dans la cellule pour exercer des effets pharmacodynamiques [6, 7]. Lorsqu'un agent nanopharmaceutique est ciblé passivement sur une tumeur, laquelle des deux méthodes joue un rôle majeur ou si les deux jouent un rôle majeur en même temps et si d'autres facteurs sont impliqués est une question complexe. En raison de l'activité métabolique des tissus tumoraux, de l'ischémie et de l'hypoxie et de l'accumulation d'acide lactique et du fait que le liquide extracellulaire des tissus tumoraux présente une faible acidité, de nombreux nanomédicaments présentent une libération accrue dans les environnements acides, pour une efficacité accrue [8]. L'efficacité de libération des nanomédicaments dans un environnement acide est étroitement liée aux propriétés physico-chimiques des nanomatériaux et est également affectée par la taille des NP [9,10,11]. Après que les NP ciblent passivement le tissu tumoral, car les cellules tumorales ont une fonction de phagocytose, la préparation nanopharmaceutique pénètre dans les cellules principalement via la pinocytose et des processus complexes médiés par les protéines de la membrane cellulaire [12, 13]. Sous la dégradation des lysozymes intracellulaires, les nano-médicaments libèrent des médicaments et exercent une efficacité [14].

L'efficacité d'absorption des cellules cibles dans les tissus ciblés est étroitement liée aux propriétés des nanomatériaux, à la modification de surface, à la morphologie, à la charge et à la taille des NP [15,16,17,18]. L'absorption cellulaire dépend dans une large mesure de la taille des NP. L'internalisation (endocytose) des NPs Her-gold dépend fortement de la taille, l'absorption la plus efficace se produisant dans les NPs dans la plage de 25 à 50 nm [19]. Les NP extrêmement petites ou grandes auront une absorption inefficace. La taille de 40 à 50 nm est le point critique pour l'endocytose médiée par les récepteurs [20]. De plus, la taille des NP affecte la cytotoxicité. En comparant les NP de 45 et 90 nm, la taille des NP polymères est inversement liée à la cytotoxicité [21]. La taille des NP affecte la libération du médicament dans le tissu tumoral ainsi que l'efficacité d'absorption des cellules et joue finalement un rôle important dans l'efficacité du médicament.

L'adhésion locale des polysaccharides améliore la fonction de localisation et de ciblage. L'environnement acide des cellules cancéreuses externes conduit à une libération partielle de nano-médicaments polysaccharidiques, déclenchant le double effet thérapeutique des NP chargées de médicaments et des médicaments libres après ciblage passif des tissus tumoraux [22, 23].

Le pullulane, qui n'est pas toxique, se dégrade facilement dans l'organisme et son cholestérol est une substance intrinsèque à l'organisme, il est donc sans danger et convient comme vecteur de médicaments [24, 25]. Les polymères de pullulane modifié hydrophobement (CHP) de cholestérol, qui ont des groupes cholestéryle hydrophobes et des chaînes de sucre hydrophiles, peuvent s'auto-assembler en structures de type nanosphère avec des noyaux centraux hydrophobes et des enveloppes hydrophiles [26, 27]. Les polymères amphiphiles s'auto-assemblent en NP dans des structures sphéroïdes, le noyau hydrophobe étant formé de groupes hydrophobes tels que les groupes cholestéryle [28].

La mitoxantrone, un antibiotique anthracycline actif anticancéreux à large spectre qui peut intercaler l'ADN et inhiber la topoisomérase II, est un médicament antitumoral classique. Cependant, en raison de sa cardiotoxicité, l'utilisation de la mitoxantrone est limitée. La mitoxantrone est chargée sur le centre hydrophobe des NP de cogénération par interaction hydrophobe pour former des préparations nanométriques de CHP qui ont un effet de ciblage passif via l'effet EPR. Par rapport aux médicaments gratuits, les NP CHP chargées de médicaments montrent des effets toxiques réduits des médicaments et une efficacité anticancéreuse accrue [29, 30]. Le groupe hydrophobe cholestéryle dans le polymère CHP entraîne la formation de la structure centrale du NP et, dans une certaine plage, plus le degré de substitution du groupe hydrophobe est élevé, plus la taille du NP est petite [31, 32]. La stabilité des CHP était supérieure au moins 2 mois sans modification significative de la taille et du potentiel zêta, et les nanoparticules de pullulane peuvent cibler le tissu tumoral pour tuer les cellules cancéreuses par effet EPR [33, 34].

Dans cette étude, nous avons utilisé des NP de pullulane (CHP) modifiées de manière hydrophobe avec du cholestérol comme transporteurs de médicaments antitumoraux pour charger la mitoxantrone. Différentes tailles de NP pullulanes chargées de mitoxantrone ont été générées en synthétisant des polymères CHP dans différents rapports de charge d'ester de cholestérol d'anhydride succinique (CHS) pour étudier l'effet de la taille des NP sur la libération prolongée d'un médicament, la libération de médicament dans un environnement acide, la toxicité pour le cancer de la vessie cellules, l'efficacité de l'absorption cellulaire et la migration cellulaire. Cette expérience a évalué la gamme de tailles des NP avec un ciblage passif pour cribler une NP appropriée en tant que vecteur de médicament et pour une efficacité médicamenteuse plus élevée.

Matériaux et méthodes

Réactifs et instruments

La mitoxantrone provenait d'Aladdin Chemistry (Shanghai); le sac de dialyse (BioSharp, USA, 8000~12 000 Da) provenait de Tianjin Junyao Biotechnology. Les autres réactifs provenaient de Beijing Xinze Technology.

Nous avons utilisé le spectrophotomètre de fluorescence Japon F-4500, le chromatographe de dichroïsme circulaire J-810 (Jasco Co., Japon), l'analyseur de taille de particules (MALVERN, Nano 2S-90, Japon) et un microscope électronique à projection (JEM-100CXII, Japon) .

Synthèse et caractérisation du polymère CHP et calcul du degré de substitution du cholestérol

La synthèse de l'anhydride succinique CHS a déjà été rapportée [35]. Une quantité de 0,5 g d'échantillon de pullulane a été dissoute dans 15 mL de diméthylsulfoxyde déshydraté pour la réserve. CHS (unité sucre/CHS = 0,20, 0,15, 0,05 mmol/mmol), 4-diméthylpyridine (DMAP∕CHS = 1 mmol/mmol) et chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl-carbodiimide (EDC∕ CHS  =  1,2 mmol/mmol) ont été dissous séparément dans 10 ml de DMSO, agités à température ambiante et activés pendant 1 h ; la réaction d'activation a été versée dans la solution de pullulane ; et la réaction a été arrêtée après 48 h. La réaction a été versée dans 200 ml d'éthanol absolu, puis un précipité blanc s'est formé. La filtration a été effectuée par aspiration et le produit a été lavé avec des quantités appropriées d'éthanol, de tétrahydrofurane et d'éther diéthylique, puis séché à 80 °C. Trois types de polymères CHP avec différents degrés de substitution du cholestérol ont été obtenus :CHP-1, CHP-2 et CHP-3 [36]. Le polysaccharide pullulane et le polymère CHP 10 à 20 mg ont été dissous par du DMSO-d6 dans des conditions ultrasoniques, et ¹ Les spectres RMN H ont été examinés. Le degré de substitution du cholestérol dans le polymère CHP a été déterminé sur la base des liaisons glycosidiques -1,4 et -1,6 et de l'aire sous le pic de méthylène.

Préparation et caractérisation des NP de cogénération à charge médicamenteuse

Synthèse de NP de CHP chargées de mitoxantrone comme décrit [37, 38], les NP chargées de médicament ont été obtenues par dialyse avec 40 mg de chacune des trois NP de CHP substituées par divers degrés de cholestérol et 4 mg de mitoxantrone pour la sauvegarde. Les NP chargées de médicament nouvellement préparées ou les NP chargées de médicament dispersées dans de l'eau distillée après lyophilisation ont été versées goutte à goutte sur une grille de cuivre avec un film de support en carbone, et le papier filtre a été égoutté. Les grilles ont été placées dans un dessiccateur, puis 2% (w /w ) de l'acide phosphotungstique (2 %) a été ajouté, négatif après séchage naturel, et observé par microscopie électronique à transmission (MET) [38]. La solution de NP chargées de médicament nouvellement préparées ou de NP chargées de médicament dispersées dans de l'eau distillée après lyophilisation a été versée dans des cuvettes et placée dans un analyseur de taille de particules pour la détection. Chaque échantillon a été traité trois fois pour obtenir une taille et même un potentiel de NP.

Mesure de l'efficacité de la charge de médicament et de l'encapsulation des NP de cogénération à charge de médicament

Le contenu de charge de médicament (LC%) et l'efficacité d'encapsulation (EE%) des NP de CHP chargées de mitoxantrone ont été mesurés comme décrit [31, 39] comme suit :

Étude de la libération des médicaments

Les trois types de NP chargées de mitoxantrone ont été placés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et dans des milieux de libération de pH =6,8 et 4,0. La libération de mitoxantrone a été étudiée in vitro par dialyse, et le pourcentage de libération accumulé (Q %) a été calculé comme décrit [40].

Lignées cellulaires et conditions de culture

La lignée cellulaire murine de cancer de la vessie MB49 fournie par le Dr P Guo (Institute of Urology, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, Shaanxi, China) a été cultivée dans du DMEM (Lonza) additionné de 10 % de sérum bovin foetal (Hyclone, Logan , UT, USA) et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans de l'air humidifié contenant 5 % de CO₂ .

Test de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été évaluée par un essai à base de tétrazolium. Brièvement, les cellules ont été ensemencées à 2 × 10 ⁴ par puits dans des plaques de culture à 96 puits et ont pu se fixer pendant 24 h. Différentes densités d'ensemencement ont été optimisées au début des expériences. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de mitoxantrone pendant 24 h dans un incubateur. La mitoxantrone à 0,0078, 0,0156, 0,03125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 μM a été dissoute dans du DMEM additionné de 1 % de sérum bovin fœtal. Une quantité de 50 μL de sel de tétrazolium de MTT (Sigma) dissous dans la solution équilibrée de Hank à 2 mg/mL a été ajoutée à chaque puits avec le traitement indiqué et incubée dans un CO₂ incubateur pendant 5 h. Enfin, le milieu a été aspiré de chaque puits et 150 μL de DMSO (Sigma) ont été ajoutés pour dissoudre les cristaux de formazan. L'absorbance de chaque puits a été obtenue en utilisant un lecteur de plaques Dynatech MR5000 à la longueur d'onde de test 490 nm et à la longueur d'onde de référence 630 nm.

IC₅₀ les valeurs de la mitoxantrone ont été déterminées par des courbes dose-réponse. Les trois concentrations de NP (0,0625, 0,125, 0,25 μM) avec trois degrés de substitution ont été comparées par MTT. La procédure expérimentale était la même que pour la mitoxantrone.

Évaluation de l'apoptose

Le taux d'apoptose cellulaire a été déterminé par cytométrie en flux avec l'Annexine V-FITC/iodure de propidium (PI). En bref, les cellules traitées ont été lavées deux fois avec du PBS froid, puis remises en suspension dans un tampon de liaison à 2 × 10 ⁶ cellules/mL selon les instructions du fabricant. Ensuite, 5 μL d'annexine V-FITC et 5 μM de PI ont été ajoutés à une suspension cellulaire de 100 μL et incubés pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité. Après avoir ajouté 300 μL de tampon de liaison, les cellules marquées ont été détectées par cytométrie en flux en 1 h.

Toutes les cellules apoptotiques précoces (Annexin V-FITC-positives [colorées en vert], PI-négatives), les cellules nécrotiques (Annexin V-FITC-négatives, PI-positives), les cellules apoptotiques tardives (doubles positives), ainsi que les cellules vivantes ( double négatif) ont été détectés par cytométrie en flux (FCM) et analysés en utilisant le logiciel Cell Quest (Becton Dickinson). La longueur d'onde d'excitation du laser argon était de 488 nm et la longueur d'onde d'émission de 530 nm (canal FL-1) pour l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et de 670 nm (canal FL-3 c3) pour PI. De plus, l'apoptose a été examinée par microscopie à fluorescence. Tout d'abord, 1,0 × 10 ⁵ les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits et après 24 h, les cellules ont été traitées comme ci-dessus, puis 24 h plus tard, 100 μL de tampon de liaison, 1 μL d'Annexine V-FITC et 1 LPI ont été ajoutés aux cellules à température ambiante dans l'obscurité pendant 15 min, maintenu à basse température et observé par microscopie à fluorescence.

Test de migration cellulaire

Un total de 8 × 10 ⁵ les cellules ont été ensemencées dans des plaques à six puits et laissées atteindre une confluence complète. La monocouche a été blessée à l'aide d'un bâtonnet à cocktail. Les cellules ont été incubées avec du DMEM sans sérum comme indiqué. Les images numériques ont été prises à 0, 6, 12, 24 et 48 h. L'aire moyenne a été calculée à l'aide de l'image J et les expériences ont été répétées trois fois.

Résultats et discussion

Conjugués CHP et degré de substitution du cholestérol

Le ¹ La valeur RMN H pour la cogénération (DMSO-d6 avec TMS, ppm) était de 2,53 ppm (2 groupes méthylène, -OCH₂ CH₂ O–). La figure 1 montre ¹ Spectres RMN H, confirmant que le cholestérol était chimiquement lié à la longue chaîne pullulane via un bras espaceur succinique. Les spectres des trois NP de cogénération synthétisés à différents rapports d'alimentation (a, b, c) ont montré les pics caractéristiques du pullulane ; Les liaisons glycosidiques -1-4 et -1,6 étaient ∂_4,68 (1Hα_1–6 ), _5.05 (1Hα_1–4 ), et ∂_2.53 (2 groupes méthylène, –OCH₂ CH₂ O–), respectivement, ce qui était également facile à distinguer. De nouveaux pics caractéristiques sont apparus à 0,40 à 2,40 (hydrogène sur le squelette cholestérique), ce qui a confirmé que les trois polymères CHP ont été synthétisés avec succès. L'aire sous le pic reflète le nombre d'atomes, et le degré de substitution cholestérique peut être calculé comme suit [41] :

Spectres RMN pour CHP-1 (a ), CHP-2 (b ), et CHP-3 (c )

où la somme de A _∂4,68 et A _∂5,05 représente le nombre d'unités sucre, A_{∂ 2,53} est le nombre d'atomes d'hydrogène dans –OCH₂ CH₂ O– du cholestéryl succinique, et A_{∂ 2,53} /4 est le nombre de –OCH₂ CH₂ O–, c'est-à-dire le nombre de cholestérols dans l'anhydride succinique CHS. Ainsi, la formule ci-dessus représente le degré de substitution cholestérique dans la molécule de CHP comme le nombre de groupes cholestéryle pour 100 unités glucose. Les rapports d'alimentation et les rapports molaires calculés des unités de sucre cholestéryle et pullulane étaient de 1/5, 3/20 et 1/20, respectivement, et le degré de substitution des trois CHP-1, CHP-2 et CHP-3 synthétisés polymères était de 6,82 %, 5,78 % et 2,74 %, respectivement. Le degré de substitution du cholestérol sur la chaîne pullulane augmentait avec l'augmentation du rapport d'alimentation. Cependant, le degré réel de substitution était inférieur aux deux ratios d'alimentation.

La chaîne pullulane peut exister sous forme de chaîne enroulée flexible dans le solvant, et après l'ajout d'une certaine quantité de cholestérol, le cholestérol greffé présente un encombrement stérique moléculaire plus important, ce qui affecte la réaction d'estérification directe du succinyl cholestérol et du groupe hydroxyle. sur la chaîne pullulane. La difficulté de la réaction a été considérablement augmentée, de sorte que le degré de substitution est devenu plus petit.

NPs de cogénération chargées de médicaments et leur taille

Les tailles des trois NP vierges de CHP pour CHP-1, CHP-2 et CHP-3 étaient de 79,1, 104,9 et 166,8 nm. A un certain degré de substitution, l'hydrophobie s'est renforcée avec l'augmentation du degré de substitution du cholestérol. Plus l'hydrophobie est forte, mieux les NP auto-agrégées du CHP forment un noyau hydrophobe plus compact, ce qui diminue la taille des NP [42]. La figure 2 montre la taille des NP de cogénération chargées de médicaments. Les tailles de particules pour CHP-1, CHP-2 et CHP-3 étaient respectivement de 86,4, 162,30 et 222,28 nm. Dans le même rapport de médicaments et de matériaux, la taille des particules de la NP chargée de médicament avec un degré élevé de substitution du groupe polymère hydrophobe était petite, mais le diamètre des particules de la NP chargée de médicament était plus grand que le médicament non encapsulé. -contenant des NP à blanc avec le même degré de substitution. Lorsque la mitoxantrone pénètre dans le noyau hydrophobe, la taille des particules des NP augmente. Sur la figure 2d, le potentiel zêta des NP de cogénération chargées en médicament est de − 1,12 mV. La figure 2e est une image MET montrant que les NP chargées de médicament sont sphériques.

Images de taille NP chargées de mitoxantrone (CHP-1 (a ), CHP-2 (b ), CHP-3 (c )), images potentielles (CHP-2 (d )), et des images TEM (CHP-2 (e ))

Libération de médicaments de différentes tailles de NP chargées de médicaments et sous différents milieux acides

Lorsque les ratios de médicament et de polymère CHP étaient les mêmes, la charge de médicament et l'efficacité de piégeage des NP CHP-1, CHP-2 et CHP-3 chargées de médicament étaient de 8,17 % et 88,92 %; 7,62 % et 82,28 %; et 4,83 % et 50,67 %, respectivement. Plus la substitution hydrophobe cholestérique dans le polymère CHP est élevée, plus la taille des particules formées est petite et plus la charge de médicament et l'efficacité de piégeage sont élevées. La figure 3 montre les profils de libération de médicament pour les trois NP de CHP chargées de médicament. Dans le PBS, le médicament a été libéré pendant 48 h. Les taux de libération pour CHP-1, CHP-2 et CHP-3 étaient respectivement de 38,73 %, 42,35 % et 58,89 %. Les trois NP ont montré des propriétés de libération prolongée, mais plus la taille de la NP est petite, plus l'hydrophobie est forte et plus la libération du médicament est lente. À pH 6,8, les taux de libération de médicament pour CHP-1, CHP-2 et CHP-3 étaient respectivement de 43,82 %, 49,48 % et 64,18 %. Dans des conditions faiblement acides, les NP de cogénération ont libéré le médicament de manière durable, mais le taux de libération a considérablement augmenté. À pH 4,0, après 48 h de libération du médicament, les taux de libération du médicament pour CHP-1, CHP-2 et CHP-3 étaient respectivement de 51,25 %, 56,23 % et 75,46 %. La libération du médicament CHP NP était significativement plus rapide à un pH inférieur, en particulier pour le CHP-3 NP, le plus grand des trois NP CHP.

Libération de mitoxantrone (MTO) des NP de pullulane dans une solution saline tamponnée au phosphate (carré noir :CHP-1, cercle blanc :CHP-2, triangle noir pointant vers le bas :CHP-3), à pH 6,8 (triangle blanc pointant vers le haut :CHP- 1, losange noir :CHP-2, carré blanc :CHP-3) et en pH 4,0 (triangle noir :CHP-1, losange blanc :CHP-2, cercle noir :CHP-3) à 37 °C in vitro

Cytotoxicité des NP de cogénération chargées de mitoxantrone

Sur le test MTT (Fig. 4), l'IC₅₀ les valeurs de la mitoxantrone pour inhiber la croissance des cellules cancéreuses de la vessie étaient de 0,25, 0,20 et 0,06 μM à 24, 48 et 72 h, respectivement (tableau 1). Nous avons considéré 24 h comme le temps de dosage.

Effet du traitement avec la mitoxantrone et les NP sur la prolifération cellulaire de la lignée cellulaire de cancer de la vessie MB49. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test à base de tétrazolium avec un traitement de 24, 48 et 72 heures avec de la mitoxantrone et des nanomédicaments de 0 à 0,5 μg/mL sur la lignée cellulaire murine de cancer de la vessie MB49

La concentration de mitoxantrone libre et de NP de mitoxantrone-CHP étant la même avec la même administration, les résultats des expériences MTT de la figure 5 montrent que la concentration de mitoxantrone libre était plus toxique pour les cellules cancéreuses de la vessie que les NP de mitoxantrone-CHP. En comparant les NP de mitoxantrone-CHP avec les trois degrés de substitution du cholestérol, l'effet cytotoxique le plus puissant était CHP-3, suivi de CHP-2, et le plus faible était CHP-1.

Cytotoxicité des NP de CHP libres de mitoxantrone et chargées de mitoxantrone à 24 h (carré bleu :mitoxantrone, cercle rose :CHP-1, triangle vert :CHP-2, triangle rouge pointant vers le bas :CHP-3)

Bien que les effets toxiques de diverses concentrations de mitoxantrone-CHP NPs sur les cellules cancéreuses de la vessie étaient similaires, en particulier CHP-2 et CHP-3, l'effet de CHP-1 a été significativement réduit. Chaque concentration de CHP-1 a montré ce phénomène. Ainsi, plus la taille de la mitoxantrone-CHP NP est grande, plus la cytotoxicité est forte.

L'effet thérapeutique des NP comporte deux parties :(1) l'absorption cellulaire des NP et (2) les NP sont libérées à l'extérieur de la cellule et les médicaments pénètrent librement dans les cellules pour exercer leur efficacité. Étant donné que la mitoxantrone libre a un effet plus fort que les NP de mitoxantrone-CHP, le CHP-3 a eu un effet thérapeutique plus fort que les deux autres NP de CHP à la même dose de médicament. La libération de CHP-3 a été la plus rapide et l'effet thérapeutique des NP de CHP dépendait principalement de la toxicité de la mitoxantrone libre dans les cellules après la libération de la préparation nano-pharmaceutique.

Apoptose cellulaire des NPs Mitoxantrone-CHP

Nous avons utilisé l'immunofluorescence et la cytométrie en flux pour comparer l'effet de la même concentration de 0,2 μg/mL de mitoxantrone et des trois NP de CHP chargées de médicament sur l'apoptose des cellules MB49. La mitoxantrone libre était plus forte pour l'apoptose que les trois NP mitoxantrone-CHP (Fig. 6). Cependant, le CHP-3 avait l'effet le plus puissant et le plus faible était le CHP-1. Les résultats précédents du MTT ont été confirmés davantage.

Apoptose de la mitoxantrone et des nanomédicaments à 24 h sur les cellules cancéreuses de la vessie MB49 (a DMSO, b mitoxantrone, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1 : A. La double coloration à l'Annexine V-FITC/PI a été détectée par microscopie à fluorescence, les cellules apoptotiques précoces ont montré une coloration positive à l'Annexine V-FITC (vert), les cellules nécrotiques étaient PI-positives (rouge) et les cellules apoptotiques tardives a montré une double coloration positive (jaune). B. Le taux d'apoptose a été déterminé par FCM. Cellule vivante (Q3), taux d'apoptose précoce (Q4), taux d'apoptose tardive (Q2), cellules nécrotiques (Q1). Plus la coloration cellulaire est importante, plus le taux d'apoptose est élevé

Migration cellulaire des NP de cogénération chargées de mitoxantrone

La capacité de 24 et 48 heures de la mitoxantrone libre et des trois NP de CHP à inhiber la migration des cellules MB49 a été observée par comparaison avec les témoins (Fig. 7). L'inhibition de la migration n'était pas significativement plus forte pour la mitoxantrone libre que les trois NP de CHP. Sur le test MTT et le test d'apoptose, l'inhibition de la migration était plus forte pour le médicament libre que pour les trois NP CHP, principalement parce que le médicament libre pénétrait plus facilement dans les cellules pour tuer les cellules cancéreuses. Dans l'expérience de migration cellulaire également, le médicament libre peut inhiber la migration cellulaire plus efficacement que les nano-produits pharmaceutiques CHP, ce qui peut être dû au fait que certains nano-produits pharmaceutiques CHP ne sont pas phagocytés entre les cellules, ce qui entraîne une résistance à la migration des cellules cancéreuses. De plus, les trois NP de CHP ne différaient pas dans l'inhibition de la migration des cellules cancéreuses, de sorte que la résistance stérique formée par les NP a joué un rôle important dans la migration cellulaire. Par conséquent, les CHPNP chargés de médicaments inhibent les cellules cancéreuses de deux manières :(1) la libération extracellulaire est la manière dominante, par laquelle les nanomédicaments libèrent les médicaments à l'extérieur des cellules et tuent les cellules cancéreuses sous forme de médicaments libres, les CHP-3 NP étant plus toxiques que les autres NP CHP, et (2) les NP CHP en dehors des cellules cancéreuses créent une résistance stérique, bloquant ainsi la migration des cellules cancéreuses.

La mitoxantrone seule et les NP de CHP chargées de mitoxantrone ont montré une migration altérée lors des tests de cicatrisation des plaies. un DMSO, b mitoxantrone, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1. Les images ont montré l'espace de la région rayée à différents moments ; A₀ , A₂₄ , et A₄₈ représentent respectivement 0, 24 et 48 h de traitement au DMSO

Le but de cette étude était de cribler des NP de CHP de taille appropriée en tant que transporteurs de médicaments et de fournir des preuves expérimentales de l'action thérapeutique des NP de CHP. Nous avons synthétisé trois types de polymères pullulanes à substitution stérol (CHP), CHP-1, CHP-2 et CHP-3, avec un degré de substitution du cholestérol de 6,82 %, 5,78 %, 2,74 % respectivement, et un diamètre de 86,4, 162,30 et 222,28. nm. Le taux de libération du médicament de trois types de NP de mitoxantrone-CHP pendant 48 h était de 38,73 %, 42,35 % et 58,89 %, respectivement. Le degré de substitution hydrophobe dans le polymère était associé au processus d'auto-assemblage des NP, affectant leur taille et donc le taux de libération du médicament. Dans les milieux à libération acide, la libération a été considérablement accélérée. Plus le NP est grand, plus la vitesse de libération du médicament est grande. A 24 h, l'IC₅₀ la valeur était de 0,25 M, pour le meilleur effet d'inhibition de la mitoxantrone sur la croissance des cellules cancéreuses de la vessie. Les NP CHP-3 chargées de médicaments avec la plus grande taille étaient les plus toxiques pour les cellules cancéreuses de la vessie et les NP CHP-3 avaient l'effet le plus important sur la promotion de l'apoptose des cellules. Toutes les NP pouvaient inhiber la migration des cellules MB49, mais les NP CHP-3 de grande taille avaient l'inhibition la plus puissante.

Les polymères amphiphiles peuvent s'auto-assembler en NP dans des solutions aqueuses; des exemples sont les polysaccharides pullulan et chitosan, qui peuvent être modifiés en polymères amphiphiles par modification hydrophobe de petites molécules et auto-assemblés en NP sphériques dans des solutions aqueuses avec des groupes hydrophobes comme noyau et enveloppes de chaîne de sucre hydrophiles [43, 44]. Au cours de l'auto-assemblage, les groupes hydrophobes sont la force motrice de la formation des NP et la clé de la formation de leur structure de coque et de noyau. Les propriétés et le poids moléculaire des groupes hydrophiles ont également un effet important sur la formation et la taille des NP [45, 46]. Lorsque le même polymère est modifié avec une petite fraction d'un groupe hydrophobe, le degré de substitution hydrophobe doit être modéré, et ce n'est que dans une certaine plage que la substitution hydrophobe peut être auto-assemblée en NP. Si le degré de substitution hydrophobe est trop élevé, l'hydrophobie du polymère est trop forte, ce qui n'est pas propice à l'auto-assemblage. Si la substitution hydrophobe est trop faible, la force motrice hydrophobe est trop petite pour former des NP [47].

Dans cette étude, nous avons réussi à synthétiser trois types de polymères de cogénération avec divers degrés de substitution du cholestérol en concevant un rapport d'alimentation approprié, et tous pourraient s'auto-assembler en NP d'une certaine taille. Au cours de l'auto-assemblage des polymères CHP, des médicaments hydrophobes tels que la mitoxantrone peuvent être intégrés au centre hydrophobe des NP pour former des NP chargées de médicament (Fig. 8). La taille des NP chargées de médicament est liée au degré de substitution du polymère CHP :plus le degré de substitution est élevé, plus la taille est petite. Le degré de substitution des polymères affecte également la quantité de médicament chargée dans les NP après l'auto-assemblage. Lorsque le rapport polymère/médicament est le même, plus le degré de substitution est élevé, plus la charge médicamenteuse est importante [48]. De plus, le rapport polymère/médicament affecte l'efficacité d'encapsulation et le chargement du médicament. Ce n'est que lorsque le rapport d'alimentation est dans la plage appropriée que la charge de médicament et l'efficacité d'encapsulation seront relativement élevées [31]. La libération de médicaments des NP affecte directement leurs effets thérapeutiques, ce qui est étroitement lié aux types de nanomatériaux, à la charge de surface et au groupe hydrophobe des NP, à la valeur du pH du milieu de libération et à l'adsorption de la protéine albumine sérique humaine (HSA) in vivo [49, 50]. La libération du médicament des NP de CHP chargées de mitoxantrone a montré une libération lente. La libération de médicaments des NP de CHP de grande taille était plus rapide et celle des NP dans un environnement acide était plus rapide. Le taux de libération du médicament des NP de plus grande taille était plus évident et plus rapide.

L'auto-assemblage de nanoparticules de cogénération chargées en mitoxantrone (NP)

La chimiothérapie anticancéreuse est actuellement le principal moyen de traiter le cancer, mais les médicaments de chimiothérapie ne sont pas spécifiques aux tissus et sont toxiques pour les tissus normaux, et certains causent de graves dommages aux cellules immunitaires, ce qui nuit à l'effet global du traitement [51, 52]. La nanomédecine peut cibler passivement les tissus cancéreux via l'effet EPR, réduisant ainsi le dépôt de médicament dans les tissus non cibles et réduisant la toxicité et les effets secondaires. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules cancéreuses de la vessie comme modèles de cellules cancéreuses et nous discutons des effets des NP et de la taille des NP sur le cancer de la vessie. L'effet antitumoral était plus fort pour la mitoxantrone libre que pour les NP de CHP ; cependant, si la totalité du médicament est administrée, la mitoxantrone n'est pas spécifique d'un tissu. Le dépôt et le gaspillage de tissus ainsi que la toxicité et les effets secondaires causés par ces médicaments ne seront pas aussi efficaces que les traitements à base de nano-médicaments. Par conséquent, les effets toxiques sur les cellules cancéreuses et l'inhibition de la migration cellulaire étaient meilleurs avec le médicament libre qu'avec les NP chargées de médicament, ce qui n'indique pas que l'effet thérapeutique global des nanomètres CHP n'est pas aussi bon que celui de la mitoxantrone libre. Nous soulignons l'effet du degré de substitution hydrophobe sur la taille des médicaments à l'échelle nanométrique et l'effet de la taille nanométrique sur la charge de médicament, la libération de médicament, la cytotoxicité et la migration des cellules cancéreuses. Une fois que les NP sont passivement ciblées sur les tissus cancéreux via l'effet EPR, l'efficacité thérapeutique des NP chargées de médicaments est principalement dérivée de la libération de médicaments dans les tissus et de la libération de NP dans les cellules (Fig. 9). L'effet thérapeutique des NPs CHP est de savoir si leur libération extracellulaire ou intracellulaire joue le rôle dominant. D'après les expériences cellulaires, la taille des NP de cogénération a un effet important :avec une grande taille, les médicaments sont plus libérés, mais la quantité de médicament est la même. Par conséquent, l'effet thérapeutique des CHP-NP peut dépendre principalement de la libération dans les tissus plutôt que de l'absorption cellulaire.

L'efficacité du traitement des NP de cogénération chargées en mitoxantrone par la libération principalement localisée dans le tissu tumoral

De nombreuses NP classiques sont utilisées comme vecteurs de médicaments, et les NP de CHP que nous avons préparées sont supérieures aux autres. Par exemple, les NP biogénétiques (telles que les exosomes, les vésicules extracellulaires-mimétiques, les vésicules extracellulaires modularisées) sont difficiles à préparer [53]. La distribution cible des liposomes courants n'est pas idéale et son instabilité reste un problème [54]. Les NP inorganiques telles que les NP à points quantiques sont très stables, mais en tant que matière étrangère, leur biocompatibilité est faible, ce qui peut provoquer des effets secondaires chez l'homme [55]. Les NP de cogénération sont faciles à préparer et nous pouvons contrôler leur taille en contrôlant le degré de substitution hydrophobe [48]. Parce qu'ils peuvent être directement dégradés par l'amylase in vivo, ils ont une bonne biocompatibilité [56]. De plus, les NP de CHP ont une bonne stabilité et d'excellentes propriétés de libération de médicaments [57]. L'inconvénient est qu'elles seront inévitablement en partie avalées par le système phagocytaire mononucléaire [58]. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour réduire l'élimination par le système et améliorer la concentration sanguine efficace des NP.

Conclusion

La taille des NP de CHP chargées de mitoxantrone est liée au degré de substitution du cholestérol dans le polymère. Plus le degré de substitution d'hydrophobie est élevé, plus la taille est petite, plus le chargement du médicament et l'efficacité d'encapsulation sont élevés, et plus la libération du médicament est lente. Dans des conditions acides, plus l'acidité est forte, plus la libération des NP de cogénération est rapide. De plus, la libération de NP de plus grande taille est meilleure et les NP de plus grande taille peuvent inhiber la croissance des cellules de la vessie et leur migration mieux que les NP de plus petite taille. Les NP de cogénération tuent les cellules cancéreuses principalement par la libération de médicaments à l'échelle nanométrique à l'extérieur de la cellule.