Synthèse et étude in vitro d'une sonde bimode ciblant l'intégrine αvβ3

Contexte

L'infiltration tumorale maligne et les métastases à distance constituent la principale cause d'échec thérapeutique. Le processus de métastase tumorale maligne nécessite la destruction de la matrice extracellulaire (MEC) et de la néovascularisation tumorale [1]. Par conséquent, la surveillance non invasive in vitro des marqueurs moléculaires liés à la néovascularisation tumorale est particulièrement cruciale dans la prédiction des métastases tumorales et le diagnostic précoce. Intégrine α_{v 3} , un marqueur moléculaire largement étudié de la néovascularisation tumorale, a reçu une grande attention. Cette intégrine est étroitement associée à l'adhésion, la prolifération et la différenciation des cellules endothéliales vasculaires au cours de la néovascularisation tumorale [2].

Les progrès de l'imagerie moléculaire ont permis un suivi non invasif de la croissance tumorale au niveau moléculaire. Les études d'imagerie moléculaire des molécules cibles d'intérêt doivent avoir deux éléments de base :(1) des composants de ciblage appropriés et (2) des composants de signal qui peuvent être détectés par des techniques d'imagerie. Intégrine α_{v 3} , qui reconnaît spécifiquement et se lie à la séquence arginine-glycine-aspartate (Arg-Gly-Asp, RGD) dans les protéines ECM, est activé par des changements de conformation. Ainsi, la séquence RGD a été largement utilisée dans la synthèse de traceurs de ciblage tumoral en tant que composant de ciblage important [3]. L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est devenue l'un des outils de diagnostic d'imagerie moléculaire les plus puissants pour la surveillance des tumeurs en raison de son rayonnement non ionisant, de sa haute résolution dans les tissus mous et de sa profondeur de pénétration non limitative [4, 5]. L'analyse statistique a indiqué qu'environ 50 % des examens IRM nécessitent l'utilisation d'agents de contraste pour améliorer la qualité des images [6, 7]. L'imagerie par fluorescence dans le proche infrarouge est un type d'imagerie optique, et la longueur d'onde de la lumière proche infrarouge, qui est la première lumière non visible découverte, va de 700 à 900 nm. Les techniques d'imagerie par fluorescence dans le proche infrarouge permettent aux chirurgiens de visualiser, de délimiter et de réséquer les tumeurs pendant les interventions chirurgicales [8, 9]. Cependant, avec les changements dans le spectre des maladies humaines, l'imagerie moléculaire monomode ne répond pas aux exigences du diagnostic de précision en raison de ses taux élevés de faux positifs et de faux négatifs. Ainsi, les techniques d'imagerie moléculaire basées sur l'intégration de plusieurs modes seront une nouvelle tendance dans le développement de l'imagerie moléculaire [10].

Dans cette étude, nous avons préparé une sonde moléculaire bimode cRGD-Gd-Cy5.5 qui peut être utilisée dans l'imagerie histologique et fonctionnelle des tumeurs (Schéma 1). Par rapport aux sondes moléculaires avec Fe₃ O₄ comme unité de signal [11, 12], cRGD-Gd-Cy5.5 était remarquable avec (a) un paramagnétisme élevé (sept électrons non appariés autour de Gd ^{3 +} ); (b) capacité à se lier au support pour former un agent de chélation stable, tel que Magnevist largement utilisé en clinique; (c) une résolution spatiale élevée et une définition d'image supérieure à celle des agents de contraste négatifs [13, 14]. Nous avons sélectionné les liposomes comme molécule porteuse qui relie l'agent de contraste MR à l'agent de contraste de fluorescence. Les phospholipides courants ont deux longues chaînes hydrocarbonées hydrophobes et un groupe hydrophile dans leurs structures moléculaires. Lorsqu'elles sont ajoutées à de l'eau ou à une solution tampon, des quantités appropriées de molécules de phospholipides prennent des dispositions dans des directions spécifiques, leurs groupes hydrophiles faisant face à la phase aqueuse des deux côtés et les chaînes hydrocarbonées hydrophobes se faisant face pour former la bicouche dans les liposomes. Des peptides cycliques ciblant RGD et des molécules fluorescentes Cy5.5 ont été conjugués à la surface du liposome par l'intermédiaire d'un phospholipide de polyéthylène glycol (PEG) introduit avec des groupes amino, et enfin, des ions Gd ont été encapsulés dans les liposomes pour réaliser la construction de la sonde moléculaire multimodale ciblée avec des caractéristiques souhaitables en termes de structure, composition, taille, forme, stabilité et relaxivité RM. Sa cytocompatibilité a été évaluée par un test de cytotoxicité et une observation de la morphologie cellulaire. Enfin, le potentiel de cRGD-Gd-Cy5.5 pour l'imagerie par résonance magnétique pondérée en T1 et l'imagerie par fluorescence des cellules cancéreuses in vitro a été évalué.

La voie de synthèse des liposomes dopés au Gd, suivie de la conjugaison RGD et Cy5.5 pour les bio-applications, pour une détection très sensible de l'intégrine α_{v 3}

Résultats

Caractérisation de la nanosonde cRGD-Gd-Cy5.5

La solution de cRGD-Gd-Cy5.5 était un liquide limpide rose pâle, sans précipitation évidente après un certain temps de repos, indiquant une bonne dispersion. La microscopie électronique à transmission (MET) a révélé l'apparence du complexe liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 sous la forme d'une forme sphérique de taille uniforme, sans agrégation de granules ni dommage après coloration négative avec 2 % de phosphotungstate de sodium, comme le montre la figure 1a. La distribution de la taille des particules était cohérente, allant de 50 à 80 nm, avec une taille de particule moyenne de 60,08   ± 0,45 nm. La taille des particules hydratées du complexe liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) était de 124,2 ± 0,215 nm (Fig. 1b). Comme le montre la figure, les nanoparticules présentaient une distribution de taille étroite dans l'eau et une bonne dispersion. Le potentiel zêta de surface était de 39,5 ± 1,65 mV, montrant une charge de surface positive, ce qui est cohérent avec la présence de groupes amino sur la surface (Fig. 1c).

Données de caractérisation de la nanosonde CRGD-GD-CY5.5. un Images TEM à faible grossissement de cRGD-Gd-Cy5.5. b La taille des particules a été détectée par analyse granulométrique et la taille moyenne de la sonde était de 124,2 nm. c Le potentiel zêta est d'environ 39,5 mV, la surface apparente est électropositive

Le test multifonctionnel sur microplaque a montré que les liposomes à blanc n'ont pas de région d'absorption UV et que les liposomes couplés à la Cy5.5 fluorescente dans une lumière d'excitation de 600 nm ont un pic d'absorption évident à 685 nm (Fig. 1a), cohérent avec la longueur d'onde d'émission de la Cy5.5 fluorescente . Des molécules fluorescentes ont montré que Cy5.5 était couplé avec succès. Les résultats du système d'imagerie par fluorescence pour petits animaux ont montré que sous la lumière d'excitation de 600 nm, le Cy5.5 fluorescent conjugué au liposome avait une fluorescence rouge évidente, tandis que le liposome vierge n'avait aucun signal de fluorescence (Fig. 2b).

Propriétés de fluorescence de la nanosonde cRGD-Gd-Cy5.5. un Le liposome marqué avec la fluorescence Cy5.5 a été détecté par un analyseur enzymatique multifonctionnel, et il y avait un pic d'émission visible à 670 nm à une lumière d'excitation de 600 nm. b Sous une lumière d'excitation de 600 nm, le Cy5.5 fluorescent couplé aux liposomes (à gauche) a une luminescence évidente, tandis que le liposome vierge (à droite) n'a pas d'imagerie par fluorescence

Relaxométrie IRM de la nanosonde cRGD-Gd-Cy5.5

Le taux de relaxation r1 est un paramètre important pour évaluer les performances d'imagerie des agents de contraste T1 MR. Par conséquent, nous avons mesuré le temps de relaxation T1 de la sonde cRGD-Gd-Cy5.5 avec différentes concentrations de Gd. Comme le montre la figure 3b, le taux de relaxation r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 était de 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹ après ajustement linéaire, bien supérieur à celui du produit clinique Magnevist (4,56 mM ⁻¹ s ⁻¹ ). Le taux de relaxation r1 élevé de cRGD-Gd-Cy5.5 peut être le résultat de la structure spatiale spéciale des liposomes porteurs et de l'effet d'amplification du signal biologique des liposomes. À mesure que la concentration en Gd augmentait, cRGD-Gd-Cy5.5 augmentait l'intensité du signal MR (Fig. 3a). Ces résultats ont démontré que le cRGD-Gd-Cy5.5 synthétique répond aux besoins de contraste d'image élevé en IRM.

Les propriétés de relaxation des nanosondes cRGD-Gd-Cy5.5. un T1- images pondérées (Siemens, Verio,3.0T, MOLLI, séquence :TR = 5,8 ms, TE = 3,66 ms, TI = 16–3200 ms) de ces particules à différentes concentrations (Gd). b Les courbes d'ajustement de la concentration en Gd et du temps de relaxation ; la valeur r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 était de 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹

Étude de cytotoxicité de la nanosonde cRGD-Gd-Cy5.5

La cytotoxicité in vitro de cRGD-Gd-Cy5.5 a été évaluée par le test CCK-8, avec une comparaison avec la viabilité des cellules dans le groupe non traité (100 %). Toutes les cellules ont montré une viabilité cellulaire supérieure à 70 % dans la plage des concentrations de Gd testées (50 à 400 μM) (Fig. 4), indiquant que cette sonde moléculaire a une bonne compatibilité cellulaire. Notamment, la viabilité cellulaire était toujours supérieure à 70 % même après 24 h d'incubation avec 400 μM de Gd, une concentration nettement supérieure aux dosages utilisés in vitro et in vivo.

Test de cytotoxicité. Viabilité cellulaire de l'adénocarcinome pulmonaire humain (A549), de la lignée cellulaire de carcinome nasopharyngé (SUNE-1-5-8F), de la cellule endothéliale de la veine ombilicale humaine (HUVEC) et de la lignée cellulaire normale du sein (MCF10A) incubées avec différentes concentrations de cRGD-Gd- Cy5.5 pendant 24 h

Coloration par immunofluorescence et dosage par cytométrie en flux de l'intégrine vβ3

Les résultats de l'immunofluorescence ont montré que l'expression de l'intégrine αvβ3 dans les cellules A549 et 5-8F était localisée dans la membrane cellulaire et le cytoplasme. L'intégrine des cellules A549 était principalement localisée dans la membrane cellulaire et l'intensité de fluorescence à la surface des cellules A549 était plus élevée que celle des cellules SUNE-1-5-8F. L'intensité de fluorescence des cellules MCF-10A était extrêmement faible, démontrant que presque aucune intégrine αvβ3 n'était exprimée à la surface des cellules épithéliales mammaires (Fig. 5a). Les résultats de la cytométrie en flux sont présentés sur la figure 5c. Les niveaux d'expression de l'intégrine vβ3 se classent comme suit :A549 (89,07 %) > SUNE-1-5-8F (63,84 %) > MCF-10A (1,56 %), indiquant que les niveaux d'αvβ3 dans les cellules cancéreuses étaient significativement plus élevés que ceux du sein normal. cellules glandulaires.

Images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) des cellules A549, SUNE-1-5-8F et MCF-10A. un Images d'immunofluorescence cellulaire de l'intégrine vβ3. Lignée cellulaire A549 et SUNE-1-5-8F exprimée dans la membrane cellulaire, les cellules MCF-10A presque aucune expression de l'intégrine _{v 3} . b Cellules A549, SUNE-1-5-8F et MCF10A incubées avec cRGD-Gd-Cy5.5 à 200 μg mL ^-1 concentration à 37 °C pendant 1 h. La quantité de sondes liées aux cellules concorde avec les résultats de l'immunofluorescence cellulaire. c Test de cytométrie en flux pour la détection des expressions de l'intégrine αvβ3 dans les cellules A549, SUNE-1-5-8F et MCF-10A

Captation cellulaire de cRGD-Gd-Cy5.5

Sur la base des résultats de la coloration par immunofluorescence, les cellules A549 et 5-8F incubées avec cRGD-Gd-Cy5.5 ont été utilisées comme groupes expérimentaux, tandis que les cellules MCF-10A incubées avec cRGD-Gd-Cy5.5 ont été utilisées comme groupe de contrôle. Après incubation avec cRGD-Gd-Cy5.5, des signaux de fluorescence rouge ont été observés dans la membrane des cellules A549 et 5-8F, l'intensité du signal dans les cellules A549 étant supérieure à celle des cellules SUNE-1-5-8F (Fig. 5b). Ce résultat est cohérent avec l'expression de l'intégrine αvβ3 détectée par coloration par immunofluorescence. Presque aucun signal de fluorescence rouge n'a été trouvé dans la membrane des cellules MCF-10A dans le groupe témoin.

Imagerie IRM in vitro et imagerie par fluorescence

Sur la base de son taux de relaxation r1 élevé et de sa bonne compatibilité cellulaire, cRGD-Gd-Cy5.5 a été utilisé comme agent de contraste positif pour l'imagerie par résonance magnétique des cellules cancéreuses in vitro. Comme le montrent les figures 6a, b, la couleur des images IRM pondérées en T1 est progressivement devenue plus lumineuse, indiquant que l'intensité du signal MR des cellules A549 traitées avec cRGD-Gd-Cy5.5 augmentait avec des concentrations de Gd plus élevées. La différence dans le temps de relaxation T1 entre les deux groupes était statistiquement significative, comme indiqué par le t test pour deux échantillons indépendants (p < 0,05). Ces données suggèrent que le cRGD-Gd-Cy5.5 synthétique a le potentiel d'être utilisé comme agent de contraste positif dans l'imagerie par résonance magnétique in vitro des cellules cancéreuses. De même, un système de fluorescence pour petits animaux a montré une augmentation correspondante de l'intensité de fluorescence à mesure que la concentration de la sonde augmentait (Fig. 6c). À partir du signal d'image et des données spécifiques, l'effet d'imagerie du groupe cible (cRGD-Gd-Cy5.5) était meilleur que celui du groupe non-ciblé (Gd-Cy5.5).

Imagerie par résonance magnétique cellulaire et fluorescence. un Les cellules ont été incubées avec des cellules A549 pendant 2 h selon les concentrations en Gd :0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04 et 0,08 (mM). Le Gd-Cy5.5 a été utilisé comme groupe témoin. b Temps de relaxation T1 de l'image de résonance magnétique correspondante. c Images du système d'imagerie en direct des petits animaux

IRM in vivo et imagerie par fluorescence

Les images IRM acquises avant l'injection d'agents de contraste n'ont montré aucune différence de signal significative entre les tumeurs et les autres organes/tissus périphériques. À 5 min après l'injection de CRGD-Gd-Cy5.5, l'intensité du signal au niveau des sites tumoraux a commencé à être renforcée, mais une hyperintensité stable a été maintenue depuis 6 h après l'injection. Dans le groupe test, une intensification du parenchyme tumoral a été observée depuis 30 min, et le renforcement a été renforcé à 2 h (Fig. 7a). Dans le groupe récepteur-bloqué, cependant, seul un renforcement léger a été trouvé aux marges des tumeurs, et le degré de renforcement a été affaibli à 2 h et a déjà disparu (Fig. 7a). Sur les images de fluorescence, l'intensité de fluorescence dans le groupe ciblé s'est progressivement améliorée depuis la 30e minute, mais était toujours élevée à la sixième heure (Fig. 7b), indiquant que la circulation sanguine était étendue et que CRGD-Gd-Cy5.5 s'est efficacement concentré dans tumeurs. Dans le groupe récepteur-bloqué, aucune concentration de sonde spécifique n'a été observée à aucun des moments testés. Une fluorescence de haute intensité au niveau du rein bilatéral a été observée à la sixième heure (Fig. 7b). Nous en déduisons que la voie métabolique de CRGD-Gd-Cy5.5 peut être la clairance par le système rénal.

IRM et imagerie par fluorescence de modèles de tumeurs de xénogreffe sous-cutanée de carcinome du nasopharynx de souris nude. un Des souris nues ont été anesthésiées et imagées avec un scanner IRM 3.0-T avant l'injection et à 0,5, 2 et 6 heures après l'injection. b Des souris nues ont été anesthésiées et imagées avec un système d'imagerie par fluorescence à 0,5, 2 et 6 h après l'injection

Discussion

L'intégrine αvβ3 est fortement exprimée non seulement dans les cellules endothéliales de la néovascularisation tumorale, mais également à la surface d'une variété de cellules tumorales, telles que le mélanome malin, le gliome malin, le cancer de la prostate, le cancer du poumon et les cellules cancéreuses du sein [15], tandis que αvβ3 n'est pas exprimé ou exprimé à de faibles niveaux dans les cellules épithéliales régulières et les cellules endothéliales vasculaires matures. Sur la base des propriétés ci-dessus, l'intégrine αvβ3 est devenue une cible idéale pour le suivi in ​​vivo des métastases tumorales [16]. Cependant, les méthodes actuelles de mesure des niveaux d'expression de l'intégrine vβ3 posent encore des problèmes de non-invasivité, de répétabilité et de rapidité d'imagerie, qui restent à résoudre. Compte tenu des problèmes objectifs ci-dessus, une sonde moléculaire bimode a été synthétisée dans cette étude pour la surveillance dynamique en temps réel de l'expression de l'intégrine αvβ3, ce qui a indirectement atteint l'objectif de prédire et de surveiller les métastases tumorales.

Les agents de contraste peuvent être divisés en deux types selon le mécanisme de l'IRM :les composés Gd (agent de contraste T1-positif) et les nanoparticules d'oxyde de fer paramagnétique (agent de contraste T2-négatif). Par rapport à d'autres agents de contraste, les composés Gd présentent des avantages inégalés en pratique clinique [17]. L'ion Gd, qui est un matériau superparamagnétique, fournit un signal de haute intensité dans les images pondérées en T1. Gd peut également se lier à une variété de substances pour former des complexes stables avec une résolution spatiale élevée et un rapport signal/bruit élevé. Cependant, chaque type d'agent de contraste a ses propres limites (à savoir, le temps de circulation sanguine court des agents de contraste T1 et les artefacts de susceptibilité magnétique des agents de contraste T2) [18,19,20,21]. Les composés Gd traditionnels ont les limitations suivantes. (1) Les chélates de Gd traditionnels n'ont pas d'effet de ciblage. (2) L'intensité du signal des agents de contraste chélates Gd est inférieure à celle des particules d'oxyde de fer superparamagnétiques ultrapetites (USPIO) à la même concentration. Pour résoudre les problèmes ci-dessus, les ions Gd sont liés à des structures macromoléculaires (telles que des liposomes, des molécules dendritiques et du dextrane) pour améliorer l'effet de relaxation T1 [22], et le complexe est ensuite lié au ligand des cibles tumorales pour préparer des sondes moléculaires. et réaliser une imagerie ciblée sur la tumeur [23]. Dans cette étude, les liposomes ont été sélectionnés comme molécule porteuse qui relie les agents de contraste MR aux agents de contraste fluorescents. La structure spatiale spéciale des liposomes a un effet d'amplification du signal biologique et améliore efficacement la concentration d'ions Gd dans les tissus locaux, améliorant ainsi l'intensité du signal RM. Zhou et al. [24] ont utilisé des nanoparticules de silsesquioxane oligomère polyédrique lié à la β-cyclodextrine (POSS) comme support pour coupler les composés RGD aux composés Gd afin d'obtenir avec succès une sonde moléculaire, cRGD-POSS-βCD-(DOTA-Gd), avec un taux de relaxation T1 de 9,50 mM ⁻¹ S ⁻¹ . Le complexe liposome-cRGD-Gd-Cy5 obtenu dans cette étude s'est avéré avoir un taux de relaxation T1 de 10,515 mM ⁻¹ S ⁻¹ , qui est plus du double du taux de relaxation T1 de l'agent Gd actuellement utilisé en clinique (Magnevist), et ce complexe a également présenté d'excellentes propriétés d'imagerie par résonance magnétique.

La nanosonde préparée par notre groupe a une taille uniforme, un aspect régulier et une bonne dispersibilité. Le potentiel zêta reflète la stabilité de la sonde moléculaire, et une valeur positive ou négative plus élevée du potentiel zêta est associée à un système plus stable et à moins de possibilité d'agrégation. En général, les molécules avec des potentiels zêta supérieurs à + 30 mV ou inférieurs à - 30 mV sont considérées comme ayant une bonne stabilité. Le potentiel zêta à la surface de la particule sonde obtenu dans cette étude était de + 39,5 ± 1,65 mV, ce qui est légèrement inférieur à + 30 mV. Néanmoins, aucune agrégation n'a été observée sous TEM.

Les agents Gd sont les agents de contraste IRM les plus largement utilisés dans la pratique clinique actuelle, et leur biosécurité ne peut être ignorée. Guo et al. [25] ont trouvé qu'un complexe Gd couplé à de l'acide hyaluronique dendritique était une microparticule très sûre et efficace en tant qu'agent de contraste IRM, avec une sensibilité élevée et une faible présence résiduelle dans le corps humain. Grâce à l'étude de la cytotoxicité in vitro de la sonde moléculaire construite, il a été démontré que cette sonde moléculaire a une faible cytotoxicité et une haute biosécurité pour les cellules tumorales ainsi que les cellules non tumorales (cellules épithéliales et cellules endothéliales vasculaires). Nous pensons que les liposomes ont une bonne biocompatibilité et que la faible biotoxicité peut être un avantage du liposome encapsulant les ions Gd.

Sur la base d'études antérieures [26,27,28], notre groupe a sélectionné la lignée cellulaire d'adénocarcinome pulmonaire A549 avec une expression élevée de l'intégrine αvβ3 pour une utilisation dans le groupe expérimental, avec l'ajout innovant de la cellule de carcinome nasopharyngé SUNE-1-5-8F lignée dans les expériences de ciblage cellulaire in vitro; des cellules épithéliales mammaires avec presque aucune expression de l'intégrine αvβ3 ont été incluses comme groupe témoin négatif. La sonde moléculaire s'est bien liée à la membrane cellulaire des cellules d'adénocarcinome pulmonaire A549 et des cellules de carcinome nasopharyngé SUNE-1-5-8F mais ne s'est pas liée aux cellules MCF-10A, indiquant que la sonde a une excellente capacité de ciblage moléculaire, ce qui a été confirmé par les résultats du test d'immunofluorescence. Les résultats de l'imagerie par résonance magnétique ont en outre confirmé la propriété de ciblage de la sonde moléculaire liposomale cRGD-Gd-Cy5.5 en IRM, avec des signaux d'intensité supérieure à celle de l'agent de contraste non ciblé (Gd-Cy5.5) dans les cellules tumorales. Des expériences in vivo confirment que les sondes peuvent rester stables dans le sérum et cibler de manière persistante les sites tumoraux pendant au moins 6 h. Les résultats des études in vitro garantissent des études in vivo ultérieures de la sonde moléculaire dans un modèle métastatique de carcinome nasopharyngé chez la souris nude.

Conclusions

En résumé, la méthode de préparation de la sonde bimode cRGD-Gd-Cy5.5 ciblant l'intégrine αvβ3 est réalisable, et cette sonde présente une stabilité et une biosécurité souhaitables et un taux de relaxation T1 élevé. La sonde a montré un fort effet de ciblage vers les cellules avec une expression élevée de l'intégrine vβ3, ce qui a jeté des bases solides pour une surveillance dynamique non invasive, efficace et en temps réel des métastases tumorales au niveau anatomique et au niveau métabolique moléculaire via l'imagerie moléculaire par IRM/fluorescence in vivo.

Méthodes

Synthèse de cRGD-Gd-Cy5.5

À 20 mL de chloroforme, 70 mg de lécithine, 20 mg de cholestérol et 210 mg de DSPE-PEG2000-NH ont été ajoutés, et le mélange a été placé dans un nettoyeur à ultrasons pour dissoudre complètement les substances (comme indiqué par une solution claire sans substances granulaires). La solution a ensuite été placée dans un ballon en forme de poire pour une évaporation rotative dans un bain-marie à 60 °C jusqu'à ce qu'un film en nid d'abeille (pas de résidu liquide) se soit formé. Le trichlorure de Gd hexahydraté (10 mg) a été pesé avec précision et dissous dans un tampon carbonate à pH 8,5 pour obtenir une solution claire, qui a ensuite été mélangée avec le film en nid d'abeille ci-dessus pour hydratation à 50 °C pendant 1 h ; cette étape a été suivie d'une dispersion et d'un raffinement à travers une sonde à ultrasons dans un processeur liquide à ultrasons (VCX 750, Sonics, USA). Enfin, le mélange a été collecté et passé à travers un filtre de 0,22 µm et soumis à une ultrafiltration avec un tube d'ultrafiltration de 10 kD pour éliminer le trichlorure de Gd libre et obtenir des liposomes contenant du trichlorure de Gd, qui ont ensuite été conservés à 4 °C.

Le peptide cyclique RGD a ensuite été couplé à la molécule fluorescente Cy5.5. Le peptide cyclique RGD (5 mg) a été dissous dans 1 ml de tampon d'acide chlorhydrique dilué à pH 5,0 et 1 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) et 0,5 mg de N -hydroxysuccinimide (NHS) ont été ajoutés puis activés à température ambiante pendant 30 min dans un oscillateur à température constante. La molécule de peptide cyclique RGD activé a ensuite été mélangée avec 100 ug de la molécule fluorescente Cy5.5 et du liposome, et le pH a été mesuré à 8,4 à l'aide d'un papier de test de pH de précision. Le mélange a ensuite été incubé à température ambiante dans un agitateur pendant 4 h ; cette étape a été suivie par l'élimination du peptide cyclique RGD n'ayant pas réagi et de la molécule fluorescente Cy5.5 à l'aide d'un tube d'ultrafiltration de 10 kD.

Caractérisation des nanoparticules

La taille des particules des nanoparticules a été déterminée par TEM (GEOL Tokyo, Japon). Une petite quantité de complexe liposome-cRGD-Gd-Cy5.5 a été ajoutée à de l'eau ultrapure (pH = 6,0) pour dilution dans une solution à 1 mg/mL. Une goutte de l'échantillon a été placée sur une grille de cuivre revêtue à l'aide d'une pipette de transfert stérile, et 2 % de phosphotungstate de sodium ont été ajoutés goutte à goutte après quelques minutes pour la recoloration. Un excès de solution de coloration négative a été aspiré après 1 à 2 min. La grille de cuivre a ensuite été séchée et placée sous un microscope électronique à transmission 80 kV pour observation. Environ 40 à 50 nanoparticules ont été sélectionnées au hasard pour observer leur morphologie et la taille de leurs particules, et des images à l'échelle de 50 nm et 100 nm ont été enregistrées. La taille des particules a été mesurée à l'aide du logiciel NanoMeasure et la moyenne a été calculée à partir de trois mesures répétées.

Un granulomètre (Malvern, Royaume-Uni) a été utilisé pour mesurer la taille hydrodynamique et le potentiel zêta des nanoparticules. Une goutte de solution de complexe liposome-cRGD-Gd-Cy5.5 a été diluée avec de l'eau ultrapure, puis transférée dans un tube Eppendorf, qui a été placé dans un nettoyeur à ultrasons pendant 5 minutes pour disperser les particules uniformément. Les particules dispersées ont été évaluées par DLS dans l'analyseur de taille de nanoparticules pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta.

Les propriétés optiques du complexe liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 ont été caractérisées à l'aide d'un lecteur de microplaques multifonctionnel (BioTek, USA). Deux microlitres chacun de solution de liposomes et de liposomes-cRGD-Gd-Cy5.5 ont été ajoutés à 998 μL de tampon phosphate salin (PBS) et bien mélangés avant d'être ajoutés à une cuvette en quartz ; l'absorption ultraviolette à 400-800 nm a ensuite été obtenue via un lecteur de microplaques multifonction. La solution du complexe liposome-cRGD-Gd-Cy5.5 (1,5 ml) a été transférée dans un tube Eppendorf, et la même quantité de solution de liposome vide a été utilisée comme témoin à blanc. L'imagerie par fluorescence a été réalisée à l'aide d'un système d'imagerie par fluorescence pour petits animaux.

La modification des groupes amino de surface sur les liposomes a été confirmée par spectroscopie FT-IR (Nicolet-5700, USA). Le spectre d'absorption UV-vis a été obtenu (UV 2550, Shimadzu, Japon); une concentration de 0,1 mg/mL de cRGD-Gd-Cy5.5 liposomal a été utilisée pour la mesure.

Mesure du taux de relaxation

L'échantillon de sonde de fluorescence liposomale chargé en Gd modifié par cRGD a été dilué avec de l'eau déminéralisée pour obtenir les concentrations de Gd suivantes :0,18, 0,1275, 0,085, 0,0425 et 0,017 mM. Cinq millilitres de chaque échantillon dilué ont été placés dans un flacon avec un bouchon à vis, et les flacons ont ensuite été fixés sur un support de tubes multifonctionnel selon l'ordre de la concentration. L'échantillon de sonde fluorescente liposomale chargé de Gd modifié par cRGD a subi un balayage IRM à travers les bobines de la tête et du cou pour obtenir des images pondérées en T1 pour les différentes concentrations de la sonde. La séquence de balayage utilisée pour les images pondérées en T1 était une séquence de récupération d'inversion look-locker modifiée (MOLLI), où les paramètres étaient définis comme suit :temps de répétition (TR) = 5,8 ms, temps d'écho (TE) = 3,66 ms, inversion temps de récupération (TI) = 16–3200 ms et épaisseur de numérisation = 5 mm. Une fois la numérisation terminée, une carte en pseudo-couleurs a été obtenue. A 0,3 cm ² la zone d'intérêt a été délimitée dans l'image de chaque échantillon de la carte, et la valeur T1 correspondante a été lue.

Culture cellulaire et test de cytotoxicité

Des cellules d'adénocarcinome pulmonaire humain A549, des cellules de carcinome nasopharyngé humain SUNE-1-5-8F, des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) et des cellules épithéliales mammaires humaines MCF-10A ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . The cells were cultured in complete 1640 medium (Euroclone-Lonza) containing 10% fetal bovine serum (Euroclone-Lonza), 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 2 mM glutamine under 5% CO₂ at 37 °C.

The CCK-8 method was used to examine the cytotoxicity of the molecular probe to different cells, including normal epithelial cells and tumor cells. A549 cells, 5-8F cells, HUVECs, and MCF-10A cells were seeded in a 96-well plate at a density of 5 × 10 ³ cells/well and cultured overnight. The adherent cells were then incubated with 100 μL of fresh 1640 medium containing cRGD-Gd-Cy5.5 of various Gd concentrations (0, 50, 100, 200, and 400 μM) for 24 h. Subsequently, the cells were washed three times with PBS and then incubated with 100 μL of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing no fetal bovine serum (FBS). After 10% Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan) was added to each well, the sample was incubated for 10 h. The absorbance at 450 nm of each well was then measured using an ELISA microplate reader (Multiskan MK3, Thermo Scientific, Logan, UT). Cells treated with PBS only were employed as the control group. For each sample, five parallel wells were analyzed to obtain the mean and standard deviation.

Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry Assay of Integrin αvβ3

A total of 20,000 A549, 5-8F, and MCF-10A cells each were seeded in confocal plates (Thermo Scientific) and cultured for approximately 24 h when the cells successfully grew on the slides. The cells were washed three times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (Boster) at room temperature for 30 min, and then washed three times (10 min each) in PBS. The cells were then incubated in 3% bovine serum albumin (PBST) for 30 min to block non-specific antibody binding and washed three times with PBS. The fixed cells were incubated with anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody (1:500; Abcam, Cambridge, UK) at 4 °C overnight and then incubated with anti-mouse fluorescent secondary antibody (1:500) (Abcam) for 1 h. 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma) was used to stain the nucleus. A laser confocal scanning microscope (Nikon A1, Tokyo, Japan) was used to detect the green fluorescence signal from integrin αvβ3 and the DAPI signal from nuclei.

The integrin αvβ3 expression levels in different cell lines were quantified using flow cytometry. In brief, three types of cells were collected:A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A, which were washed in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). After being sealed with the PBS containing 5% BSA, the cells were cultivated in VNR-1 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) at density 2 μg/1 × 10 ⁶ and 4 °C for 30 min. The secondary antibody was DyLight 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (ab96879), diluted 1/500, and at 22 °C for 30 min. Quantitative assays were conducted on a flow cytometer (Gallios, Beckman Coulter, USA) at excitation wavelength 488 nm and emission wavelength 530 nm. Each time, at least 1 × 10 ⁵ cells (n  = 3) were collected.

Binding Assay of the Molecular Probe to Integrin αvβ3

A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A cells were inoculated into confocal plates. The cells were incubated at 37 °C for 1 h with the molecular probe of the same Gd concentration after the cells reached the logarithmic growth phase. The cells were then washed three times in PBS and placed under a laser confocal scanning microscope for observation.

In Vitro MR Imaging and Fluorescence Imaging of Tumor Cells

To verify the tumor cell-targeting ability of the cRGD-modified Gd-loaded liposomal fluorescent probe, the probe was incubated with A549 cells and then examined using MR imaging and a small animal fluorescence imaging system. A549 cells were seeded in six-well plates with 2 mL of 1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin–streptomycin in each well and then incubated at 37 °C and 5% CO₂ . In the experimental groups, cRGD-Gd-Cy5.5 was incubated with A549 cells for 2 h with Gd concentrations of 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 mM. The cells of the control groups were incubated with the non-targeted gadolinium contrast agent (Gd-Cy5.5) for 2 h at the same Gd concentrations as the experimental groups. The cells were then washed with PBS, trypsinized, centrifuged, and finally placed in glass tubes containing 1 mL of PBS (with 0.5% agarose) for MR imaging. Specific imaging parameters were described above. A small animal live imaging system (IVIS Lumina XRMS Series III, MA, USA) was used for fluorescence imaging of the A549 cells.

In Vivo MR and Fluorescence Imaging

To validate whether CRGD-Gd-Cy5.5 had tumor targetability in vivo in animals, we conducted animal experiments following the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, released by the Animals Ethics Committee of Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. We successfully established a Balb/c nude mice nasopharyngeal carcinoma subcutaneous xenografting tumor model for magnetic resonance/fluorescent scanning. A 3.0-T MRI scanner containing 40-mm-diameter mouse volume coils (Discovery 750, GE, Germany) was used for T1-weighted imaging, operated at field of view = 80 × 80 mm, repetition time = 742 ms, echo time = 69 ms, and layer thickness = 2.0 mm. The nude mice were divided into two groups (n  = 3), including a test group and a receptor-blocked group. All mice were injected via tail vein with CRGD-Gd-Cy5.5 (0.05 mmol Gd/kg). Each mouse was scanned at four time points:before injection, 30 min, 2 h, and 6 h after injection. In the receptor-blocked group, 1 h before injection with CRGD-Gd-Cy5.5, each mouse was injected via the tail vein with free CRGD polypeptide (10 mg) and was MRI-scanned at the same four time points. The fluorescent images were photographed by a fluorescence imaging system (Bruker, USA). The grouping, drug injection, and scanning time points were all the same as described above. During the imaging, the mice (n  = 3) were anesthetized using a gas mixture of oxygen and isoflurane. The nude mice were kept at heart rate 60–120/min and respiratory rate at 20–40/min. Finally, direct visual comparison of tumor images was conducted by two experienced radiologists.

Abréviations

DLS:

Dynamic light scattering

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

ECM:

Extracellular matrix

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

FBS:

Containing no fetal bovine serum

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cells

MOLLI:

Modified look-locker inversion

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PEG:

Polyethylene glycol

RGD:

Arginine–glycine–aspartate

TE:

Echo time

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TI:

Inversion recovery time

TR:

Repetition time

USPIOs:

Iron oxide particles