Nanoparticules biodégradables d'oxyde de zinc dopées au fer : un système prometteur d'apport de fer pour applications biologiques

Résumé

Le fer est un élément crucial pour les organismes vivants et sa carence est décrite comme le trouble nutritionnel le plus courant dans le monde. Aujourd'hui, des stratégies de supplémentation en fer plus efficaces et sûres pour les humains et les animaux deviennent l'un des défis les plus importants dans le traitement des carences nutritionnelles. Nos précédentes études in vivo ont confirmé la sécurité et la biodégradabilité des nanoparticules à base d'oxyde de zinc fabriquées en interne et leur distribution rapide vers la majorité des organes et tissus du corps. Des examens in vitro réalisés sur la lignée cellulaire Caco-2, modèle des cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, ont révélé une faible toxicité des nanomatériaux étudiés. Dans l'étude actuelle, nous avons étudié des nanoparticules biodégradables d'oxyde de zinc dopées au Fe(III) comme stratégie prometteuse de supplémentation pour la carence en fer. Des nanoparticules ZnO:Fe biodégradables ont été administrées par voie intra-gastrique à des souris adultes et, après 24 h, les animaux ont été sacrifiés avec collecte des organes internes pour analyses ultérieures. La concentration en fer mesurée par spectrométrie d'absorption atomique et coloration histologique (méthode de Perl) a montré une distribution rapide des nanoparticules dopées au fer vers les tissus spécifiquement liés à l'homéostasie du fer. L'accumulation de fer était également visible au sein des hépatocytes et autour des vaisseaux sanguins dans la rate, ce qui pourrait indiquer le transfert de nanoparticules dopées au Fe depuis la circulation sanguine vers le tissu. En résumé, les résultats préliminaires obtenus dans cette étude suggèrent que les nanoparticules biodégradables de ZnO dopées au Fe pourraient être de bons vecteurs de fer exogène dans l'organisme vivant. Par conséquent, des investigations ultérieures axées sur la détermination des mécanismes exacts liés au dépôt de fer dans le tissu et l'influence des vecteurs nanoparticulaires sur le métabolisme du fer sont nécessaires.

Introduction

Le fer est l'un des composants les plus importants constituant les organismes vivants sur Terre, y compris la population humaine. L'importance de cet élément est liée au rôle essentiel du fer dans de nombreuses structures et processus se déroulant dans le corps, par exemple le transport d'oxygène dans l'ensemble des tissus et cellules du corps (partie de l'hémoglobine et de la myoglobine), la production d'énergie (composant des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale) et bien d'autres encore [1, 2]. Ainsi, le fer participe aux processus vitaux cruciaux des cellules et de l'organisme entier et sa carence peut entraîner des perturbations significatives dans le fonctionnement de l'organisme vivant.

Comme le montrent les rapports mondiaux, la carence en fer devient un grave problème de santé publique dans la population humaine. Selon l'OMS, près de 30 % de la société dans le monde était affectée par l'anémie entre 1993 et 2005. La prévalence de l'anémie reste bien plus élevée chez les jeunes enfants et les femmes enceintes [3]. L'importance de la supplémentation en fer pendant la grossesse est liée au fait que la carence en fer est un facteur de risque pour l'accouchement prématuré, le faible poids de naissance des nouveau-nés et leur état de santé généralement plus mauvais [4]. Dans le cas des nourrissons et jeunes enfants d'âge préscolaire, le facteur de risque de carence en fer est causé par la croissance rapide de l'ensemble du corps et la consommation subséquente des réserves de fer ; ainsi, la supplémentation en fer est également recommandée pour les enfants entre 0 et 5 ans [5]. Fait intéressant, il existe des rapports scientifiques indiquant la corrélation d'un niveau de fer adéquat chez les enfants et leur développement émotionnel et neuropsychologique [6]. De plus, la carence en fer est aussi un trouble nutritionnel grave parmi d'autres espèces mammaliennes, surtout chez les porcelets allaités, où l'apport intra-utérin limité de cet élément est couplé à une faible teneur en fer dans le lait de la truie [7, 8]. De plus, une croissance rapide des porcelets épuise rapidement les restes de réserves de fer, car en quelques jours les porcelets nouveau-nés doublent leur poids corporel, augmentant ainsi le nombre de globules rouges et le volume sanguin général. Ainsi, de nos jours, une stratégie de supplémentation en fer plus efficace et sûre pour les populations humaines et animales devient l'un des défis les plus importants dans la prévention et le traitement des carences nutritionnelles.

Il existe trois voies principales d'apport de fer supplémentaire à l'organisme vivant : intraveineuse, intramusculaire et orale. Chacune d'elles présente à la fois des avantages et des inconvénients. L'administration orale semble simple et plus naturelle pour le corps, impliquant les voies physiologiques d'absorption et de transport du fer. De plus, cette méthode préserve un système naturel de contrôle de la quantité de fer circulant dans le corps basé sur l'hepcidine [9]. Cependant, la voie orale de supplémentation est souvent entravée par une faible absorption et une efficacité finale faible. Des études scientifiques ont également rapporté que la stratégie standard de supplémentation orale en fer soluble affecte fortement la composition et l'activité métabolique du microbiome intestinal animal [10]. D'autre part, les voies intraveineuse ou intramusculaire d'apport de fer à l'organisme sont entravées par le risque d'effets secondaires toxiques [11]. De plus, dans l'élevage porcin industriel, la méthode standard de supplémentation en fer basée sur l'administration intramusculaire individuelle d'une dose unique de fer-dextran est stressante pour les animaux et fastidieuse pour les éleveurs. De plus, une injection mal réalisée peut provoquer une inflammation et d'autres complications chez les animaux, ainsi que contribuer à la propagation de diverses maladies dans le troupeau, lorsque les conditions de stérilité ne sont pas respectées.

Les effets secondaires toxiques mentionnés ci-dessus de l'apport de fer exogène à l'organisme vivant sont associés à la présence de fer libre et non lié dans le corps, qui, en tant que métal de transition (par changement de valence), peut conduire à la production de radicaux libres nocifs (espèces réactives de l'oxygène — ROS) par la réaction de Fenton [12]. Des rapports scientifiques ont indiqué qu'un niveau accru de radicaux libres dans l'organisme est un facteur contribuant à diverses conditions incluant : infections bactériennes, néoplasies ou maladies du foie [13]. La stratégie physiologique naturelle de prévention de la génération de ROS par le fer libre repose sur la liaison de l'élément fer avec des protéines particulières à chaque étape de ses voies d'absorption et de transport dans le corps. En cas de surcharge orale en fer et de son administration intraveineuse/intramusculaire, les voies physiologiques de circulation du fer sont généralement submergées, entraînant une augmentation rapide des ROS [14].

Les nanoparticules à base de fer (Fe-based NPs) ont été largement étudiées comme outil prometteur pour des fins biomédicales. L'utilisation la plus extensive de ces nanostructures est liée à leurs propriétés magnétiques ; ainsi, elles ont été principalement testées comme agents de contraste pour des techniques de diagnostic clinique visant l'imagerie tumorale ou l'accumulation dans des tissus particuliers [15]. Récemment, les nanostructures ont également été étudiées comme une nouvelle forme plus efficace d'apport de substances bioactives à l'organisme. Les vecteurs NP peuvent révéler une biodisponibilité considérablement accrue pour l'organisme vivant, comparée aux substances sous forme massive, ce qui est principalement lié à leur taille plus petite [16, 17]. Dans l'une des études, l'efficacité de NPs contenant du fer a été comparée au sulfate ferreux (supplément standard pour traiter l'anémie) chez des rats anémiques. Sur la base des analyses sanguines, les résultats obtenus ont montré une biodisponibilité du fer accrue après une dose unique orale de NPs avec du fer chez des animaux anémiques. Dans le cas de doses multiples de nanoparticules et de sulfate ferreux, les résultats obtenus étaient similaires [18]. Une autre étude a décrit les résultats obtenus de nanomatériaux à base de Fe comme agents alternatifs d'apport de fer sur des humains et un modèle rongeur. Les auteurs ont particulièrement souligné une sécurité supérieure du nanoFe comparée aux formes solubles de fer, qui a entraîné l'absence d'accumulation de fer dans la muqueuse intestinale et la promotion d'un microbiote bénéfique [19]. Des résultats tout aussi prometteurs ont été obtenus dans l'étude sur des rats anémiques traités avec des NPs à base de Fe coiffées de vitamine C, ce qui a permis d'éviter la voie standard d'absorption du Fe par le tractus gastro-intestinal. Les résultats obtenus ont indiqué la récupération des animaux testés de la maladie anémique ainsi que l'amélioration de leurs paramètres sanguins en peu de temps, comparé à la méthode standard de thérapie de la carence en fer [20].

Matériaux et méthodes

Synthèse des nanoparticules

Les nanoparticules d'oxyde de zinc dopées au fer (ZnO:Fe NPs) ont été synthétisées en utilisant la technique hydrothermale micro-ondes. La méthode est bien établie, relativement peu coûteuse, biocompatible et industriellement évolutive, capable d'introduire différents ions étrangers comme dopants fonctionnels [21,22,23,24,25], dans une variété d'oxydes [26,27,28]. La concentration de fer dans les nanoparticules présentes était fixée à 5 % molaire. La synthèse a été conduite à partir de nitrates(V) : Zn(NO₃)₂·6H₂O (99 %, Sigma–Aldrich) et Fe(NO₃)₃·9H₂O (96 %, Carl Roth). Nous avons testé divers fournisseurs et choisi ceux qui offrent le produit le plus uniforme ne contenant pas de niveaux mesurables de résidus non solubles. Les composés ont été dissous dans de l'eau distillée : 17,63 g de nitrate de zinc(V) et 1,25 g de nitrate de fer(III)(V). La solution claire a ensuite été alcalinisée en utilisant une solution d'ammoniaque aqueuse à 25 % (Carl Roth) jusqu'à un pH de 8. Le résidu rouge résultant a été lavé à l'entonnoir Büchner, avec ~ 1 L d'eau distillée et filtré sous vide. Le précipité a été placé dans un récipient en Téflon de 100 ml, rempli d'eau à 80 % du volume, puis fermé dans une chambre de réacteur Ertec Magnum II. Le processus hydrothermal micro-ondes a été conduit à 4 MPa pendant 20 min. Après la réaction, le produit rouge pâle a été collecté et séché pendant la nuit à 60 °C.

Caractérisation des nanoparticules

La caractérisation du produit a été réalisée en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB), la photoluminescence (PL) et la cathodoluminescence (CL) spectroscopie, et l'analyse élémentaire par dispersion d'énergie (EDX). Les mesures MEB ont été conduites avec un microscope Hitachi SU-70 à haute résolution (1 nm), équipé d'un détecteur de rayonnement caractéristique et d'un système de cathodoluminescence GATAN Mono CL3 en modes électroniques secondaires (SE) et transmission (TE). Les spectres d'émission et d'excitation de photoluminescence ont été enregistrés en utilisant un spectrofluorimètre Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3, équipé d'une lampe au xénon comme source d'excitation et d'un photomultiplicateur Hamamatsu R928P. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) et le potentiel zêta ont été mesurés avec un système de caractérisation de particules DelsaMax Pro. L'analyse thermogravimétrique (ATG) a été conduite en utilisant un thermogravimètre NETZSCH STA 449 F1 Jupiter sous flux d'argon. Les mesures MEB ont été conduites après dépôt des nanoparticules sur une grille de cuivre 400 recouverte de polycarbonate Agar. L'échantillon a été suspendu dans de l'eau distillée en utilisant un processeur ultrasonique Sonics VCX500, puis une goutte de la suspension a été placée sur la grille et séchée. L'échantillon a été préparé après 2 h de sédimentation des particules plus lourdes.

Modèle in vitro

Pour l'étude actuelle, la lignée cellulaire Caco-2 (cellules d'adénocarcinome du côlon caucasien) a été utilisée, comme modèle des cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal. La lignée cellulaire a été obtenue de la Collection Européenne de Cultures Cellulaires Authentifiées — ECACC (Sigma–Aldrich, Cat. No. 86010202). Les cellules ont été ensemencées à 0,5 × 10⁶ cellules/ml sur des plaques à 6 ou 96 puits et maintenues dans le milieu de Dulbecco modifié d'Eagle — DMEM (Gibco), supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin — FBS (Gibco), 1 % d'acides aminés non essentiels — NEAA (Gibco), 1 % de pénicilline–streptomycine–néomycine — PSN (Gibco), et 0,2 % de bicarbonate de sodium (Gibco) à 37 °C et 5 % CO₂. Lorsque 95–100 % de confluence était observée, le milieu de culture cellulaire était retiré et une suspension de ZnO:Fe NPs dans du milieu de croissance frais était ajoutée. Les cellules étaient incubées avec quatre concentrations différentes de ZnO:Fe NPs (1,0 ; 0,1 ; 0,01 ; et 0,001 mg de ZnO:Fe NPs/ml) pendant 24 h à 37 °C et 5 % CO₂.

Analyses de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été évaluée pour Caco-2 en utilisant deux méthodes : test XTT et coloration au bleu de trypan. Tous les réactifs requis pour le test XTT étaient fournis dans le kit commercial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Après l'incubation de cellules cultivées sur plaque à 96 puits avec différentes concentrations de ZnO:Fe NPs, les cellules étaient incubées avec 50 µl de mélange de marquage XTT pendant 4 h à 37 °C et 5 % CO₂. Par la suite, la concentration de formazan était évaluée par méthode spectrophotométrique. L'absorbance était mesurée à 470/650 nm et les résultats étaient corrélés avec le nombre de cellules viables. Dans l'expérience suivante, le résultat d'absorbance le plus élevé était considéré comme la viabilité de 100 % des cellules. Les résultats finaux étaient calculés sur la base de quatre répliques d'expériences distinctes (n = 4).

Pour réaliser la coloration au bleu de trypan, après que les cellules cultivées sur plaques à 6 puits aient été incubées avec différentes concentrations de ZnO:Fe NPs, les cellules étaient collectées (0,05 % trypsine et 0,2 % EDTA pendant 10 min), centrifugées et le culot était resuspendu dans 1 ml de milieu de croissance. Cent microlitres de solution stérile de bleu de trypan à 0,4 % étaient mélangés avec 100 µl de suspension cellulaire. Dix microlitres d'échantillon étaient déposés sur la lame de comptage et analysés à l'aide du logiciel JuLi Br Counting (NanoEnTek) pour évaluer le nombre de cellules viables. Les résultats finaux étaient calculés sur la base de trois répliques d'expériences distinctes (n = 3).

Modèle animal

Pour les besoins de cette étude préliminaire, des souris Balb-c mâles adultes (n = 6) étaient maintenues individuellement dans des conditions de vie standard et contrôlées (période lumière/obscurité 12/12 h, 25 °C, humidité 30 %) avec nourriture et eau standard (fournies ad libitum). Toutes les procédures ont été acceptées par le Comité d'Éthique Local, accord no. WAW2/59/2017. Après 7 jours d'acclimatation, une suspension de ZnO:Fe NPs dans l'eau (10 mg/ml ; 0,3 ml/souris) a été administrée par gavage oral (IG) aux animaux du groupe expérimental (n = 4). Les souris du groupe témoin ont reçu 0,3 ml d'eau de boisson par IG (n = 2). Pendant l'expérience, nous n'avons remarqué aucun changement comportemental chez les animaux testés ni aucune anomalie tissulaire. Après 24 h, les souris des deux groupes expérimental et témoin ont été sacrifiées dans une chambre CO₂-O₂ (CO2 Box, Bioscape, Merazet) avec collecte subséquente des tissus. La moitié des échantillons fraîchement collectés ont été congelés à −20 °C pour la spectrométrie d'absorption atomique (SAA). La seconde moitié des tissus a été fixée dans du formol tamponné à 4 % et transférée dans de l'éthanol à 70 % (après 24 h). Par la suite, les échantillons ont été déshydratés dans des concentrations croissantes d'éthanol, inclus dans de la paraffine (Leica TP1020, Leica EG1150) et des lames microscopiques de 6 µm d'épaisseur (ou 4 µm pour les examens histopathologiques) ont été préparées avec un microtome (Leica RM2255).

Accumulation de fer évaluée par coloration de Perl

Les lames de microscopie de rate, foie et cerveau ont été colorées selon la méthode de Perl (bleu de Prusse) pour la présence de fer. Les échantillons ont été déparaffinisés et réhydratés jusqu'à l'eau distillée, puis placés dans une solution de travail avec des parties égales de 5 % de ferricyanure de potassium (Sigma–Aldrich) et 5 % d'acide chlorhydrique (Sigma–Aldrich) et colorés pendant 30 min. Par la suite, les sections ont été rincées à l'eau et contre-colorées avec du rouge nucléaire rapide (Sigma–Aldrich) pendant 5 min, rincées à l'eau, et montées sous lamelles avec Permount (Fisher Scientific). Les images des échantillons colorés ont été prises en utilisant un microscope Olympus BX60 et le logiciel d'acquisition d'images Cell^P. Pour chaque échantillon testé, 16 images choisies au hasard ont été sélectionnées pour des examens ultérieurs avec MicroImage v.4.0 (Olympus) selon un protocole d'analyse d'image interne [29]. Pour les examens de rate, seule la pulpe rouge dans le tissu a été prise en compte lors des analyses. La teneur en fer a été calculée comme un rapport de la surface et de l'intensité des colorations positives au fer (couleur bleue) à la surface des noyaux cellulaires dans une image.

Concentration en fer dans les tissus testés mesurée par spectrométrie d'absorption atomique

Les échantillons de tissus précédemment collectés, stockés à −20 °C, et ensuite décongelés ont été préparés pour une évaluation quantitative ultérieure de la concentration en fer par la méthode de spectrométrie d'absorption atomique (SAA), selon le protocole décrit en détail auparavant [24]. Brièvement, les tissus ont été pesés et conservés pendant > 16 h dans une solution contenant 5 ml d'acide nitrique à 65 % et 1 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 % (Merck). Par la suite, les échantillons ont été minéralisés dans le système micro-ondes Ethos 900 (Milestone, USA) en solution liquide et évalués par SAA (Perkin-Elmer) pour la teneur en fer.

Analyse statistique

Les données obtenues dans l'étude ont été présentées comme une moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM). Pour l'évaluation statistique de l'accumulation de fer obtenue par coloration de Perl, une ANOVA à un facteur avec test post-hoc de comparaisons multiples de Tukey–Kramer a été réalisée pour tous les groupes. Pour évaluer une différence significative entre les groupes témoin et expérimental des analyses SAA, un test t non apparié a été utilisé. Les différences significatives entre les groupes témoin et expérimental dans les expériences in vitro ont été évaluées en utilisant une ANOVA à un facteur avec test de comparaisons multiples de Dunnett. Les analyses statistiques ont été calculées avec GraphPad InStat 3.10. Pour tous les tests, les résultats obtenus ont été considérés comme statistiquement significatifs avec P ≤ 0,05 et P ≤ 0,01 et P ≤ 0,001 comme hautement et extrêmement significatifs.

Résultats

Caractérisation des nanoparticules

Les images de microscopie électronique à balayage (MEB) des nanocristaux ZnO:Fe cristallisés dans le processus hydrothermal micro-ondes sont montrées à la Fig. 1. La poudre sèche stockée après la synthèse a été dispersée dans l'eau par bain ultrasonique, puis déposée sur la grille de cuivre 400. La suspension résultant du traitement ultrasonique a été laissée pendant 2 h pour l'agglomératation et la sédimentation des gros grains. Dans l'échantillon, on voit couramment des cristaux de ZnO formés sous la forme de prismes hexagonaux allongés. Les cristaux sont allongés dans la direction de croissance des plans c — [001]. L'intersection des prismes est clairement visible sur l'image : les hexagones font 50–100 nm de taille. Fondamentalement, les nanoparticules sont agglomérées et forment des structures plus grandes. À la Fig. 1b, il est montré une telle structure de cristaux ZnO:Fe fortement agglomérés et groupés. L'échantillon est également composé de grains non uniformes dont la distribution de taille contient entre centaines de nanomètres et micromètres. Il n'y a pas d'indication claire d'existence d'une phase séparée autre que ZnO, suggérant l'absence de cristallisation de phase à base de fer (par exemple oxyde de fer) [30].

L'analyse thermogravimétrique (ATG) et la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ont été effectuées sous flux d'argon de la température ambiante à 800 °C et les résultats obtenus sont montrés à la Fig. 2. La première perte de masse a eu lieu jusqu'à 200 °C et a causé une diminution de la masse de l'échantillon de 4,78 % par rapport à sa masse initiale. La seconde perte a été enregistrée entre 200 et 400 °C et sa valeur est d'environ 7,36 %. Il n'y a pas eu d'autres diminutions de masse jusqu'à 800 °C. La première était liée à l'évaporation des molécules d'eau adsorbées en surface et la seconde était probablement causée par une réduction des groupes hydroxyles. La courbe DSC montre un pic endothermique à 118,3 °C (−0,6175 mW/mg, évaporation de l'eau) et un pic exothermique à 283,1 °C (0,4356 mW/mg, décomposition des groupes hydroxyles). Le faible effet lié à la décomposition indiquait qu'une cristallisation presque complète des nanoparticules ZnO:Fe s'est produite dans le processus hydrothermal micro-ondes.

La Fig. 3 montre les spectres de photoluminescence à température ambiante des NPs ZnO:Fe. Le spectre d'émission (Fig. 3a) se compose de deux caractéristiques : une luminescence de bord de bande étroit (NBE) de faible intensité et une luminescence d'émission de niveau profond (DLE) très intense et large. La première culmine à ~ 380 nm tandis que la seconde à 600 nm. La dominance de l'intensité DLE sur le spectre suggère que les nanocristaux obtenus étaient fortement défauts au niveau cristallographique [31,32,33]. Le spectre d'excitation (Fig. 3b) indique le mécanisme d'émission depuis les niveaux profonds dans l'intervalle de bande de ZnO:Fe.

Le spectre de cathodoluminescence des NPs ZnO:Fe est montré à la Fig. 4 ; le rapport d'intensité DLE/NBE est ≈ 25. La bande NBE culmine à environ 380 nm, la bande DLE contient quatre composantes culminant à ~ 570, 625, 653 nm et très faible à 770 nm. Selon McCluskey et Jokela [34], la bande à 570 nm est liée aux lacunes d'oxygène, tandis que les autres ont été attribuées aux lacunes de zinc dans le réseau de type wurtzite [35].

La quantité de fer dans l'échantillon a été déterminée en utilisant deux techniques : la spectrométrie d'absorption atomique (SAA) et la spectrométrie de dispersion d'énergie des rayons X (EDX). Dans le cas de la SAA, la suspension préparée de manière similaire à celle utilisée dans l'expérience sur les rongeurs a été analysée pour indiquer 3,98 % atomique de Fe dans le ZnO:Fe. Par la méthode EDX, la poudre sèche a été analysée sur la grille de cuivre pour trouver une concentration de fer de 4,5 % at. par rapport aux ions zinc.

Les propriétés de la suspension ont été mesurées en utilisant les méthodes DLS et MET, avec la distribution des diamètres des nanoparticules montrée à la Fig. 5. La distribution est bimodale : pour une population, le diamètre le plus fréquent culminait entre 20 et 100 nm (MET) ainsi qu'entre 50 et 200 nm (DLS). La seconde population contient une quantité moindre d'objets plus grands de 100–500 nm (MET) et env. 150–500 nm (DLS). Le caractère bimodal des nanoparticules est clairement observé par les deux méthodes montrées. La grande dispersion des tailles dans la population plus grande indique qu'elle correspond aux nanoparticules agglomérées. Les nanoparticules en suspension aqueuse étaient chargées négativement comme révélé par un potentiel zêta inférieur à 0 V. Une valeur d'environ −40 mV indiquait également que la suspension aqueuse finale était stable et que les nanoparticules n'avaient pas d'affinité pour l'agglomératation.

Évaluation toxicologique in vitro des nanoparticules ZnO:Fe

Les deux analyses de viabilité cellulaire (XTT et Bleu de Trypan) ont révélé une diminution de l'absorbance des cellules Caco-2 incubées avec des NPs ZnO:Fe, ce qui se corrélait directement avec le nombre de cellules viables. Des changements statistiquement significatifs n'ont été observés qu'après une exposition de 24 h des cellules incubées aux concentrations les plus élevées de NPs (1,0 et 0,1 mg/ml), tandis que les niveaux physiologiques de concentration de NPs (0,01 et 0,001 mg/ml) n'avaient pas d'effet significatif sur les cultures cellulaires (Fig. 6 et 7).

Distribution du fer dans le modèle animal

Pour évaluer l'accessibilité in vivo du fer à partir des NPs ZnO:Fe, des souris (n = 4) ont reçu par voie orale une suspension de NPs ZnO:Fe et, après 24 h, les animaux ont été sacrifiés avec collecte des tissus cruciaux. L'évaluation quantitative de la teneur en fer dans les tissus examinés a été analysée par la méthode SAA pour tous les organes collectés et calculée avec le logiciel Micro Image (basé sur la coloration de Perl) pour les tissus du foie, de la rate et du cerveau. Présentées à la Fig. 8, les données montrent un niveau accru de teneur en fer (vs. témoin) dans le cœur, le muscle squelettique, la rate et les tissus de l'intestin grêle 24 h après l'administration orale de NPs ZnO:Fe (pas d'augmentation statistiquement significative). Dans le cas de l'os, le niveau moyen de fer dans le groupe expérimental n'était que légèrement plus élevé que dans le résultat témoin. La teneur en fer dans les tissus du foie et du cerveau était significativement augmentée (P ≤ 0,01) 24 h après l'administration IG de NPs ZnO:Fe, vs. groupe témoin (Fig. 8). Dans les reins, les tissus adipeux viscéraux et sous-cutanés, et les poumons, les niveaux de Fe ont chuté 24 h après l'administration de NPs ZnO:Fe.

L'évaluation de la teneur en fer colorée selon la méthode de Perl dans le foie a révélé une augmentation extrêmement significative (P ≤ 0,001) du niveau de Fe chez tous les animaux expérimentaux vs. témoins (Fig. 9b). De même, les résultats obtenus pour la pulpe rouge du tissu de rate ont montré une augmentation extrêmement significative (P ≤ 0,001) de la teneur en fer chez tous les animaux expérimentaux vs. témoins (Fig. 10b). Les données obtenues de l'analyse du tissu cérébral n'ont indiqué aucune augmentation de Fe dans le groupe expérimental 24 h après l'administration IG de NPs ZnO:Fe (Fig. 11b).

Dans le cas de la teneur en fer de chaque animal des groupes expérimental et témoin, les résultats ont été recueillis aux Fig. 9a, 10a et 11a. Le niveau de fer le plus élevé et significativement différent (P ≤ 0,05 et P ≤ 0,01) dans le tissu hépatique a été détecté pour la souris – 2 (24 h 2), comparé aux résultats du groupe témoin (Fig. 9a). Les niveaux de coloration au fer dans les pulpes rouges de la rate au sein du groupe expérimental étaient similaires ; cependant, la plupart d'entre eux étaient statistiquement plus élevés (P ≤ 0,05 ou P ≤ 0,01) que la souris – 1 (TÉMOIN 1) du groupe témoin (Fig. 10a). Les résultats obtenus pour le tissu cérébral étaient similaires entre chaque animal des groupes expérimental et témoin (Fig. 11a).

Les sections de tissus hépatiques et spléniques colorées selon la méthode de Perl ont également été évaluées qualitativement. Un nombre accru de dépôts de fer (colorations bleu clair) était visible au sein des hépatocytes des sections hépatiques du groupe expérimental (Fig. 12).

Une accumulation générale plus importante de fer (colorations bleues) au sein de la pulpe rouge que dans la pulpe blanche de la rate a été observée dans les groupes témoin et expérimental (Fig. 13). Après l'application de NPs ZnO:Fe, le niveau plus élevé de fer était particulièrement visible dans la pulpe rouge, comparé aux images du groupe témoin (Fig. 13c, d). Dans le groupe expérimental, une concentration accrue de fer était également noticeable autour des vaisseaux sanguins (Fig. 13b, d).

Discussion

Comme mentionné dans la section « Introduction », la carence en fer est un trouble nutritionnel considérable dans la population humaine, ainsi que dans d'autres espèces mammaliennes [3, 7, 8]. Par conséquent, la mise en œuvre de nouvelles stratégies de supplémentation en fer plus efficaces et sûres semble hautement souhaitable. Les résultats présentés actuellement proviennent d'études préliminaires visant des investigations plus détaillées liées à l'utilisation potentielle de NPs biodégradables de ZnO dopées au Fe comme nouvelle stratégie pour la supplémentation en fer. Comme confirmé précédemment, les NPs à base de zinc fabriquées en interne subissent une absorption très efficace après leur administration orale avec une distribution rapide ultérieure vers les organes et tissus majeurs de l'organisme vivant [22,23,24]. De plus, nous avons rapporté que ces nanostructures démontraient une biosécurité et une biodégradabilité dans le corps ainsi qu'une élimination rapide de l'organisme [36]. Employée dans l'étude actuelle, la voie orale d'administration des NPs fournit un moyen hautement efficace de livraison rapide des nanostructures exogènes au corps, basé sur le processus de persorption [37, 38]. De plus, cette stratégie diminue le risque d'effets toxiques éventuels liés à l'administration de substances dopées au fer, en raison de l'existence de « mécanismes de sécurité » physiologiques liés à l'absorption du Zn et du Fe depuis le tractus gastro-intestinal. Ces voies physiologiques cruciales de distribution du fer peuvent être contournées en cas d'application intraveineuse/intramusculaire de substances dopées au fer [14], ce qui peut entraîner une augmentation de la possibilité d'effets secondaires toxiques liés au fer. L'examen des voies d'internalisation des nanoparticules, leur dynamique et les systèmes cellulaires impliqués dans le processus font actuellement l'objet d'études dans le cadre d'une autre publication. Dans l'article actuel, nous avons décidé de montrer l'effet global de nos nanoparticules sur l'organisme vivant, en nous concentrant sur l'effet du fer.

La toxicité des nanostructures peut être liée à diverses caractéristiques du matériau, pas seulement à la composition chimique, mais aussi par exemple à la taille, la forme, ou leur capacité à s'agglomérer [39]. Néanmoins, il a été confirmé que les NPs plus petites étaient mieux absorbées que les plus grandes et qu'un rapport surface/volume élevé rend les particules de certains métaux exceptionnellement réactives et cytotoxiques [40, 41]. Les nanostructures étaient capables de pénétrer dans les cellules et d'affecter leurs composants, ce qui altérait la viabilité des cellules [42, 43]. Dans l'une des investigations précédentes sur la cytotoxicité de NPs de ZnO ou FeO, les auteurs n'ont pas observé d'effets toxiques (basés sur la capacité des cellules examinées à croître et se diviser), même à de hautes doses de NPs [44]. Présentée ici est une étude réalisée sur la lignée cellulaire Caco-2, comme modèle des cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, révélant une faible toxicité des nanomatériaux utilisés. Les NPs ZnO:Fe à faibles doses physiologiques (0,001 mg/ml et 0,001 mg/ml) n'ont pas altéré la viabilité des cellules (Fig. 6 et 7). Après l'incubation des cellules Caco-2 avec de fortes doses de NPs ZnO:Fe, une diminution statistiquement significative de la viabilité a été observée. Cependant, l'IC50 (concentration inhibitrice moitié maximale), comme mesure de l'efficacité d'une substance à inhiber une fonction biologique ou biochimique spécifique, est restée étonnamment élevée — autour de 1 mg/ml (Fig. 6 et 7). La chute observée de la viabilité cellulaire était probablement associée au dépôt physique des nanoparticules sur la surface et au surstress des cellules plutôt qu'à un effet cytotoxique lié aux nanoparticules elles-mêmes. Dans une autre étude, les auteurs ont conclu à une diminution de l'IC50 de cellules de lignée cancéreuse après incubation avec des NPs de ZnO et ZnO:Fe₃O₄ et un effet cytotoxique relativement faible (et non-dépendant de la dose) des NPs examinées sur des cellules non cancéreuses [45]. Des observations similaires ont également été rapportées pour des NPs de ZnO et de platine [46, 47]. Néanmoins, des examens supplémentaires sur le profil de toxicité chronique de tels composites incluant le profilage de l'activité antioxydante, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), et l'utilisation d'autres cellules et lignées cellulaires doivent être effectués.

Les résultats obtenus dans l'expérience in vivo indiquaient une distribution rapide des NPs ZnO:Fe vers les tissus principalement liés à l'homéostasie du fer (Fig. 8, 9 et 10). Des études similaires, concernant la biodisponibilité du fer sous forme « nano », ont été principalement réalisées sur des animaux anémiques ou examinées après une période de déplétion en fer [18, 19, 48], alors que nos études préliminaires ont été menées sur des souris saines, normalement maintenues. La comparaison des données présentées dans le travail actuel avec des études similaires peut être trompeuse en raison des différences dans les NPs employées, par exemple leur taille, forme et composition ou la voie, la dose et la fréquence de leur administration aux animaux. Les résultats du niveau de fer dans le foie ont montré un niveau significativement augmenté à 24 h après l'application de NPs ZnO:Fe, comparé au témoin (Fig. 8 et 9). L'accumulation de fer était visible dans les hépatocytes du tissu hépatique (Fig. 12), où le site de stockage majeur de l'élément a lieu [49]. De même, des études précédentes avec injection intrapéritonéale d'oxyde de fer magnétique NPs chez des rats ont également entraîné une accumulation de 55 % de ces nanomatériaux dans le foie à 6 h après l'injection [50]. De même, le niveau de fer de la rate dans l'étude actuelle était clairement plus élevé dans le groupe expérimental que dans le témoin (Fig. 8 et 10). Fait intéressant, une tendance à l'accumulation de fer a été détectée autour des vaisseaux sanguins dans la rate, ce qui pourrait indiquer le transfert de NPs ZnO:Fe depuis la circulation sanguine générale vers le tissu (Fig. 13b, d). L'accumulation primaire de nanostructures dans le foie et la rate après leur application pourrait également être attribuée à l'élimination via les phagocytes mononucléaires dans ces tissus, comme postulé précédemment [50,51,52].

Dans le cas du tissu cérébral, la mesure du niveau total de fer (méthode SAA) a montré un niveau significativement plus élevé de l'élément chez les animaux ayant reçu préalablement des NPs ZnO:Fe (Fig. 8), ce qui n'a pas été confirmé par l'analyse basée sur la coloration de Perl (Fig. 11). L'incohérence entre les deux méthodes employées dans l'étude peut être liée à la sensibilité de la coloration de Perl. Cette méthode histologique de visualisation du fer est dédiée à la détection d'agrégats de fer. Le fer contenu sous forme « nano », en plus distribué dans le tissu sans dépôts physiologiques de ces éléments, pourrait ne pas être assez sensible pour colorer ces dépôts extrêmement petits de fer. La possibilité de franchir la barrière hémato-encéphalique avec nos nanostructures fabriquées a déjà été décrite [23, 24, 53]. Dans une autre étude, avec administration intrapéritonéale de NPs d'oxyde de fer maghémite superparamagnétiques chez des souris, aucune accumulation de fer dans le groupe expérimental n'a été détectée, ni dans le cerveau ni dans les tissus cardiaques, ce qui est incohérent avec nos résultats [52]. Une autre étude, axée sur un modèle de distribution de NPs magnétiques d'oxyde de fer dans l'organisme vivant, a indiqué un mécanisme de circulation similaire des nanostructures qu'en notre étude — niveau accru de Fe dans le cerveau et le cœur après administration de NPs [51]. L'augmentation du niveau de fer dans le tissu cardiaque peut être causée par la présence de NPs ZnO:Fe dans la circulation sanguine générale et par conséquent son niveau plus élevé dans le tissu. De même, le niveau plus élevé de fer dans un muscle squelettique détecté dans les analyses SAA est probablement lié à une circulation sanguine intensive dans ce muscle et dans le cas de l'intestin grêle, la teneur améliorée en fer est causée par les résidus de NPs administrées par voie orale.

Conclusions

En conclusion, nous avons réalisé l'étude préliminaire sur la distribution de NPs biodégradables ZnO:Fe comme nouvelle stratégie de supplémentation prometteuse dans la carence en fer. Le dépôt de fer dans le corps de souris après administration orale des nanostructures a été détecté dans les tissus cruciaux, où le site de stockage majeur de l'élément a lieu. Nous supposons que les résultats obtenus dans l'étude pourraient indiquer les NPs biodégradables ZnO:Fe comme de bons vecteurs de fer exogène dans l'organisme vivant. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre complètement les mécanismes exacts du dépôt, de l'élimination et de l'influence des NPs ZnO:Fe sur le corps.

Disponibilité des données et matériaux

Les conclusions de l'étude suivante sont basées sur les données présentées dans ce manuscrit.

Abréviations

NPs :

Nanoparticules

ZnO:Fe NPs :

Nanoparticules d'oxyde de zinc dopées au fer

IG :

Intra-gastrique

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

MEB :

Microscopie électronique à balayage

PL :

Spectroscopie de photoluminescence

CL :

Spectroscopie de cathodoluminescence

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

Cellules Caco-2 :

Cellules d'adénocarcinome du côlon caucasien

DMEM :

Modification de Dulbecco du milieu d'Eagle

FBS :

Sérum fœtal bovin

NEAA :

Acides aminés non essentiels

PSN :

Pénicilline–streptomycine–néomycine

EDTA :

Acide éthylènediaminetétraacétique

SAA :

Spectrométrie d'absorption atomique

ESM (dans l'analyse statistique) :

Erreur standard de la moyenne