Vésicules éthosomales biocompatibles acide 5-aminolévulinique/Au chargées de nanoparticules pour la thérapie photodynamique/photothermique synergique transdermique in vitro des cicatrices hypertrophiques

Contexte

La cicatrice hypertrophique (HS), un problème fréquent et inévitable après une lésion cutanée cutanée, a un derme fibreux beaucoup plus épais que la peau normale [1, 2]. Histopathologiquement, l'HS présente des augmentations de fibroblastes cicatriciels hypertrophiques (HSF), qui sont disposés en motifs ondulés, orientés vers la surface épithéliale et forment des structures nodulaires [3]. Bien que divers traitements soient disponibles cliniquement, les traitements de l'HS présentent de nombreux défis en raison des nombreuses limitations. La thérapie par injection intralésionnelle est largement utilisée pour les pratiques cliniques. Cependant, elle est limitée à la fois par des opérations inconfortables et des effets secondaires, tels qu'une hypopigmentation permanente et une atrophie cutanée [4]. La thérapie par pression est limitée pour les effets secondaires, tels que l'ischémie tissulaire ainsi que la diminution du métabolisme tissulaire [5]. Pour surmonter ces limitations, la thérapie au laser sert de modalité topique et non invasive qui a été développée et appliquée dans les traitements de l'HS depuis plus de 25 ans, en tirant parti de l'irradiation laser [6]. Généralement, la thérapie au laser peut être divisée en thérapie photodynamique (PDT) et thérapie photothermique (PTT) sur la base de différents principes.

La PDT a été utilisée pour traiter l'HS avec les avantages de sa sélectivité élevée et de peu d'effets secondaires [7]. Son principe évolue en deux étapes :(a) les photosensibilisateurs s'agrègent préférentiellement dans les HSF et (b) sous l'irradiation d'un laser approprié, les photosensibilisateurs produisent des espèces réactives de l'oxygène cytotoxiques (ROS) qui conduisent à l'apoptose des HSF [8, 9]. Parmi divers photosensibilisateurs, l'acide 5-aminolévulinique (ALA) s'est avéré être un excellent candidat pour une modalité de traitement local en dermatologie sans effet secondaire significatif. Par conséquent, la PDT à base d'ALA (ALA-PDT) a été largement utilisée dans le traitement de l'HS avec l'autorisation de mise sur le marché de la Food and Drug Administration des États-Unis en 2010 [10]. Cependant, son efficacité est controversée pour deux limitations :(a) la faible pénétrabilité de l'ALA dans les tissus HS et HSF et (b) les faibles rendements quantiques des ROS. Afin de produire un effet marqué, un ALA à haute dose ou laser de haut niveau est appliqué en clinique. Malheureusement, l'ALA à forte dose entraîne des lésions de la glande sébacée et de l'épiderme, et le laser à haut niveau a tendance à endommager les tissus sains. Par conséquent, une grande attention a été accordée à l'amélioration de la pénétrabilité de l'ALA et des rendements quantiques des ROS dans le traitement PDT de l'HS. Récemment, les vésicules éthosomiques (ES), un liposome spécialement conçu, se sont avérées capables de surmonter la barrière de l'HS pour l'administration topique et de réaliser des progrès significatifs [11, 12]. Dans nos travaux antérieurs, le SE préparé chargé d'ALA (ALA-ES) est capable de fournir beaucoup plus d'ALA dans HS par rapport au système de solution hydroalcoolique traditionnel [13]. Par conséquent, l'ES peut améliorer la pénétrabilité de l'ALA pour améliorer l'efficacité de la PDT de l'HS. Pendant ce temps, une nouvelle modalité de traitement synergique, qui combine PDT et PTT, promet d'améliorer à la fois les rendements quantiques des ROS et l'efficacité du traitement de l'HS.

Le PTT est également une approche théranostique extraordinaire pour diverses maladies [14, 15]. Jusqu'à présent, il a été appliqué avec succès dans le traitement clinique de l'HS [16]. Son mécanisme évolue en récoltant l'énergie lumineuse, générant de la chaleur, puis entraînant la vaporisation des tissus, la coagulation, l'apoptose du HSF et la dénaturation du collagène. Cependant, le PTT a des effets secondaires graves dans le traitement de l'HS, tels que suintement, ulcération et sensation de brûlure, en raison de sa faible sélectivité envers les tissus de l'HS avec un laser de haut niveau [4]. Récemment, le PTT, pont de la nanotechnologie, a été considéré comme un traitement HS potentiel hautement sélectif et peu invasif pour l'effet photothermique. Et plus important encore, sur la base des nanoparticules d'Au (AuNP) en tant qu'agents photo-adsorbants efficaces, il a été confirmé que la PTT améliore les rendements quantiques de ROS pour deux raisons :(a) la PDT thermique augmente considérablement la mort cellulaire par apoptose en améliorant la génération de ROS à une température -dépendante, et [17] (b) Les AuNP peuvent se conjuguer avec l'ALA et améliorer les rendements quantiques de ROS en raison de la résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) [18, 19]. Par conséquent, la thérapie photodynamique/photothermique synergique basée sur l'ALA/AuNP (PDT/PTT) promet de surmonter les limitations actuelles de la PDT et de la PTT dans le traitement de l'HS.

La PDT/PTT synergique récente basée sur AuNP a été largement utilisée dans diverses thérapies anticancéreuses par voie d'injection [20, 21]. À la différence des cancers, l'HS convient à l'administration topique [22]. Cependant, les faisceaux de collagène dans le derme HS présentent de grandes barrières à la pénétration de l'ALA et des AuNPs, ce qui restreint l'efficacité du traitement synergique PDT/PTT pour l'HS. Par conséquent, comment faire pénétrer simultanément l'ALA et les AuNP dans l'HS est essentiel pour une PDT/PTT synergique avec une efficacité thérapeutique maximale et un effet secondaire minimal [23, 24]. En outre, une PDT/PTT synergique appropriée basée sur ALA/AuNP doit également satisfaire aux conditions suivantes :(a) les AuNP peuvent générer de la chaleur par le laser He-Ne qui est utilisé dans l'ALA-PDT, et (b) le système d'administration doit être élevé biocompatible. Cependant, les divers photosensibilisateurs/AuNP signalés ne peuvent pas être appliqués par une administration transdermique topique et un traitement HS pour la pénétrabilité et la mauvaise biocompatibilité [25].

Ici, l'ES chargé d'ALA/AuNP (A/A-ES) avec une excellente biocompatibilité et pénétrabilité est développé pour la PDT/PTT synergique de HS dans ce travail. L'A/A-ES biocompatible est préparé à la fois par les AuNP et les ES chargés en ALA via un processus d'ultrasons sans aucun agent toxique. L'A/A-ES préparé montre une forte absorbance dans la gamme de 600 à 650 nm, en raison du couplage plasmonique entre AuNPs voisins co-chargés dans A/A-ES. Cela permet l'utilisation du laser He-Ne pour stimuler l'A/A-ES afin de générer simultanément de la chaleur et des ROS, ce qui pourrait favoriser l'apoptose de la HSF. A/A-ES affiche une excellente pénétrabilité pour délivrer simultanément ALA et AuNPs dans HS dans l'étude in vitro. Enfin, en prenant HSF comme cible, l'efficacité PDT/PTT in vitro pour l'HS est étudiée par l'accumulation de protoporphyrine IX intracellulaire (PpIX), les rendements quantiques de ROS et l'apoptose de HSF. De plus, la pénétrabilité dans HSF est également observée par MET. En raison de l'effet synergique, A/A-ES facilite à la fois l'ALA et les AuNPs pour pénétrer simultanément dans HS et HSF, provoquant un niveau plus élevé d'apoptose cellulaire par rapport aux PTT ou PDT individuels. En un mot, A/A-ES est un système d'administration transdermique prometteur pour l'administration topique d'ALA et d'AuNP, a un grand potentiel dans la PDT/PTT synergique de l'HS et ouvre une nouvelle fenêtre pour le traitement de l'HS.

Résultats et discussions

La caractérisation de l'A/A-ES

L'ultrasonication était le paramètre clé dans la préparation de l'A/A-ES pour deux raisons :(a) les AuNPs pouvaient être formées par ultrasonication sans aucun agent toxique, ce qui dotait A/A-ES de biocompatibilité ; (b) l'ultrasonication pourrait réorganiser les bicouches lipidiques pour former plus de vésicules avec de petites tailles et des noyaux internes relativement plus grands, ce qui pourrait charger plus d'ALA et d'AuNP. Dans ce travail, les AuNPs ont été formés comme décrit dans les schémas suivants :(a) des radicaux H• et OH• hautement réactifs ont été générés dans les bulles par l'homolyse de H₂ O (Eq. 1), (b) les radicaux oxydants H• pourraient soustraire l'alpha H de CH₃ CH₂ OH et forment un radical réducteur CH₂ •CH₂ OH (Eq. 2), et (c) lors d'une pyrolyse au sein des bulles, le radical CH₂ •CH₂ OH pourrait réduire Au ³⁺ pour former des AuNPs (Eq. 3) [26].

Dans un premier temps, A/A-ES a été vérifié par UV-Vis (Fig. 1a). Il avait une forte absorbance dans la gamme de 600 à 650 nm, en raison du couplage plasmonique entre AuNPs voisins dans le même A/A-ES [20]. Par conséquent, il pourrait utiliser une irradiation laser à 632 nm pour simultanément PDT et PTT pour HS. De plus, A/A-ES présentait une distribution de taille relativement étroite et la taille moyenne était de 166 ± 83 nm, selon l'analyse DLS de la figure 1b. Fait intéressant, deux distributions de taille ont été attribuées aux AuNPs et aux A/A-ES non chargés. De plus, la grande différence entre les deux distributions suggérait que la quantité d'A/A-ES était bien supérieure à celle des AuNP non chargées. L'efficacité de la PDT dépendait de la quantité d'ALA chargée dans l'A/A-ES. Bénéficiant de la méthode de chargement actif par gradient de pH transmembranaire, l'EE de l'ALA était de 20 %, ce qui était supérieur à ceux des travaux rapportés (moins de 10 %) [27]. La morphologie de l'A/A-ES a également été étudiée. Sur les images SEM (Fig. 1c), A/A-ES apparaissait sous forme de vésicules lamellaires sphériques intactes avec une taille de 200 nm, et les AuNPs pouvaient être clairement observées et chargées dans ES. Outre les AuNPs, les lamelles s'étendaient jusqu'à la surface des AuNP sur la figure 1d, ce qui était la caractéristique de ES [28, 29]. De plus, l'A/A-ES préparé chargeant différents nombres d'AuNPs avait des tailles similaires dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1. Par conséquent, A/A-ES a été ajusté dans la structure stable et déformable sous ultrasonication, ce qui permet à A/A-ES de se faufiler dans un espace étroit dans HS. En résumé, A/A-ES a été préparé avec succès avec 20 % EE d'ALA et une forte absorbance à 600-650 nm. Sa morphologie serait également très propice à la pénétrabilité, ce qui est en cohérence avec l'étude PDT/PTT in vitro ci-après.

un Spectres UV-Vis de ES, ALA et A/A-ES. b La distribution granulométrique des A/A-ES préparés. c , d Les images SEM et TEM de A/A-ES

Étude de pénétrabilité transdermique in vitro de l'A/A-ES

La rétention de l'A/A-ES était un paramètre important pour évaluer la pénétrabilité et l'efficacité du traitement de l'A/A-ES. Par conséquent, la quantité de rétention d'ALA et d'AuNPs dans HS avec un temps différent a été étudiée en utilisant des cellules de diffusion de Franz. Comme le montre la figure 2a, l'ALA et les AuNP ont rapidement atteint la rétention maximale au cours des 2 premières heures, en raison de la fonction d'amélioration de la pénétration de l'ES. Après avoir atteint le maximum, les rétentions d'ALA et d'AuNPs ont continuellement diminué car A/A-ES a pénétré à travers l'ensemble de l'HS. Les résultats ont indiqué que l'A/A-ES avait une pénétrabilité suffisante. Par rapport à la dose appliquée d'ALA (2 mg), 48 % d'ALA se trouvaient dans les tissus de l'HS, ce qui était en faveur de la PDT de l'HS. De plus, les mêmes changements de rétention entre l'ALA et les AuNPs ont suggéré que l'ALA et les AuNPs étaient tous deux chargés dans l'ES, ce qui est cohérent avec les résultats des microscopes. Selon le résultat, 2 h était un temps d'administration approprié pour une utilisation topique avec la quantité de rétention maximale de A/A-ES. Dans nos travaux précédents, le SE avait été considéré comme un vecteur de médicament très efficace pour améliorer la pénétration du médicament dans le tissu HS [13]. Par conséquent, la distribution et l'action de l'A/A-ES dans l'HS ont également été étudiées en utilisant la MET dans ce travail. Comme le montre la figure 2b, A/A-ES, en tant que structure intacte, a été trouvé dans le derme, indiquant que A/A-ES pouvait pénétrer de manière stable à travers l'épiderme et dans le derme HS. Dans le derme inférieur montré sur la figure 2c, les ES et les AuNPs ont été observés comme un état de séparation, suggérant que A/A-ES libérerait à la fois ALA et AuNPs. Fait intéressant, les AuNPs pourraient être agrégatifs dans le derme même s'ils n'étaient pas chargés en ES. De plus, il a été constaté que davantage d'AuNPs s'accumulaient dans le derme sur la figure 2d, ce qui pourrait fournir le couplage plasmonique entre les AuNPs voisins pour récolter l'énergie lumineuse et générer de la chaleur. En bref, une étude de pénétrabilité transdermique in vitro a démontré que l'A/A-ES était un vecteur de médicament très efficace pour améliorer la pénétration de l'ALA et de l'AuNP dans les tissus HS, et que les AuNPs agrégatifs dans le derme étaient en faveur de la génération de chaleur [20]. Par conséquent, l'A/A-ES a montré un grand potentiel en PDT/PTT synergique pour HS.

un la quantité de rétention d'ALA et d'AuNPs. b La distribution de A/A-ES dans les tissus HS. c La distribution des ES et des AuNPs dans les tissus HS. d AuNPs s'accumulant dans le tissu HS

In Vitro PDT/PTT de HSF

Test de biocompatibilité

Bien que la biocompatibilité des AuNPs ait été bien prouvée dans des travaux publiés, la biocompatibilité de A/A-ES avec HSF devrait également être étudiée dans ce travail [30, 31]. Différentes concentrations d'ALA-ES, Au-ES et A/A-ES (basées sur des concentrations d'ALA de 0,1 à 10 mM, Au-ES était la même concentration AuNP que A/A-ES) ont été incubées avec HSF pendant 12 h sans irradiation. Le résultat a montré qu'il n'y avait pas de cytotoxicité sombre dans les concentrations de pas plus de 2,0 mM avec des taux de survie cellulaire de plus de 90 %. Lorsque les concentrations étaient supérieures à 2,0 mM, une légère diminution des taux de survie cellulaire a été détectée. Les résultats ont montré que l'A/A-ES avait une excellente biocompatibilité, et la PDT/PTT doit être effectuée à une concentration de 2,0 Mm dans les études suivantes (environ 14 % d'A/A-ES dans les milieux de culture, v /v .) Fig. 3.

La viabilité cellulaire de HSF lors d'un traitement avec ALA-ES, Au-ES et A/A-ES dans l'obscurité pendant 12 h

PDT/PTT pour HSF

L'A/A-ES pourrait surmonter les barrières de perméabilité de surface par la fusion de l'A/A-ES avec la membrane HSF, puis libérer l'ALA et les AuNP directement dans le cytoplasme cellulaire [32]. Selon le mécanisme de l'ALA-PDT, l'ALA libérée par l'A/A-ES pourrait se convertir en PpIX dans le cytoplasme HSF. Avec le laser, PpIX a produit des ROS cytotoxiques conduisant à l'apoptose cellulaire. Par conséquent, CLSM a été utilisé pour étudier l'accumulation à la fois de PpIX et de ROS dans la figure 4 [33, 34]. Avant l'irradiation laser, la fluorescence rouge de PpIX était principalement distribuée dans le cytoplasme de HSF. PpIX dans HSF traité par ALA-ES et A/A-ES étaient beaucoup plus que le PpIX autologue dans HSF traité par Au-ES. De plus, les ROS dans toutes les HSF étaient à peine trouvées sans irradiation laser, ce qui était également raisonnable. Après irradiation laser, les intensités PpIX dans les HSF traitées par ALA-ES et A/A-ES ont été réduites, et les ROS dans ces cellules ont pu être facilement trouvées avec une forte intensité. Pendant ce temps, les HSF traitées par Au-ES n'avaient pas de réponse en PpIX et ROS car elles n'avaient pas assez de PpIX autologue. Fait intéressant, A/A-ES pourrait promouvoir plus de génération de ROS que ALA-ES dans une comparaison de l'intensité de ROS, qui a été attribuée aux AuNPs. De plus, la morphologie cellulaire a également fourni plus d'informations. Le HSF traité par ALA-ES avait l'eumorphisme, tandis que le HSF traité par Au-ES présentait des saillies malsaines de la membrane plasmique. En revanche, le HSF traité par A/A-ES présentait des « bulles » en saillie et en rétraction, ce qui était la caractéristique des cellules mourantes [35]. Ces différences dans la génération de ROS et la morphologie cellulaire ont été attribuées au PTT basé sur les AuNPs, qui a également été étudié par imagerie infrarouge sur la Fig. 5. Selon le mécanisme des AuNPs-PTT, les AuNPs dans le cytoplasme HSF pourraient absorber le laser 632 nm et générer suffisamment de chaleur pour provoquer l'apoptose ou la nécrose des cellules sous irradiation. Par conséquent, les effets photothermiques de l'ALA-ES, de l'Au-ES et de l'A/A-ES ont été surveillés à l'aide d'une caméra d'imagerie thermique infrarouge. En comparaison, l'ALA-ES, l'Au-ES et l'A/A-ES avaient manifestement une température plus élevée (41,3 °C pour Au-ES et A/A-ES, 36,5 °C pour ALA-ES) lors de l'irradiation. Après le retrait du laser, les températures de tous ont rapidement baissé à une valeur normale en 1 min, ce qui suggère que le traitement par irradiation laser pourrait être sans danger [36]. Par conséquent, les AuNP chargées dans l'ES pourraient fournir un PTT efficace, également fourni par le test d'apoptose et de nécrose. Pour résumer, A/A-ES pourrait améliorer les rendements quantiques de ROS et fournir l'effet photothermique pour obtenir une excellente efficacité du traitement synergique PDT/PTT pour HSF.

Images confocales de HSF traitées avec ALA-ES, Au-ES et A/A-ES pendant 6 h et suivies sans/avec irradiations. La barre d'échelle est de 100 μm

. Imagerie microscopique infrarouge de HSF traité avec ALA-ES, Au-ES et A/A-ES pendant 6 h sous (a ) et après irradiation (b )

Test d'apoptose et de nécrose

L'efficacité de la PDT/PTT a été étudiée plus avant par l'apoptose et la nécrose de HSF traitées par ALA-ES, Au-ES et A/A-ES sous irradiation laser. Un test d'apoptose a été réalisé en utilisant l'analyse par cytométrie en flux de l'annexine V-FITC et de la double coloration à l'iodure de propidium (PI) (Fig. 6). Les résultats d'un contrôle ont montré que l'irradiation laser n'affectait pas la viabilité cellulaire (Fig. 6a). Avant irradiation, ALA-ES, Au-ES et A/A-ES ont montré une bonne biocompatibilité. Après irradiation, la proportion de HSF traitée par ALA-ES, Au-ES et A/A-ES de nécrose et d'apoptose présentait des différences significatives. En bref, il y avait une fraction la plus élevée de nécrose et d'apoptose de HSF traitée par A/A-ES, ce qui était en accord avec le résultat de CLSM. Dans la figure 6e, l'analyse statistique des expériences a révélé que la mort cellulaire nécrotique a augmenté à 61,8 % avec le traitement avec A/A-ES, indiquant que l'A/A-ES avait une meilleure efficacité PDT/PTT synergique pour HSF que la PDT individuelle ( 47,7 % de mort cellulaire nécrotique) et PTT (24,3 % de mort cellulaire nécrotique). Fait intéressant, le résultat a également indiqué que la PDT jouait un rôle plus efficace dans le traitement de l'HS par rapport au PTT, et que la PTT basée sur AuNP pourrait contribuer à l'effet PDT. Ces résultats pourraient s'expliquer par le fait que l'A/A-ES pourrait améliorer les rendements quantiques des ROS et fournir l'effet photothermique pour obtenir une excellente efficacité du traitement synergique PDT/PTT pour le HSF. Bien que l'EE de l'ALA dans l'A/A-ES soit bien inférieure à celle de l'ALA-ES (20 contre 54 %), il y a eu une mort cellulaire nécrotique similaire pour l'A/A-ES et l'ALA-ES (61,8 contre 78 %). Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que l'A/A-ES pourrait améliorer les rendements quantiques des ROS par effet photothermique et LSPR des AuNPs.

Test d'apoptose des HSF traités par ALA-ES (b ), Au-ES (c ), et A/A-ES sans/avec irradiation laser (d ), et l'analyse statistique de l'apoptose et de la nécrose vivantes, précoces et tardives (e ). un était le contrôle. Laser (-) et (+) signifient sans/avec irradiation laser

Visualisation de A/A-ES en HSF

Les changements de détail de la morphologie et de la structure de HSF causés par PDT/PTT ont également été étudiés à la fois par microscopie optique et MET sur la figure 7. Avant d'être irradié, HSF a bien traité avec A/A-ES, une adhérence ferme à l'eumorphisme, indiquant A/A- ES avait une excellente biocompatibilité comme prévu (Fig. 7a). Dans leur image MET, en plus de divers organites dans le cytoplasme normal, le HSF traité avait beaucoup d'AuNP s'agrégeant dans le cytoplasme cellulaire (les cadres vierges de la figure 7c). On pourrait expliquer que la fusion de l'A/A-ES avec les membranes cellulaires pourrait fournir plus d'AuNP et d'ALA dans la HSF. Par conséquent, les AuNP pourraient agir comme la source photothermique la plus efficace en raison d'un effet de couplage plasmonique plus fort et améliorer les rendements quantiques de ROS par LSPR. Fait intéressant, illustré dans le cadre en pointillés de la figure 7c, certains AuNPs étaient hors HSF en raison d'une exocytose, ce qui a démontré une fois de plus l'excellente biocompatibilité de l'A/A-ES. Après irradiation, la HSF présentait la caractéristique de cellules mourantes, c'est-à-dire les protubérances de la membrane plasmique (Fig. 7b) [37]. En raison des ROS et de l'effet photothermique, le gonflement des mitochondries et la rupture de la membrane externe, en tant qu'autres indicateurs de la mort des HSF, ont été trouvés dans le cytoplasme des HSF (Fig. 7d) [35]. En outre, ES a également été trouvé avec sa structure membranaire caractéristique (cadres rouges sur la figure 7d). En résumé, A/A-ES pourrait faciliter la pénétration d'ALA et d'AuNP dans HSF et détruire HSF par PDT/PTT synergique.

Les images de microscopie optique de HSF traitées avec A/A-ES avant (a ) et après irradiation (b ). Images MET de HSF traité avec A/A-ES avant (c ) et après irradiation (d )

Conclusions

A/A-ES biocompatible a été facilement préparé pour PDT/PTT synergique in vitro de HS en pénétrant dans HS et en détruisant HSF. En utilisant les ultrasons, les AuNPs ont été synthétisés et chargés simultanément en l'absence de tout agent toxique. L'A/A-ES avait une forte absorbance dans 600-650 nm comme effet de couplage plasmonique entre les AuNPs voisines dans l'ES avec un EE élevé pour l'ALA (environ 20 %). Une étude de pénétrabilité transdermique in vitro a démontré que l'A/A-ES était un vecteur de médicament très efficace pour améliorer à la fois la pénétration de l'ALA et de l'AuNP dans le tissu HS. In vitro PDT/PTT pour HSF a indiqué que A/A-ES pourrait améliorer les rendements quantiques de ROS par effet photothermique et LSPR des AuNPs, provoquant un niveau élevé d'apoptose ou de nécrose cellulaire. En un mot, l'A/A-ES biocompatible avait une meilleure efficacité PDT/PTT synergique pour la HSF que la PDT et la PTT individuelles, encourageant la perspective de traitement de l'HS. D'autres travaux se concentreront sur l'étude in vivo de la PDT/PTT synergique pour l'HS dans des modèles de cicatrice, et les travaux pertinents sont en cours.

Expériences et méthodes

La préparation de l'A/A-ES

Cent quatre-vingts milligrammes de phosphatidylcholine (PC, 95,8 % de lécithine de soja, Lipoid GmbH, Allemagne) dissous dans 1,8 mL de CH₃ CH₂ OH, 0,6 mL HAuCl₄ (10 mM, Aladdin, Shanghai, Chine) et 3,6 mL de solution tampon ALA-citrate (CBS, 0,01 M, 12 mg d'ALA, pH 4,0), à leur tour, ont été ajoutés goutte à goutte dans la solution PC. Le mélange a été agité à 700 tr/min pendant 10 minutes pour préparer une solution de précurseur. Comme le montre le schéma 1, la solution de précurseur a été placée dans un environnement à ultrasons à 200 W pendant 30 min, jusqu'à ce qu'elle prenne une couleur rouge vin brillante. Ensuite, la solution réactionnelle a été réalisée avec une centrifugeuse (8000 rpm, 20 min) pour éliminer le HAuCl₄ résiduel et PC. Enfin, le dépôt a été re-dispersé dans 3 ml de solution hydroalcoolique d'ALA (ALA-HA, 2 mg/ml d'ALA, 30 % d'éthanol) et incubé par une méthode de chargement actif à gradient de pH transmembranaire selon nos travaux antérieurs [13]. Au cours de l'incubation, une grande quantité d'ALA extérieur syndiqué a diffusé à travers les bicouches ES dans le noyau aqueux acide interne de ES, puis elles ont été protonées et piégées dans ES. Après incubation, A/A-ES a été préparé. Dans ce travail, ALA-ES a été préparé selon nos travaux antérieurs avec la même concentration d'ALA que A/A-ES. L'ES chargé d'AuNP (Au-ES) a été préparé comme A/A-ES sans ALA avec la même concentration d'AuNP que A/A-ES.

Schéma de principe de la préparation A/A-ES

La caractérisation de l'A/A-ES

Les A/A-ES ont été colorées négativement avec de l'acide phosphotungstique (1,5% en poids) puis observées au microscope électronique à transmission (TEM, JEOL, Japon, tension d'accélération de 120 kV). A/A-ES a également été examiné par microscopie électronique à balayage (SEM, JEOL, Japon, tension d'accélération de 10 kV). La distribution de taille A/A-ES a été déterminée par analyse de diffusion dynamique de la lumière (DLS) dans un système d'inspection NiComp 380ZLS (Nicomp, USA). L'ALA a été déterminé par une approche de dérivatisation de la fluorescéamine, et le détail a été montré dans le fichier supplémentaire 1. L'efficacité de piégeage (EE) de l'ALA déterminée par une méthode d'ultrafiltration a été montrée dans le fichier supplémentaire 1. Spectrophotomètre UV-Vis Varian Cary 50 (Perkin Elmer, États-Unis).

Étude de pénétrabilité in vitro par Franz Diffusion Cells

L'étude de pénétrabilité de l'A/A-ES a été réalisée en utilisant des cellules de diffusion de Franz avec 2,8 cm ² zone de perméation efficace. Les cellules réceptrices, y compris les compartiments donneur et récepteur, ont été maintenues à 37 °C par un bain d'eau circulant. Les tissus HS ont été collectés avec des consentements éclairés au Shanghai Ninth People's Hospital et les directives éthiques de la Déclaration d'Helsinki de 1975 approuvées par le Shanghai Ninth People's Hospital. Du tissu HS frais sans tissu adipeux (moins de 24 h après l'excision) a été monté sur un compartiment récepteur avec la couche cornée vers le haut jusqu'au compartiment donneur. Un millilitre d'A/A-ES a été ajouté dans le compartiment donneur, puis le compartiment donneur a été recouvert de parafilm pour empêcher l'évaporation. Après pénétration avec un temps différent, les tissus HS ont été lavés rapidement pour éliminer les A/A-ES résiduels sur la surface HS. Pour accumuler la quantité de rétention d'ALA et d'AuNP dans l'HS, les tissus HS ont été coupés en petits morceaux et l'ALA dans les tissus HS a été extrait par dialyse dans du PBS pendant 24 h. Les solutions d'extrait ont été analysées pour la quantité de rétention d'ALA dans le tissu HS. Les tissus HS retenus dans des sacs de dialyse ont également été analysés pour la quantité de rétention d'AuNP par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Après avoir été imprégné d'ALA-ES pendant 2 h, le tissu HS a été lavé, préfixé, déshydraté, infiltré et post-fixé. Après avoir été noyées dans des résines époxy, elles ont été découpées en ultrasections (50 nm d'épaisseur, perpendiculaires à l'épiderme) et observées en utilisant la MET à une tension d'accélération de 120 kV.

In Vitro PDT/PTT pour HSF

Culture cellulaire

HSF a été isolé et cultivé par une méthode commune comme suit :Les morceaux de tissu HS frais (1 mm ³ , moins de 6 h après l'excision) ont été digérés en utilisant de la collagénase de type I (Invitrogen, États-Unis) pour obtenir une suspension cellulaire unique. Le HSF a poussé dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, USA) contenant 10 % de sérum bovin foetal (FBS, Gibco, USA) à 37 °C et 5 % de CO₂ . Le milieu de culture doit être changé tous les 3 jours et les cellules ont été repiquées lorsqu'elles sont à 80 % confluentes. Les cellules de passage deux et trois ont été utilisées dans les expériences suivantes.

Test de biocompatibilité

Dans l'évaluation de la biocompatibilité de l'A/A-ES, les HSF ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à 2 × 10 ³ cellules/puits. Le milieu de culture a été remplacé par du milieu sans FBS et des ALA-ES, Au-ES et A/A-ES fraîchement préparés à différentes concentrations, respectivement. Après 12 h, la viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide d'un kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8, Dojindo, Japon) en suivant les instructions du fabricant.

Procédure PDT/PTT

Les HSF ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à 4 × 10 ⁴ cellules/puits. Après 12 h, les milieux de culture, respectivement, contenant de l'ALA-ES, de l'Au-ES et de l'A/A-ES fraîchement préparés (14 %, v /v ), ont été remplacés par le milieu sans FBS pendant 6 h. Après traitement, HSF a été lavé avec du PBS et incubé dans un milieu de culture pendant 1 h. Ensuite, ils ont été irradiés par laser He-Ne (longueur d'onde 632 nm, 40 mW/cm ² , Shanghai Institute of Laser Technology, Chine) avec 20 min. Then, culture medium was replaced with fresh DMEM containing 10% FBS for another 24 h in preparation for subsequent experiments. Furthermore, HSF treated with A/A-ES and irradiation was prefixed, dehydrated, and embedded to prepare ultrasections for TEM examination.

Intracellular PpIX and ROS Generation Assay

Intracellular PpIX accumulation and ROS generation in HSF were detected by using confocal laser scanning microscopy (CLSM, Leica TCS SP5, Germany). The ROS generation assay was performed using a DCFH-DA and followed the manufacturer’s instructions. The coverslip with cells was mounted on a glass slide and observed at 405 nm excitation/635 nm emission for PpIX and 488 nm excitation/560 nm emission for ROS. All data was analyzed by LAS AF software.

Apoptosis and Necrosis Assay

The apoptosis and necrosis of HSF were analyzed by flow cytometry after double staining Annexin V-FITC and propidium iodide (PI) double staining. The samples were prepared according to the protocol of Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and then analyzed by BD FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, USA). The data analysis was performed with FlowJo 7.6 software.

Statistical Analysis

Data were presented as mean ± SD unless otherwise stated. Statistical significance was determined using a two-tailed student’s test (P  < 0.05) unless otherwise stated.

Abréviations

A/A-ES:

5-Aminolevulinic acid/Au nanoparticle-loaded ethosomal vesicle

ALA:

5-Aminolevulinic acid

ALA-ES:

ALA-loaded ES

ALA-PDT:

ALA-based PDT

Au-ES:

AuNP-loaded ES

AuNP :

Au nanoparticles

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

EE:

Entrapment efficiency

ES:

Ethosomal vesicles

FBS:

Fetal bovine serum

HS:

Hypertrophic scar

HSF:

Hypertrophic scar fibroblasts

ICP-MS:

Inductively coupled plasma-mass spectrometry

LSPR :

Résonance plasmonique de surface localisée

PDT:

Photodynamic therapy

PDT/PTT:

Photodynamic/photothermal therapy

PpIX:

Protoporphyrin IX

PTT:

Photothermal therapy

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TEM :

Microscope électronique à transmission